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著者らは、EPSRC(EP/L016346/1)、MRC、およびDoctor Training Alliance Biosciences for Healthに資金を提供し、支援してくれたことに感謝したい。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. 流体ゲル懸濁床の作製
<ol><li>2,000 mLのガラス瓶に1,000 mLの超純水(タイプ1、>18 mΩ·cm-1)に5 gのアガロース粉末を加えて、1,000 mLの分散アガロース(0.5% w/v)を調製します。</li>
	<li>水性混合物に70 mmのマグネチックスターラーバーを追加し、最初に完全に締めてから4分の1回転緩めてボトルキャップを固定します。</li>
	<li>ガラス瓶をオートクレーブのバスケットに入れ、蓋を閉め、121°Cおよび1バールで15分間サイクルを実行して、混合物を溶解および滅菌します。 注:このプロトコルは、以降の手順でオートクレーブソリューションに常に使用されます。</li>
	<li>オートクレーブが80°Cに冷却されたら、オートクレーブからボトルを取り出し、攪拌を800rpmに設定して、マグネチックスターラー(非加熱)に置きます。 注意: ボトルと液体は熱いままです。</li>
	<li>周囲条件下でゾルを冷却し、一定の攪拌を維持しながら、温度がそのTゲル(ゲル化点)よりも低くなるまで、32°C。</li>
	<li>スターラーからボトルを取り出し、4°Cで保管します。 注:液体ゲルは、必要になるまで保管できます。</li>
</ol>2.バイオインクの調製
<ol><li>超純水(タイプ1、>18 mΩ·cm-1)中の低アシルジェランガムの1%(w / w)ゾルを使用して、ゲランベースのバイオインクを調製します。<ol><li>0.5 gのジェランパウダーを計量ボートに計量します。</li>
		<li>100mLのガラス瓶に超純水49.5gを加え、マグネチックスターラーを加えます。</li>
		<li>ジェランパワーが入った計量ボートを半分に折り、絶えず攪拌しながらゆっくりと粉末を水に加えます。</li>
		<li>オートクレーブを使用してゾルを溶解および滅菌し、20°Cまで冷却します。</li>
		<li>バイオインクは、さらに使用するまで4°Cで保存してください。</li>
	</ol></li>
	<li>超純水(タイプ1、>18mΩ・cm-1)でペクチン-コラーゲン混合バイオインクを調製します。<ol><li>ペクチン粉末2.5gを計量ボートに計量して、ストックの5%(w / v)低メトキシペクチン溶液を調製します。</li>
		<li>100mLのガラス瓶に50mLの超純水を加え、マグネチックスターラーで入れます。</li>
		<li>ペクチンパワーが入った計量ボートを半分に折り、絶えず攪拌しながらゆっくりと粉末を水に加えます。</li>
		<li>水性混合物をオートクレーブし、20°Cに冷却する。</li>
		<li>3 mLのペクチン溶液を3 mLのコラーゲン溶液に加えるか、4 mLのペクチン溶液を2 mLのコラーゲン溶液に加えることにより、1:1および2:1のペクチン-コラーゲンブレンドを調製します。混合物を10回引き出して分注することにより、ピペットを使用してブレンドを穏やかに混合します。 注意: この手順は、コラーゲンの早期ゲル化を防ぐために、氷上で冷たい材料を使用して行うのが最適です。ペクチンとコラーゲンの予冷は、混合前に4°Cで保存することで達成できます。</li>
		<li>さらに使用するまで4°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>アルギン酸コラーゲン配合バイオインクを超純水(タイプ1、>18mΩ・cm-1)で調製します。<ol><li>アルギン酸塩粉末2 gを計量ボートに入れます。</li>
		<li>100mLのガラス瓶に50mLの超純水を加え、マグネチックスターラーで入れます。</li>
		<li>アルギン酸塩の力を含む計量ボートを半分に折り、絶えず攪拌しながらゆっくりと粉末を水に加えます。</li>
		<li>アルギン酸塩が完全に溶解するまで(透明でわずかに茶色の液体)、絶えず攪拌しながら分散液を60°Cに加熱し、次に20°Cに冷却する。</li>
		<li>25 mLのアルギン酸塩溶液を25 mLのDMEMに加えることにより、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)などの細胞培養培地でアルギン酸塩溶液を希釈します。</li>
