Name: 抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学ぼう、ハイコンテントスクリーニングアッセイを用いてNK細胞による乳がん細胞傷害を調節する化合物を同定する方法。抗HER-2抗体トラスツズマブ存在下での抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を自動画像解析で評価し、がん免疫療法の新規薬剤発見に応用する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LVは、国立研究開発イノベーションオフィスの助成金GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS」、GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVEおよびOTKA K132193、K147482から資金提供を受けました。CD16.176V.NK-92細胞は、Dr. Kerry S. Campbell(Fox Chase Center, Philapedlphia, Pen, Brink Biologics, lnc.カリフォルニア州サンディエゴ)は、世界中の特許によって保護されており、nantkwest、lncによってライセンスされています。著者らは、NK-92細胞株の使用と技術的助言を提供してくれたGyörgy VerebとÁrpád Szöőrに感謝しています。

注:アッセイワークフローの主要なステップを 図2に示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64485/64485fig02.jpg"> 図2:ADCC画面のワークフロー。 JIMT-1-EGFP標的細胞を96穴HCSプレートに播種し、化合物ライブラリーの薬剤で処理する。次に、染色されていないNK(エフェクター)細胞およびトラスツズマブを添加し、プレートを0時点および3時間のインキュベーション後に画像化する。ADCC評価は、生存可能な(表面接着性の)標的細胞の数の変化に基づいている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64485/64485fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1. HCSプレートのコーティング
<ol><li>96ウェルハイコンテントスクリーニング(HSC)プレートを50 μL/ウェルJIMT-1培地(20%ウシ胎児血清(FBS)、0.3 U/mLインスリン(100 IU/mL、フムリンR、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM/F-12培地)でコーティングします。</li>
	<li>プレートをCO2 インキュベーターに1時間入れます。 注:JIMT-1セルをプレートのガラス表面に取り付けるには、コーティングが重要です。</li>
</ol>2. JIMT-1増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)細胞の播種
注:EGFP発現JIMT-1細胞は、以前の研究18で生成し、細胞をJIMT-1培地中のT25組織培養フラスコで培養しました(ステップ1.1の組成を参照)。
<ol><li>2 mLの滅菌PBSで細胞を洗浄します。</li>
	<li>1 mLのトリプシン-EDTAをフラスコに加え、フラスコをCO2 インキュベーターに10分間戻します。</li>
	<li>インキュベーション後、フラスコをタップしてJIMT-1細胞が剥離しているかどうかを確認します。</li>
	<li>2 mLのJIMT-1培地で消化を停止し、細胞懸濁液を15 mLチューブに回収します。</li>
	<li>ビュルカーチャンバー内で0.4%トリパンブルー(80 μLの色素+ 20 μLの細胞懸濁液)で細胞をカウントし、細胞数を133, 000細胞/ mLに調整します。</li>
	<li>96ウェルプレートからコーティング媒体を吸引します(ステップ1.2)。</li>
	<li>75 μLの細胞懸濁液をHCSプレートの各ウェルにピペットで入れます( 材料の表を参照)。</li>
	<li>CO2インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベーションしている間、細胞を付着させます。</li>
</ol>3. 化合物ライブラリーによるJIMT-1 EGFP細胞の前処理
<ol><li>JIMT-1細胞から培地を吸引し、50 μL/ウェルの新鮮なJIMT-1培地をウェルに加えます。プレートをハイスループットスクリーニングラボに移します。 注:リキッドハンドリングロボットを使用すると、化合物ライブラリの追加がより効率的かつ再現性高くなります。</li>
	<li>25 nL容量に較正されたピンツールを用いて、化合物ライブラリープレートからアッセイプレートに試験化合物を移します。これを4回実行します。4回の移送により、最終容量は100 nL(および最終濃度は20 μM)になります。</li>
	<li>各ステップの間に、最初に50%DMSOで、次に70%エタノールでピンツールを洗浄します。</li>
	<li>プレートを37°CのCO2 インキュベーターで1時間インキュベートします。</li>
</ol>4. エフェクター細胞を添加してADCCアッセイを開始する
<ol><li><li></li><li><li><li><li></ol><ol><li><li></li><li><li></li><li><li></ol><ol><li> </li><li></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy%3A+an+alternative+promising+therapeutic+approach+against+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers.</a> Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present%2C+and+future+of+non-viral+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The past, present, and future of non-viral CAR T cells.</a> Frontiers in Immunology. 13, 867013(2022).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Ross, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HER-2+receptor+and+breast+cancer%3A+ten+years+of+targeted+anti-HER-2+therapy+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine.</a> Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).</li>
<li>Shitara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+trastuzumab+deruxtecan+and+safety+management+for+patients+with+HER2-positive+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer.</a> Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).</li>
<li>Gianni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+neoadjuvant+pertuzumab+and+trastuzumab+in+women+with+locally+advanced%2C+inflammatory%2C+or+early+HER2-positive+breast+cancer+%28NeoSphere%29%3A+a+randomised+multicentre%2C+open-label%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Barok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+causes+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity-mediated+growth+inhibition+of+submacroscopic+JIMT-1+breast+cancer+xenografts+despite+intrinsic+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance.</a> Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).</li>
