抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語)

抗体依存性細胞傷害性、略してADCCは、NK細胞、顆粒球、マクロファージと呼ばれるナチュラルキラー細胞によって媒介されます。これらはADCCのエフェクターセルです。上皮成長因子受容体HER2を標的とするトラスツズマブなどの抗体が腫瘍細胞に結合すると、これらのエフェクター細胞はFcyR受容体を使用して抗体の定常FC領域に結合します。

この抗体は、腫瘍細胞とFcyR受容体担持エフェクター細胞を橋渡しし、それらの細胞傷害性顆粒の放出を引き起こします。これは癌細胞のアポトーシスをもたらす。ADCCは、トラスツズマブの抗増殖効果に反応しない腫瘍に対して有効である可能性がある。

ADCCシステムをセットアップするには、抗HER2抗体トラスツズマブの存在下で、抗HER2陽性JIMT-1乳癌細胞をNK-92細胞株と共培養する必要があります。本アッセイに用いたJIMT-1細胞株は、緑色蛍光タンパク質を安定に発現しています。まず、96ウェルハイコンテントスクリーニングプレートをJIMT培地でコードします。

50マイクロリットルの培地をプレートの各ウェルにピペットで入れる。プレートをCO2インキュベーターに1時間入れます。JIMT-1細胞をプレートのガラス表面に付着させるためには、コーティングが重要です。

コーティング工程中に、JIMT-1細胞をトリプシン化する。2ミリリットルの滅菌PBSで細胞を洗浄します。次に、1ミリリットルのトリプシン-EDTAをフラスコに加えます。

フラスコをCO2インキュベーターに10分間戻します。インキュベーション後、フラスコをタップしてJIMT-1細胞が剥離したかどうかを確認します。2ミリリットルのJIMT-1培地で消化を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに回収します。

次いで、JIMT-1細胞を青色キャストチャンバー内でトリパンブルーで計数する。細胞数を133, 000細胞/mlに調整します。コーティング培地を吸引し、次いで75マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加える。

CO2インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベーションしている間、細胞が付着するのを待ちます。翌日、培地を吸引し、50マイクロリットルの新鮮なJIMT-1培地をウェルに加え、プレートをハイスループットスクリーニングラボに移します。このロボットは、試験化合物をハイコンテントスクリーニングマイクロプレートに移すために使用されます。

ロボットアームを使用して、ロボットは25ナノリットルを転送するように校正されたピンツールユニットをつかみます。合計100ナノリットルの試験化合物を化合物ライブラリープレートからアッセイプレートに4段階で移します。試験化合物の最終濃度が20マイクロモルであることを確認してください。

各ステップの間に、最初にピンツールを50%DMSOで洗浄し、次に70%エタノールで洗浄します。プレートを摂氏37度のCO2インキュベーターで1時間インキュベートします。T25組織培養フラスコでNK細胞を培養する。

JIMT-1細胞の薬物処理が進行中の間、T25フラスコから15ミリリットルの遠沈管にNK細胞を回収します。NK-92細胞をトリパンブルーでブルーカウントチャンバーでカウントします。細胞数をmlあたり400, 000細胞に調整します。

1mlあたり400, 000細胞を含むNK細胞懸濁液の量を150gで室温で3分間遠心分離する。JIMT-1培地に抗HER2抗体トラスツズマブを1mlあたり20マイクログラム添加してADCC培地を調製する。20, 000 NK細胞を50マイクロリットルADCC培地でピペットで、JIMT-1 GFP細胞を標的とする。

最終容量は100マイクロリットルであり、最終トラスツズマブ濃度は1mlあたり10マイクログラムである。アッセイプレートを、摂氏37度に設定されたインキュベーターを内蔵したハイコンテント分析装置に入れます。プレートは2つの時点で画像化されます。

まず、標的細胞にエフェクター細胞を添加した直後に画像を取得し、2番目の画像セットはNK細胞を添加してから3時間後に撮影します。まず、マイクロプレートの種類を選択します。96ウェルのハイコンテントスクリーニングプレートを使用してください。

焦点を選ぶには、非共焦点モードで10倍の対物レンズを備えたプレートでアッセイを行うため、焦点を選択します。ビニングを2つ選択して、信号対雑音比を2倍にします。適切なチャンネル、露光時間、レーザー出力、焦点面、波長を選択します。

650-760ナノメートルの明視野画像を撮影し、488ナノメートルの励起と500-550ナノメートルの発光波長を持つEGFP形質導入JIMT-1細胞を検出します。測定を開始する前に、スナップショット機能でサンプル画像を撮影し、正しい設定を確認してください。最後に、イメージングのフィールド数と時間ポイント数を設定します。

たとえば、9 つのフィールドと 2 つの時間ポイントを選択します。ADCC効率を分析するために、対照ADCCウェル中の生存可能なJIMT-1細胞をカウントする。ファインセルモジュールを使用して、セルに対応する画像上の領域を検出します。

各細胞を、周囲の細胞よりも蛍光強度が高い画像上の領域として検出します。直径が80マイクロメートルの組み込みMアルゴリズムを使用してセルを選択します。大きなオブジェクトを小さなオブジェクトに分割する分割感度設定を値 0.5 に設定します。

ピクセル強度の最低レベルである共通しきい値を 0 に調整します。2段階でEGFP蛍光強度の高いバックグラウンド領域の検出を除外します。まず、強度特性の計算機能を適用して、以前に選択した細胞領域におけるEGFP蛍光強度を決定します。

その後、選択集団オプションを使用して最小強度と最大強度のしきい値を設定し、ADCCの最後に生存可能なJIMT-1 GFPターゲット細胞の数を取得します。3時間後に検出されたセル数を時間ゼロで検出されたセル数で割ることにより、ADCC効率を計算します。本手法の実用化を代表的な結果とともに実証したい。

棚からランダムに取り出された16個の化合物でテストプレートを設置しました。また、ADCC阻害効果が期待されるコルヒチン、ビンクリスチン、ポドフィロトキシンの3化合物を組み入れた。DMSOを陰性対照として用いた。

各薬物は、プレート上で4回繰り返して使用した。図は、テスト画面の結果を示しています。マイナスNK群において、JIMT-1細胞に対する薬物の毒性を試験した。

プラスNK群では、NK細胞とトラスツズマブが添加され、約50%の細胞毒性を引き起こしました。3つの試験化合物の期待されるADCC阻害剤効果は、アッセイで検出することができました。乳がん細胞、NK細胞、治療用モノクローナル抗体トラスツズマブの臨床的に関連する相互作用をモデル化した共培養アッセイ系を設置しました。

このアッセイは、自動顕微鏡と画像解析を組み合わせたもので、ADCC修飾薬を同定するための化合物ライブラリーのスクリーニングに適しています。この手順は、抗腫瘍反応を増強するアジュバント分子を同定したり、有害作用を有する化学物質を同定するために潜在的に使用することができる。