		<li>3 mLのアルギン酸塩/DMEM溶液を3 mLのコラーゲン溶液に加えることにより、アルギン酸塩とコラーゲンのブレンド(1:1)を調製します。混合物を10回引き出して分注することにより、ピペットを使用してブレンドを穏やかに混合し、4°Cで保存します。 注意: この手順は、コラーゲンの早期ゲル化を防ぐために、氷上で冷たい材料を使用して行うのが最適です。ペクチンとコラーゲンの予冷は、混合前に4°Cで保存することで達成できます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. バイオインクのレオロジー特性評価
<ol><li>レオメーターをオンにし、40 mmの鋸歯状の形状を挿入し、30分間放置します。</li>
	<li>ゼロギャップ高さ関数を使用してレオメーターの ギャップ高さをゼロにします。</li>
	<li>底板に~2 mLのサンプルを追加し、上部形状を下げて1 mmのギャップ高さを作成します。</li>
	<li>プレート間から排出された余分な材料を除去して、サンプルをトリミングします。これを行うには、平らで非研磨性のエッジを使用して、余分な液体を隙間から引き離し、ティッシュペーパーで吸収します。 注意: 次の各ステップの前に、サンプルを変更するためにステップ3.2〜3.4が繰り返されます。</li>
	<li>バイオインクの注入性を決定するために 粘度測定プロファイル を実施します。<ol><li>ユーザーオプションから粘度測定テストを選択します。</li>
		<li>せん断速度制御ランプテストのパラメータを入力します: 0.1〜500 s-1、 ランプ時間は1分です。</li>
		<li>ステップ3.5.2のせん断速度制御ランプテストから決定された上下の応力を使用して、応力制御下の新しいサンプルに対して粘度測定ランプテストを繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>バイオインクのゲル化特性を決定するために 、小さな変形試験 を実施します。<ol><li>ユーザーオプションから振動テストを選択します。</li>
		<li>一定のひずみ下での単一の周波数テストへの入力パラメータ: 周波数1Hz、1時間にわたって0.5%のひずみ、インクがゲル化している間。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲル化したサンプルの振幅と周波数を その場 で測定します。<ol><li>ユーザーオプションから振動テストを選択します。</li>
		<li>振幅掃引を選択し、一定の1Hz周波数で0.01〜500%のひずみ制御された振幅掃引テストのパラメータを入力します。</li>
		<li>新しいサンプルをロードし、ユーザーオプションから振動テストを選択します。次に、周波数テストを選択し、0.01〜10Hzの間の周波数パラメータと、ステップ3.7.2で得られた振幅掃引データから決定されたスペクトルの線形粘弾性領域(LVR)内にあるひずみ(典型的にはLVRの50%〜80%の間の値)を入力する。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 3Dバイオプリンターを使用した3D構造の設計と印刷
<ol><li>CADソフトウェアを起動して、 CAD モデルの生成を開始します。<ol><li>ツールの選択 | CADソフトウェアの材料を使用して、選択したバイオインクの印刷パラメータを定義します。</li>
		<li>使用しているプリンターに関連する印刷パラメータを入力します。たとえば、3D Discoveryの場合、厚さタブに推定フィラメント直径(ほとんどのバイオインクでは~200-500 μm)を入力して、各層のZ厚さを決定します。 注:最終構成の層間剥離は厚さの値を増やす必要があることを示し、解像度の低下は厚さを減らす必要性を強調します。</li>
		<li>ソフトウェアのレイヤータブを使用して、 レイヤー ごとに目的の構造レイヤーを設計します。[グループ]タブを使用して画層を グループ化 し、[ レベル ]タブを使用して各画層をZ平面上の水準に割り当てます。<ol><li>たとえば、(ステップ2.3で調製したアルギン酸コラーゲン混合バイオインクを使用して)格子構造を生成するには、x軸に沿ってフィラメントを持つ1つの層を作成し、y軸に沿ってフィラメントを持つ2番目の層を作成します。両方を別の レベルに割り当てます。</li>
		</ol></li>
		<li>[ グループ ]タブで、構造内の繰り返し単位数を選択して、造形高さを決定します。</li>
		<li>生成ツールをクリックして、設計のGコードを作成し、構造の3Dレンダリングを表示します。</li>
	</ol></li>
	<li>BioCADを閉じ、3Dディスカバリーヒューマンマシンインターフェイス(HMI)ソフトウェアを起動して、印刷プロセスを開始します。<ol><li>製造元の指示に従ってプリントヘッドを組み立てます。マイクロバルブをプリントヘッドに取り付け、選択した押し出しノズルをねじ込みます。</li>
		<li>針の長さ測定機能をクリックして、プリントヘッドを調整します。</li>
		<li>培養容器(6ウェルプレートなど)を印刷プラットフォームにロードします。</li>
