アルテミアサリナLを用いた致死性バイオアッセイ。

このプロトコルは、さまざまな天然または合成ソースからの抽出物、画分、化合物など、さまざまな種類のサンプルの予備的な一般的な毒性評価に非常に便利なツールです。私たちのプロトコルの主な利点は、非常に簡単で安価であり、同時に多くのサンプルで使用できることです。さらに、手作りの機器は現場の信頼性を向上させます。

この技術段階では、スクリーニングを行い、予備的な一般的な毒性プロファイルに基づいてサンプルを選択し、拡張細胞株やin-vivoテストなどのさらに特定のテストを受けます。この方法は、主に医薬品およびその他の製品化学分野でバイオティックサンプルをスクリーニングするために利用されています。私たちのプロトコルは、ナノシステムなどの他の種類のサンプルにも使用できます。

初めて実行している間、これには細かい観察スキルと報告されたすべてのパラメータに多くの注意を払う必要があるため、辛抱強く待ってください マルシア・フィリペとヴェラ・イスカ、私たちの研究室の博士課程の学生は、この手順を実証するのに役立ちます。漏斗状の容器を黒いサポートに置き、漏斗を適切な方向に回してレベルマークとタップを確認することから始めます。手作りの移行装置を作るために、12センチメートルの最終的な高さを得るために2つの0.5リットルのペットボトルの上部をカットします。

各ボトルの片側に直径1.5センチ、底から7センチの穴を開け、2つの開口部の間に13センチのゴムチューブを挿入します。ホットグルーで開口部を密閉し、15分間乾燥させます。ボトルを平らな面に置き、水を入れて漏れがないことを確認します。

水道水800ミリリットルに28グラムの塩を加えて、人工塩溶液、または1リットルあたり35グラムの濃度の塩水エビ塩を調製します。すべての塩が完全に溶解するまで攪拌棒で混ぜます。サンプルを調製するには、適量の各抽出物および化合物ジメチルスルホキシド(DMSO)を1ミリリットル当たり10ミリグラムの最終濃度で溶解する。

次に、990マイクロリットルの人工生理食塩水を使用して、新しいマイクロ遠心チューブで各サンプル10マイクロリットルを希釈し、ミリリットルあたり0.1ミリグラムの最終濃度を得ました。三角フラスコのヒュームフードの下で、1ミリリットルあたり1ミリグラムの濃度の蒸留水中の重クロム酸カリウムの溶液を調製します。孵化容器に500ミリリットルのマークまでの培地を満たし、スプーン1杯、または約0.5グラムの塩水エビ嚢胞を塩溶液に加えます。

コンテナを閉じます。ランプを装置に直接向け、電源を入れます。エアサプライヤーシステムを機器の上部に配置されたコネクタに取り付け、ポンプをオンにします。

ブラインシュリンプシストは、激しい曝気、連続照明、および安定した温度下で人工塩溶液中で孵化する。24〜48時間後、卵が孵化したら、エアポンプをオフにして、ノープリウスが空の卵ケースから分離されるまで待ちます。孵化していない卵を生きているノープリウスから分離するには、底の出口タップを開き、手作りの移行装置コンテナのコンテナの1つに漏斗の内容物を排出します。

ノープリウスと残りの孵化していない卵を含む溶液がチューブレベルより下にあることを確認してください。装置をインキュベーターに4時間置き、次に2番目の容器にチューブの高さより上の残留塩溶液を加えます。アルミホイルを使用して容器をノープリウスと残りの孵化していない卵で覆い、塩溶液だけで2番目の容器にランプを置きます。

ブラインシュリンプは光に引き付けられ、ある容器から別の容器に移動し、卵と生きているアルテミアを効率的に分離します。収穫容器から、10〜15個のノープリウスを含む900マイクロリットルの生理食塩水を収集し、24ウェルプレートの1ウェルに溶液を入れます。すべてのサンプルは4倍でテストされます。

各ネガティブコントロールを100マイクロリットル追加します。ポジティブコントロール、人工塩溶液、および各サンプルをウェルに、照明下でプレートを24時間インキュベートした。24時間後、各ウェルの死んだ幼虫の数を12倍の倍率で双眼顕微鏡で記録します。

100マイクロリットルの重クロム酸カリウム溶液を加えて、残りの生きている幼虫の死を誘発し、6時間待ちます。顕微鏡下で各ウェルの死んだ幼虫の総数を数え、画面に表示されている式に従って死亡率を決定します。すべての検定を三重に実行し、標準偏差を計算します。

最後に、結果を、それぞれ内部四重奏プラス標準偏差を持つ3つの独立した実験の平均として表します。プレクトランサス種から抽出され、半合成によって得られた選択された化合物の構造をこの図に示します。顕微鏡で見たアルテミアサリナの新しく孵化したノープリウスがこの画像に示されています。

このグラフィック画像は、プレクトランサス種の4つのメタノール抽出物に24時間曝露した後のアルテミアサリナの死亡率を0.1ミリリットルあたり0.1ミリグラムで表しています。全ての抽出物は、このアッセイを用いた一般的な毒性の点で許容できた。ここで塩は塩溶液またはブランクに相当する。

重クロム酸カリウムをポジティブコントロールとして使用し、DMSOをネガティブコントロールとして使用しました。テストされたすべての抽出物は、ブランクおよびネガティブコントロールに登録されているものに匹敵する死亡率の非常に低い値で非常に有望な結果を示しました。この図には、1ミリリットルあたり0.1ミリグラムの5つの純粋な化合物に24時間曝露した後のアルテミアサリナの死亡率が示されています。

このデータから、このアッセイを使用して最小限の毒性を示すのは5つだけであることは明らかです 特に、孵化、移動、収集の3つのステップを覚えておく必要があります。その結果、他のエビが分離され、使用する番号が付けられます。予備部位は、細胞培養またはゼブラフィッシュのような他の部位と比較して、単純で低コストのモデルチャネル毒性である。

さらに、より高価な細胞毒性部位を利用することができる。