<li>Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+cells+and+monoclonal+antibodies%3A+Two+partners+for+successful+antibody+dependent+cytotoxicity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261(2021).</li>
<li>Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+exploitation+of+neutrophils+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer.</a> Semin Immunol. 57, 101581(2021).</li>
<li>Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ADCC%3A+A+different+approach+to+HER2+breast+cancer+in+the+immunotherapy+era%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era.</a> Breast. 60, 15-25 (2021).</li>
<li>van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+by+chromium+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).</li>
<li>Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+antibody-dependent+cell+cytotoxicity+using+lactate+dehydrogenase+%28LDH%29+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement.</a> Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).</li>
<li>Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+ADCC+against+adherent+cells%3A+Impedance-based+detection+is+superior+to+release%2C+membrane+permeability%2C+or+caspase+activation+assays+in+resolving+antibody+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response.</a> Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).</li>
<li>Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thaw-and-use+target+cells+pre-labeled+with+calcein+AM+for+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).</li>
<li>Lee-MacAry, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+flow+cytometric+cell-mediated+cytotoxicity+assay+using+the+fluorophores+PKH-26+and+TO-PRO-3+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide.</a> Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).</li>
<li>Tanito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+natural+killer+cell-mediated+cell+killing+assay+based+on+the+leakage+of+an+endogenous+enzyme+or+a+pre-loaded+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore.</a> Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).</li>
<li>Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+high-content+screening+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Image-based high-content screening in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).</li>
<li>Guti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitargeted+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+sunitinib+induces+resistance+of+HER2+positive+breast+cancer+cells+to+trastuzumab-mediated+ADCC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).</li>
<li>Li, F., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+NK+cells+and+ADCC%3A+A+promising+immunotherapy+approach+in+targeted+therapy+for+HER2-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1083462(2022).</li>
<li>Perussia, B., Loza, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+%28ADCC%29+and+reverse+ADCC+%28redirected+cytotoxicity%29+in+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).</li>
<li>Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+emtansine%3A+Mechanisms+of+action+and+resistance%2C+clinical+progress%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond.</a> Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).</li>
</ol>

著者らは利益相反を報告していない。

ADCC反応は比較的前に説明されています。プロセスの重要な分子イベントも記載されている19。ADCCを測定するための方法は、ゴールドスタンダードの放射性クロム放出アッセイ、細胞質酵素放出アッセイからいくつかの蛍光ベースのフローサイトメトリーまたはマイクロプレートアッセイにまで及ぶ20。ただし、これらのアッセイの一般的な制限は、ハイスループットアプリケーションには適していないことです。これまで、ADCC修飾薬の化合物ライブラリーのスクリーニングに適した画像ベースのHCSアッセイを開発しました18。しかし、これまでに開発したアッセイは、標的細胞をカルセイン-アセトキシメチルエステルで事前に染色する必要があり、NK細胞とトラスツズマブを添加する前に余分な色素を除去する必要があるため、洗浄工程が必要であるという大きな欠点がありました。現在の方法は、EGFP形質導入JIMT-1細胞を使用することで、染色および洗浄ステップなしでエフェクター細胞と標的細胞を簡単に区別できるという点で、アッセ...