		<li>バイオインクを印刷カートリッジに分注し、マイクロバルブの上のプリントヘッドにねじ込みます。</li>
		<li>組み立てたプリントヘッドを空気圧システムに接続し 、HMIでプリントヘッド を選択して接続します。</li>
		<li>[圧力の確認]をクリックして、押し出し 圧力 を調整できるようにします。</li>
		<li>適切な圧力(希望の解像度に応じて~30-120 kPa )を選択したら、以前に生成された Gコード を開き、[ 実行 ]をクリックして印刷プロセスを開始します。</li>
	</ol></li>
</ol>5.皮膚類似体の調製
<ol><li>ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)および脂肪由来幹細胞(ADSC)を、ウシ胎児血清(FBS)(10%)、HEPESバッファー(2.5%)、およびペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を添加したDMEMでT75フラスコで、90%のコンフルエントに達するまで培養します。ヒト表皮角化細胞(HEK)をケラチノサイト増殖培地(KGM)中で70%〜80%のコンフルエントに達するまで培養する。培養中は、インキュベーター内ですべての細胞を37°C、5%CO2、および95%空気の条件下で保持します。</li>
	<li>皮膚および脂肪バイオインク用のHDFおよびADSCを調製するには、3 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をフラスコに穏やかにピペッティングして細胞を洗浄し、フラスコを傾けてPBSを細胞上で旋回させ、付着した細胞を乱さないように注意しながら吸引します。<ol><li>細胞を持ち上げるには、1x細胞解離酵素3 mLをフラスコにピペットで入れて細胞を覆い、フラスコをインキュベーターに3分間置き、フラスコを手のひらにしっかりと叩いて細胞を取り除きます。6mLの完全なDMEMを使用して酵素の作用を中和します。 注:タップ後も細胞が付着したままの場合は、さらに2分間インキュベートします。</li>
		<li>皮膚および脂肪バイオインクの調製には、細胞懸濁液を別々の15 mLチューブにピペットで入れ、血球計算盤を使用して細胞計数するためにそれぞれから10 μLを採取します。残りの細胞懸濁液を300 × g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。</li>
		<li>ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引し、適切なポリマー溶液(ステップ2.2で調製)を加え、次の密度でピペッティングして穏やかな刺激を使用して混合します。<ol><li>脂肪層には、コラーゲンとペクチンのブレンドを1:1あたり5×105 ADSCsmL-1でピペットします。</li>
			<li>乳頭層には、ピペット3×106 HDF mL-1 あたり2:1コラーゲンとペクチンブレンド。</li>
			<li>網状層には、コラーゲンとペクチンをブレンドしたコラーゲン1.5×106 HDF mL-1 をピペットでピペットします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>印刷するには、各バイオインクを別々のカートリッジに入れ、セクション4の指示に従って、ガラスペトリ皿の支持流体ゲルにコンストラクトを印刷します。<ol><li>印刷が完了したら、シリンジと針を使用して、コンストラクトの周りに2 mLの200 mM CaCl 2∙2H2 Oと3 mLの脂肪生成培地(500 μMイソブチルメチルキサンチン[IBMX]、50 μMインドメタシン、および1 μMデキサメタゾンを添加した完全なDMEM)を流体ゲルに注入します。インキュベーターに一晩入れます。</li>
		<li>翌日、スパチュラを用いてコンストラクトをサポートバスから取り出し、PBSで穏やかに洗浄し、6ウェルプレート中の脂肪生成培地中で14日間培養した。</li>
		<li>14日後、コンストラクトの表面に気液界面を形成するのに十分な培地を除去し、コンストラクトの上に2×10個の6個の ケラチノサイトを播種して表皮層を作成する。</li>
		<li>分析前にさらに1週間培養する。</li>
	</ol></li>
</ol>6. 頸動脈モデルの作製
<ol><li>ジェランガムバイオインク溶液(手順2.1で調製)をプリンターカートリッジに入れます。</li>
	<li>セクション4の印刷手順に従って、流体ゲルサポート材料を含むペトリ皿内の頸動脈モデルを印刷します。</li>
	<li>印刷が完了したら、シリンジと針を使用して、2 mLの200 mM CaCl 2∙2H2Oをコンストラクトの周りに注入します。</li>
	<li>最低3時間後、スパチュラを使用してサポートバスからコンストラクトを取り出し、PBSで静かに洗浄します。</li>
</ol>

