デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量

dd-PCRは、標的DNAまたはRNAの絶対定量のための高感度で正確な方法です。これは、他の従来の方法では正確な結果が得られない病気の診断に使用されてきました。dd-PCRは、非常に少ない存在量の核酸分子を検出するための最も感度の高い技術です。

定量的PCRとは異なり、dd-PCRは定量のためにハウスキーピング遺伝子制御を必要としません。dd-PCRは、その感度と精度により、マイクロRNAや環状RNAなどの低存在量のRNA分子を含む分子診断および研究のツールとして使用できます。dd-PCRを使用する前に、RT-PCRまたはRT-qPCRを実行して、プライマーが非特異的PCR増幅なしで標的遺伝子を増幅していることを確認する必要があります。

まず、環状RNA配列長の最後の100ヌクレオチドを環状RNA配列の最初の100ヌクレオチドに結合することにより、長さ200ヌクレオチドのPCRテンプレート配列を調製する。プライマー3ウェブツールで設計されたプライマーのテンプレート配列を使用します。RNA単離のために、約500万個の増殖C2C12筋芽細胞と4日間分化したC2C12筋管を含む10センチメートルの皿1つを取ります。

10ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄し、ピペットを使用してPBSを廃棄します。1ミリリットルのRNA単離試薬を加え、激しいピペッティングで細胞を溶解します。次に、200マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを15秒間加えます。

チューブを摂氏4度で12, 000 Gで10分間遠心分離し、400マイクロリットルの上水層を取り、シリカカラムにロードし、室温で12, 000 Gで1分間遠心分離します。流れを新しいチューブに通し、600マイクロリットルの100%エタノールを加えます。20マイクロリットルの磁性シリカビーズを加え、チューブを25°C、1, 200 RPMに設定したサーモミキサーに5分間置きます。

次に、チューブを磁気スタンドに30秒間、または溶液が透明になるまで置きます。磁性シリカビーズを90%エタノールを含む500マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。チューブを磁気スタンドに30秒間置いた後、ビーズを磁石に向かって沈降させ、ピペットを使用してバッファーを廃棄します。

チューブを摂氏50度でサーモミキサーで3分間風乾し、蓋を開けたままにします。20マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、ビーズを再懸濁します。溶解したRNAを新しいチューブに集め、分光光度計を使用して量と質を評価します。

分光光度計を使用してRNA濃度を測定し、cDNA合成のために1マイクログラムのRNAを採取します。1マイクログラムの総RNAを1マイクロリットルのdNTPミックス、4マイクロリットルの5X逆転写酵素バッファー、2マイクロリットルの10X逆転写酵素ランダムプライマー、0.25マイクロリットルの逆転写酵素、および0.5マイクロリットルのRNase阻害剤と混合します。ヌクレアーゼを含まない水を使用して容量を20マイクロリットルに補います。

チューブを摂氏25度で10分間置き、続いて摂氏50度で1時間置きます。次に、チューブを摂氏85度で5分間置き、酵素を不活性化します。0.2ミリリットルのPCRチューブまたはストリップに22マイクロリットルのPCR反応を、ネガティブコントロールチューブおよび非テンプレートコントロールチューブとともにセットアップします。

11マイクロリットルのdd-PCRマスターミックス、5.5マイクロリットルの1マイクロモル濃度の環状RNA特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーミックス、および5.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて、NTC反応チューブをセットアップします。同様に、テスト反応チューブをセットアップするには、11マイクロリットルのdd-PCRマスターミックス、5.5マイクロリットルの1マイクロモル濃度の環状RNA特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーミックス、および5.5マイクロリットルのcDNAを追加します。液滴を生成するには、20マイクロリットルのPCR混合物を0.2ミリリットルのPCRチューブから液滴発生カートリッジのサンプルウェルに移します。

液滴発生油70マイクロリットルを液滴発生カートリッジの油井にピペットで慎重に加えます。液滴発生器カートリッジをゴム製ガスケットで覆い、液滴発生機に入れて、カートリッジの液滴ウェルで生成されたサンプル油滴混合物を取得します。PCR増幅のために、ピペットを使用して、液滴発生器カートリッジの液滴ウェルから96ウェルPCRプレートに40マイクロリットルのサンプル油滴混合物を移します。

96ウェルPCRプレートをアルミホイルシーラーで密封します。摂氏180度に予熱したプレートシーラーマシンブロックに入れ、PCRプレートをシールするためにシールをクリックします。次に、プレートをdd-PCRサーマルサイクラーに入れ、蓋の温度を摂氏105度に設定し、ランプレートを毎秒摂氏2度に設定します。

PCRが終了したら、プレートホルダーを正しい位置にしてプレートをdd-PCRドロップレットカウンターマシンに置きます。液滴分析ソフトウェアを開き、サンプル情報を入力してランを設定します。分析ボタンをクリックして、液滴読み取り完了後にデータを分析します。

次に、[1D Amplitude]ボタンをクリックして、正と負の液滴を確認します。陽性の液滴を負の液滴から分離するには、同じターゲットを持つすべてのサンプルに共通のしきい値線を配置します。エクスポートボタンをクリックして、環状RNAカウントデータをcsvファイルとしてエクスポートします。

エクスポートされたデータは、各サンプルに存在する環状RNAの数を示しています。各反応で使用されるcDNAの総量を考慮して、RNAナノグラムあたりの各サンプル中の環状RNAの数を手動で計算します。ここでは、QuantaSoftソフトウェアを使用したデータ分析を示します。

MT1を除くすべてのサンプルは、12, 000を超える液滴数を示しました。MT1では総液滴数が少なかったため、このサンプルは最終的なデータ分析には考慮されませんでした。興味深いことに、筋芽細胞と比較して、4日間分化した筋管状態でCirc BとC2の発現パターンに明らかな違いがありました。

コピー数の観点からCirc BとC2の存在量を分析したところ、C2C12筋芽細胞の3つの反復はRNAナノグラムあたり76.8、67、および46コピーであり、2つの筋管サンプルはRNAナノグラムあたり558および610コピーであったことが示されました。棒グラフのデータは、2〜3回の生物学的反復の平均プラスマイナス標準偏差を表します。ddPCRは、標的環状RNAの正確な発現差を測定するための最も先進的な方法の1つです。

この方法は、来年の環状RNA研究および診断産業を加速するために不可欠なツールとなるでしょう。