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著者は宣言する利益相反はありません。

支持ベッドに使用される材料の選択の検討 開発段階では、支持ベッドに要求されるさまざまな特性がありました。これらの特性には以下が含まれます:i)押し出された材料を吊り下げるのに十分な構造を維持する。ii)プリントヘッドが支持材料内を自由に移動できるようにするせん断薄化能力。iii)急速な再構築(自己修復特性)、堆積したバイオインクの周囲に支持体を形成する。iv)室温および生理学的温度の両方で熱的に安定である。v)pHおよび電解質(イオン種および濃度)の範囲にわたって比較的生物学的不活性であり、細胞および荷電バイオインクとの相互作用を防止する中性(すなわち、非荷電)材料;vi)無毒;そして、vii)好ましくは非動物由来のもの。
これらの固有の特性のいくつかを維持する多くのバイオポリマー材料がありますが、これらの特性のすべてに適合せずに中断された3D積層造形を実行する能力を備えています11、26、27、ここでの意図は、他の支持材料に関連する特定の実際的な問題を克服する支持ベッドを製造することでした。アガロースの化学的性質、特に粒子状流体ゲルとして製剤化した場合、これらの特性のすべてを得ることができた。これにより、多種多様なバイオインク23、24、25、28で使用できる支持ベッドが可能になりました。実際、材料の生物学的不活性性は、培養全体を通して印刷された構造をその場で維持する可能性を提供し、生物学に変更を加えることなく、多くの異なるバイオインクが完全に発達するのに十分なタイムスケールを可能にしました。さらに、粒子状の薄化の性質により、最終的に印刷されたコンストラクトからの除去が容易になり、非毒性、非動物起源により、倫理的および規制要件に関連する障壁を克服して、臨床への迅速な翻訳が可能になります。
バイオインクの材料選択における考慮事項 直接押出バイオプリンティングでは、バイオインクは2Dプリントベッド上に堆積される。モノマーバイオインク溶液がせん断減粘挙動を有することは有益である。しかしながら、生理学的に関連する寸法を有する高忠実度構築物を作製するためには、それらは低いチキソトロピー性を有し、そしてそれらが堆積時に固体フィラメントを形成するように十分に高い粘度に回復しなければならない29、30、31。粘度が増加すると、押出に必要な圧力ははるかに高くなり、しばしばカプセル化された細胞の生存率に悪影響を及ぼします31,32。懸濁液バイオプリンティングは、押し出された材料が架橋全体にわたって懸濁浴によって支持されるので、この制限を除去する。この開発により、使用できるバイオインク製剤の範囲が大幅に拡大します。例えば、最近の研究は、心臓の内部構造に類似した非常に複雑な形状に印刷されている低濃度コラーゲン溶液の使用を示している33,34,35。この方法で言及されたアプリケーションでは、埋め込み印刷により、印刷能力ではなく、意図された生理学的環境を最もよく再現するように生体材料インクを選択することができました。
構造サイズの制限 バイオファブリケーションの文献全体を通して、代替のプリントヘッド技術によって駆動されるさまざまな種類のバイオプリンターが、組み込み製造技術に組み込まれ得ることが実証されている。ここで実証された技術も例外ではなく、Senierらが実証した空気圧マイクロ押出ベースのバイオプリンター(INKREDIBLE)や、制御可能なマイクロバルブを備えた押出ベースのバイオプリンター(3D Discovery)23などがあります。これにより、すでにバイオプリンターを所有している可能性のあるさまざまなユーザーがこの技術にアクセスできるようになりますが、構造の達成可能なサイズに対する制限は、最終的には問題のバイオプリンターの仕様に依存します。最初に、大きな構造の生成に関する主な制限は、プリントベッドのサイズ、X、Y、およびZ軌道の制限、および支持流体ゲルが含まれる容器のサイズによって定義されます。
解像度の制限 複雑なマイクロメートルサイズの構造を製造する場合、結果として得られる解像度は、プリンタの精度(ステップサイズ、押し出しの程度に対する制御)、印刷ノズルの内径、および印刷速度、印刷圧力、および流速を含む調整可能なソフトウェアパラメータの範囲に大きく依存します36。さらに、液滴サイズの制御は、高解像度構造の生成を促進するために重要であるように思われ、制御可能なマイクロバルブを備えた押出プリンターで最良の結果が得られます。最終的に、すべてのパラメータが最適化されると、マイクロメートルスケール37のオーダーで堆積フィラメントを使用して、押出ノズルの内径と一致するか、またはそれより小さくなるように印刷解像度を達成することができる。ただし、これは前述のすべての印刷パラメータの最適化に依存しており、解像度は印刷メカニズムと精度によって大幅に制限される可能性があります。たとえば、空気圧押し出しは、制御可能なマイクロバルブを使用した押し出しと同じ印刷解像度を可能にしていないようです。したがって、そのようなシステムはユーザーに大幅に増加する費用を負担するため、最大の印刷解像度を達成するには潜在的なコストへの影響があります。
今後の展望と可能性 現時点では、埋め込まれたセルを含む複雑なソフト構造の製造を可能にするために、中断された製造プロセスの使用に大きな関心があり、今後数年間で間違いなく大きな進歩があるでしょう。印刷解像度の向上は継続的に進歩していますが、生物学的システムの大部分が分子レベルで再配列できることを考えると、これがどれほど必要かはまだわかりません。メディアへの関心の焦点は、怪我や病気の後に人間の組織を直接置き換えるための3Dプリントされた組織の使用に関するものですが、これらのプロセスによって可能になる堅牢な医療処置は数年先にあります38,39。これらの複雑な培養システムの影響は、生物学的プロセスの理解を深めるために、薬物のスクリーニングやツールとして使用される可能性が高くなります38。特に、発生生物学は、分子の特殊な沈着を正確に制御することで、研究者が組織発生過程における多因子システムの役割を探求することを可能にするここで大きな利益を得る可能性があります。

ヒドロゲルは、細胞増殖の支持体として使用するのに最適な材料です1。使用される材料に応じて、それらは細胞の生存率を損なわない穏やかなメカニズムを介してゲル化します2,3。高い水分含有量(通常>90%)は、栄養素と酸素が材料に容易に拡散し、細胞代謝の老廃物が拡散することを意味します4。そのため、細胞生存率は1年を超える期間保存されることが示されており5、将来の治療用途のために細胞を保存または「一時停止」するためにヒドロゲルが使用されている例が現在あります6。それらは、組織様構造の製造のために組織工学において広く使用されてきたが、それらの使用は、材料の構造および組成の両方を制御することの困難さによって制限される傾向がある。歴史的に、ヒドロゲル強度は、構造を形成するポリマーマトリックスによって占められる高い含水量および低い体積のために、(多くの硬組織に関して)比較的低い。さらに、ゲル化への多くの経路(熱、電離、線状形成)は適度に遅い速度論を提供し、それらの機械的特性は時間とともに着実に発達する傾向があることを意味する。相互侵入ネットワークを除いて、機械的剛性が低く、硬化時間が遅いと、バイオインクは堆積時に自立できず、最初に押し出されたときに「スランプ」して鮮明さを失う傾向があります。
この重要な問題を克服するために、印刷中のサポートを提供する埋め込み印刷技術が開発されていますが、構造の機械的特性は開発されています7,8。ゲルの微細構造が完全に発達し、機械的特性が最適に達したら、通常は穏やかな洗浄または支持相の溶融によって支持マトリックスを除去することができる。このアプローチに関する最初の作業では、二次相が分布した粘性多孔性分散体を利用した9。より最近では、Bhattacharjeeらは、細胞の配列が支持ゲル10中に懸濁され得ることを実証するために、顆粒化カルボポールの形態のゲルを使用した。続いて、Hintonらは、細胞を含有するゲルベースの材料を、顆粒ゼラチン11から形成されたミクロゲル懸濁液からなる支持床に押し出すことについて報告した。細胞含有ヒドロゲルの押出しおよびその後の硬化後、支持体浴の穏やかな加熱によってゼラチンを除去し、ゼラチンの溶融を可能にした。残念ながら、このプロセスにはまだいくつかの制限があります。例えば、コラーゲンと比較したゼラチンの化学構造(その結果、コラーゲンの加水分解形態である)は、その骨格を横切る多くの化学的部分が生物学的実体と相互作用することができるようなものである。したがって、残留支持マトリックスは下流の生物学的プロセスを妨害する可能性があります。さらに、動物由来の製品は、技術の翻訳可能性に目を向けるときに制限的な使用をもたらします。これは、製造された部品が臨床的に使用されることを意図している場合、またはこの表面汚染が重大な問題を引き起こす可能性のある基本的な生物学的質問に答えるために使用される場合でも、課題を生み出します。
その後、生理学的条件下で電荷を持たず、動物以外の材料から形成される支持マトリックス内のヒドロゲルの中断された製造を可能にする洗練されたプロセスを作成しました。このプロセスはさまざまな生体高分子担体で使用できますが、アガロースは糖ベースであり、生理的pH12,13で中性に帯電しているため、生物学的相互作用に対して不活性な材料を提供します。既存のゲルを断片化するのではなく、ゲル化中のせん断の適用によって担体材料が形成される14、15、16。これにより、その表面に樹状の特徴を示し、ゲル化されていないポリマーの二次マトリックス中に分散される粒子のマトリックスが生成されます17,18。その結果、興味深い材料特性を持つ材料19、20、21、22が得られ、以前に報告された粒状ゲルと同様の方法でせん断薄くすることができますが、せん断が除去されると粘度がより急速に回復する傾向があります23。支持マトリックスに押し出された細胞含有材料が完全に成熟したら、培養に入れる前に穏やかな攪拌によって支持マトリックスを除去することができます。このプロセスを使用して、複雑な構造を有する材料を製造し、皮膚および骨軟骨領域の両方の生物学的構造を再現することが可能であることが示されている23、24、25。この方法の論文では、支持材料の製造方法を詳細に説明し、さまざまな複雑な構造内で使用される適切なバイオインクを強調しています。

<table><tbody><tr><td>3Dディスカバリーバイオプリンター</td><td>RegenHU</td><td>BIOFACTORY</td><td>マイクロバルブ押出バイオプリンター</td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>メルク</td><td>9012-36-6</td><td>流体ゲルサポートバスを作成するために使用される材料&nbsp;</td></tr><tr><td>卓上オートクレーブ</td><td>プレステージ メディカル</td><td>B8L75814</td><td>クラシック</td></tr><tr><td>ブリリアント ブルー G</td><td>メルク</td><td>6104-58-1</td><td>構造物の染色に使用される染料&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td>メル<td>ク&nbsp;</td><td>10035-04-8</td><td>印刷された構造物を網状にするために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>メルク&nbsp;</td><td>D4902-25MG</td><td>脂肪形成培地に使用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>メルク</td><td>D6429</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>デュラン&nbsp; ボトル&nbsp;</td><td>メルク</td><td>Z305219</td><td>ガラス瓶&nbsp;</td></tr><tr><td>EVOS XLコアイメージングシステムEVOS</td><td>&trade;</td><td>AMEX1000</td><td>位相差付き明視野顕微鏡</td></tr><tr><td>FBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10500-064</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>ジェランガム</td><td>特殊成分</td><td>5060341112638</td><td>低アシルゲランガム コロチッド動脈モデル</td></tr><tr><td>HEPESバッファー</td><td>メルク</td><td>H9897-10PAK</td><td>細胞培養培地用バッファー</td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>メルク</td><td>I7378</td><td>脂肪形成培地に使用</td></tr><tr><td>イソブチル-メチルキサンチン (IBMX)</td><td>メルク</td><td>I7018-100MG</td><td>脂肪形成培地に使用</td></tr><tr><td>ケラチノサイト増殖培地</td><td>ロンザ</td><td>00192060</td><td>ケラチノサイトを培養するための培地として使用</td></tr><tr><td>低メトキシペクチン</td><td>CP ケルコ</td><td>LM-5CS</td><td>ペクチン/コラーゲンブレンドの製造に使用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>メルク</td><td>P4333-100ML</td><td>細菌の増殖を抑制するために使用される</td></tr><tr><td>PureCol EZ ゲル溶液</td><td>メルク</td><td>5074</td><td>アルギン酸/コラーゲンブレンドの製造に使用されるコラーゲン溶液</td></tr><tr>アル<td>ギン酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>9005-38-3</td><td>アルギン酸/コラーゲンブレンドの製造に使用されるアルギン酸粉末&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLEセレクト&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12563011</td><td>細胞解離酵素</td></tr><tr><td>T75フラスコStarLab</td><td></td><td>CC7682-4175</td>細胞<td>の培養に使用</td></tr></tbody></table>

懸濁3dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

バイオプリンティングプロセス中に部品を支持するための粒状マトリックスの使用は、2015年にBhattacharjeeらによって最初に報告され、それ以来、3Dバイオプリンティングにおける支持ゲルベッドの調製および使用のためのいくつかのアプローチが開発されてきた。この論文では、アガロース(流体ゲルとして知られている)を使用してミクロゲル懸濁液を製造するプロセスについて説明し、粒子形成はゲル化中のせん断の適用によって制御されます。このような処理により、慎重に定義された微細構造が生成され、その後の材料特性により、化学的および機械的に印刷媒体を埋め込むという明確な利点があります。これらには、ゼロせん断での粘弾性固体様材料としての動作、長距離拡散の制限、および凝集システムの特徴的なせん断減粘挙動の実証が含まれます。 
しかし、せん断応力を除去すると、流体ゲルは弾性特性を迅速に回復する能力を有する。このヒステリシスの欠如は、以前にほのめかされた定義された微細構造に直接関連しています。処理のため、粒子界面の反応性の非ゲル化ポリマー鎖は、ベルクロ効果と同様に粒子間相互作用を促進します。この弾性特性の迅速な回復により、サポートベッドの急速な改質がバイオインクをその 場でトラップし、その形状を維持するため、低粘度の生体材料から高解像度の部品をバイオプリンティングすることができます。さらに、アガロース流体ゲルの利点は、不斉ゲル化/融解転移(ゲル化温度~30°Cおよび融解温度 ~90°C)です。このアガロースの熱ヒステリシスにより、支持流体ゲルを溶融させることなく、バイオプリント部分を その場で 印刷および培養することができます。このプロトコルは、アガロース流体ゲルの製造方法を示し、懸濁層積層造形(SLAM)内のさまざまな複雑なヒドロゲル部品の製造をサポートするためのアガロース流体ゲルの使用を示します。

アルギン酸塩およびI型コラーゲンバイオインク 印刷解像度(フィラメント直径の関数として記録)は、押し出し圧力の変化によって直接調整可能であることが観察されました(図1A-C)。押し出し圧力と印刷解像度は、30 kPaの押し出し圧力での印刷によって生成される最小フィラメント直径に直接関係していました。興味深いことに、押出圧力30kPaでは、押出ノズルの内径に合致したフィラメント(平均フィラメント径:323μm±50μm、ノズル径:300μm)が生成でき、「最大分解能」を達成できることが示唆された。さらに、この分解能の印刷パラメータは、抽出および灌流可能なアルギン酸塩/コラーゲン血管管の生成にうまく適用できます(図1D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig01.jpg"> 図1:SLAMを使用した高解像度プリントの生成。アルギン酸塩/コラーゲン格子の印刷解像度を、(A)30 kPa、(B)60 kPa、および(C)120 kPaでの押出成形によるフィラメント直径の関数として調整します。(D)アルギン酸塩/コラーゲン血管管の生成。スケールバー = 400 μm (A-C)、10 mm (D)。略語: SLAM = 懸濁層積層造形。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
スキンアナログ SLAMは、コラーゲンIとペクチンのブレンドから形成されたバイオインクを使用して、皮膚のような構造を作成するためにも使用されました(図2A)。皮膚に見られるものと同様の機械的特性の勾配を達成するために、皮膚(5mg∙mL−1 コラーゲンストックと2:1で混合された5%w/wペクチン)および皮下層(5mg∙mL−1 コラーゲンストックと1:1で混合された5%w/wペクチン)層で異なる割合のペクチンとコラーゲンを使用しました。得られた構造(図2Bi-Bii)は、DMEMに浸漬した後も十分に統合され、層間剥離の兆候はありませんでした。重要なことに、14日間の培養期間の後、構造全体にわたって高レベルの細胞生存率がありました(図2Biii)。興味深いことに、培養期間にわたって、材料は24硬化し、材料の改造を示している。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig02.jpg"> 図2:皮膚様構造体の作製 。 (A)SLAMプロセスを使用して、ヒト皮膚線維芽細胞を埋め込んだ層状構造を生成する方法を示す概略図。ここでの懸濁床はアガロースから形成された粒子から製造され、皮下層と真皮層はペクチンとコラーゲンIのさまざまな比率で形成されました。 (B)層状構造は、皮膚の三層構造を表すものを意図した(i)。この構造の複製に成功すると(ii)、カルセイン-AM染色(iii)によって示されるように、サンプル全体で高レベルの細胞生存率が認められました。スケールバー= 5ミリメートル(ビイ)。略語: SLAM = 懸濁層積層造形。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
頸動脈 この方法の限界を押し広げるために、より複雑なプリントの選択が作成されました。そのような例の1つにおいて、二股に分かれた頸動脈を1%ジェランバイオインクを用いて印刷し(図3A)、次いでこれを流体ゲルベッド内で200mM CaCl2を押し出して架橋し(図3B)、ゲル化後に支持体から単純に持ち上げた(図3C)。低粘度を示す前駆体印刷ソリューションにもかかわらず、支持ベッドは複雑な形状の製造を可能にすることに成功しました。動脈は、沈着、架橋、および抽出の間もその構造を保持し(図3)、追加の足場を組み込むために印刷コードを変更する必要はありませんでした。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig03.jpg"> 図3:SLAMを用いたジェラン頸動脈の作製プロセス 。 (A)印刷中の流体ゲルベッド内でのジェランの押し出し、(B)架橋中の流体ゲル内の頸動脈印刷の完了、および(C)流体ゲル支持体からの回収後の最終的な頸動脈モデル。スケールバー= 10 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ヒドロゲル形成中のせん断処理は、剪断薄いが剪断力の除去後に急速に再構築するミクロゲル懸濁液の生成をもたらす。このような材料は、バイオプリンティング複合体、細胞を含んだ構造のための支持マトリックスとして使用されてきた。ここでは、支持床および適合バイオインクを製造するために使用される方法が説明される。

懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

異なるバイオインクを使用する能力は、バイオプリント構造の開発を成功させるために最も重要であり、この技術は、従来の印刷技術と一般的に互換性のない材料の使用を容易にする。懸濁媒体は、堆積時に低粘度のバイオインクの崩壊を防ぎ、単一の構築物内に異なるバイオインクを統合して、天然組織により類似した化学的および機械的特性の地域的変動を作り出すことを可能にします。手順を実演するのは、バーミンガム大学の研究員であるトム・ロバートソン博士と、ハダースフィールド大学の研究員であるジェシカ・シニア博士です。まず、レオメーターをオンにし、40ミリメートルの鋸歯状の形状を挿入して、30分間放置します。ゼロギャップ高さ関数を使用してレオメーターのギャップ高さをゼロにします。底板に約2ミリリットルのサンプルを追加し、上部のジオメトリを下げて1ミリメートルのギャップ高さを作成します。平らな非研磨性のエッジを使用してプレート間から排出された余分な材料を取り除き、余分な液体をギャップから引き離し、ティッシュペーパーで吸収することにより、サンプルをトリミングします。バイオインクの注入性を判断するには、ユーザーオプションから粘度測定テストを選択して粘度プロファイルを実施します。せん断速度制御ランプテストのパラメータを1分のランプ時間で毎秒0.1〜500で入力します。新しいサンプルをロードし、再現性を確保するためにプロセスを繰り返します。バイオインクのゲル化特性を決定するために、ユーザーオプションから振動試験を選択して小さな変形試験を実施した。一定のひずみ下での1回の周波数テストにパラメータを入力し、1ヘルツの周波数として、インクがゲル化している間に1時間にわたって0.5%のひずみ。前に示したステップのせん断速度制御ランプテストから決定された上下の応力を使用して、応力制御下の新しいサンプルに対して粘度測定ランプテストを繰り返します。ゲル化したサンプルのin situ振幅および周波数測定を実行するには、ユーザーオプションから振動試験を選択します。振幅掃引を選択した後、一定の1ヘルツ周波数で0.01〜500%にひずみ制御される振幅掃引試験のパラメータを入力します。テストが完了したら、スペクトルを分析して線形粘弾性領域を決定します。レオメーターに新しいサンプルをロードし、ゲル化させます。次に、ユーザーオプションから振動テストを選択します。0.01〜10ヘルツの周波数テストと入力周波数パラメータを選択し、以前に取得した振幅掃引データから決定されたスペクトルの線形粘弾性領域内のひずみを選択します。CADソフトウェアを起動し、CADモデルの生成を開始するには、[ツール]オプションを選択し、CADソフトウェアの[材料]をクリックして、選択したバイオインクの印刷パラメータを定義します。[厚さ]タブに推定フィラメント直径を入力して、各層のz厚さを決定します。レイヤーごとに構造レイヤーを設計するには、ソフトウェアの[レイヤー]タブを使用し、[グループ]タブを使用してレイヤーをグループ化し、[レベル]タブを使用して各レイヤーをz平面上のレベルに割り当てます。X 軸に沿ってフィラメントを持つ 1 つのレイヤーと Y 軸に沿って 2 番目のレイヤーを作成して格子構造を生成し、両方を別のレベルに割り当てます。[グループ]タブで、構造内の繰り返し単位数を選択して、造形高さを決定します。次に、[生成]ツールをクリックして、デザインのGコードを作成し、構造の3Dレンダリングを表示します。バイオプリンターで、バイオインクを印刷カートリッジに分注し、マイクロバルブの上のプリントヘッドにねじ込みます。次に、針の長さ測定機能をクリックして、プリントヘッドを調整します。次に、組み立てたプリントヘッドを空気圧システムに接続し、培養容器をプリントプラットフォームにロードします。適切な圧力を選択したら、前に生成されたGコードを開き、[実行]をクリックして印刷プロセスを開始します。頸動脈の印刷が完了したら、注射器と針を使用して、構築物の周りに2ミリリットルの200ミリモル塩化カルシウム二水和物を注入します。最低3時間後、コンストラクトの周囲から流体ゲルサポートベッドを取り外し、PBSで静かに洗浄します。次に、スパチュラを使用してサポートバスからコンストラクトを取り外します。アルギン酸塩およびコラーゲン格子の印刷解像度を、30、60、および120キロパスカルの押出成形によるフィラメント直径の関数として調整することが観察され、結果は、解像度が押出圧力の変化に直接調整可能であることを示しました。皮膚に見られるものと同様の機械的特性の勾配を達成するために、真皮層と皮下層に異なる割合のペクチンとコラーゲンが使用され、層間剥離の兆候のない構造が得られました。材料が硬化した14日間の培養後、構造全体に高レベルの細胞生存率が観察され、材料のリモデリングを示しました。レオロジーでは、再現性のあるデータを確保するためにサンプルが正しくロードされることが重要であり、バイオプリンティングでは、サポートベッドから取り出す前に構造が完全に架橋されていることが重要です。大規模な組織構築物を長期間培養することで、物理的および化学的刺激に対する埋め込まれた細胞の応答を調べることができます。

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ここでは、封入細胞の沈沈を防ぐために、液体状バイオインク(低粘度のゼラチンメタクリロイル)に対する新しい多層改変戦略を開発しました。...

均質な細胞分布のための三次元バイオプリンティングにおける多層ヒドロゲルバイオインクの使用

ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。...

ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

この記事では、マイクロ流体デバイスを使用したハイスループットゼラチンメタクリロイルミクロゲル製造、ミクロゲルの再懸濁可能な粉末(マイクロエアロゲル)への変換、粒状ヒドロゲル足場を形成するためのミクロゲルの化学集合、および3Dバイオプリンティング用のマイクロ多孔性が保存された粒状ヒドロゲルバイオインクの開発のプロトコルについて説明します。...

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

この研究では、自己修復アニーリング可能な粒子-細胞外マトリックス複合材料内の神経幹細胞の自由形状埋め込み3D印刷のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、相互接続されたヒト神経組織構築物のプログラム可能なパターニングを高い忠実度で可能にします。...

ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

本稿では、フォトチューナブルハイドロゲルを3Dバイオプリントして、細胞外マトリックスの硬化と線維芽細胞の活性化を研究する方法について説明します。...

線維芽細胞の活性化を研究するための3Dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

学ぼう　せん断処理によるアガロース流体ゲルの形成法と、レオメトリー・CADモデリングを用いた3Dバイオプリンティングの手法。この技術は細胞封入構造物の機械的特性と生存率を評価するのに役立つ。

懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

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