抗がん抗体、免疫チェックポイント阻害剤、またはキメラ抗原受容体発現T(CAR-T)細胞による免疫療法は、がん治療への強力なアプローチです1,2,3。トラスツズマブは、HER-2陽性の早期または転移性乳がん、ならびにHER-2陽性の転移性胃がんの治療に使用されるヒト化モノクローナル抗HER-2(ヒト上皮成長因子受容体2)抗体である4,5,6。主に上皮成長因子4の増殖刺激作用を阻害することにより作用する。しかし、トラスツズマブは、がん細胞がHER-2刺激に対する反応性を失っても、効率的にがん細胞死を引き起こすことが報告されています7。抗体のこの逆説的な効果は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)7によるものです。ADCCは、ADCCのエフェクター細胞と総称されるナチュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、およびマクロファージによって媒介され得る8,9。トラスツズマブなどの抗体が腫瘍細胞に結合する場合、これらのエフェクター細胞はそれらのFc受容体を使用して抗体の定常(Fc)領域に結合します。抗体は、腫瘍細胞とFc受容体担持エフェクター細胞を架橋し、それらの細胞傷害性メディエクター10の放出を誘発する。ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンを含む顆粒の細胞傷害性カーゴを放出して、標的細胞膜とグランザイム(細胞死シグナル伝達経路をトリガーする)に孔を生成し、免疫シナプスに働きかけ、がん細胞のアポトーシスを引き起こします(図1を参照)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64485/64485fig01.jpg"> 図1:ADCCにおけるエフェクターと標的細胞の相互作用。 エフェクターNK細胞の細胞表面Fcγレセプターは、腫瘍細胞の表面に発現しているHER2分子に特異的な抗HER2トラスツズマブ抗体のFc領域を認識する。したがって、いわゆる免疫学的シナプスが2つの細胞間に確立され、エフェクター細胞の細胞傷害性顆粒の指向性エキソサイトーシスを誘導する。放出されたパーフォリンおよびグランザイム分子は、最終的に標的細胞のアポトーシスをもたらす。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64485/64485fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ADCCを含むいくつかのアッセイが細胞毒性を定量化するために以前に開発されている。ゴールドスタンダードは放射性クロム放出法であり、標的細胞を放射性51Cr同位体で標識し、溶解した標的細胞11の上清から放射能を測定することでADCCを定量する。放射性ファーモンおよび廃棄物の取り扱い、保管、および処分が厳しく規制されているため、この方法は生命科学者の間でますます人気がなくなりました。さらに、高スループットのアプリケーションにも適していません。死滅した標的細胞から放出される酵素(例えば、乳酸脱水素酵素)の活性を測定することは、51Crアッセイ12に代わる非放射性代替物を提供することができる。しかし、これらのアッセイでは、標的細胞死とエフェクター細胞死を区別できません。電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)はADCC13の定量に適していることが証明されましたが、ECIS機器はほとんどのラボで利用できず、この手法はハイスループットアプリケーション/スクリーニングと互換性がありません。蛍光標識された細胞は、多くの細胞生物学アッセイで一般的な代替手段であり、フローサイトメトリーまたはプレートリーダーベースのアプリケーションでよく使用されます14、15、16。ただし、これらのアッセイには洗浄ステップが含まれていることが多く、ハイスループットアプリケーション(フローサイトメトリーベースの技術など)とは互換性がありません。理論的にはADCC定量に適しているはずのいくつかの一般的な細胞毒性アッセイは、ADCC効率を確実に決定することができません13。近年、蛍光共焦点顕微鏡の普及に伴い、画像ベースのハイコンテントアッセイがライフサイエンスの様々な分野でますます普及してきている17。一方では、細胞イメージング装置は現在かなりユビキタスですが、他方では、取得した画像から事実上無限の形態学的パラメータを収集することができます。そこで、ハイコンテントスクリーニング対応のADCCアッセイを開発し、化合物ライブラリースクリーニングへの適合性を実証することを目指しました。
ここでは、画像ベースのADCCアッセイを紹介し、このアッセイをハイコンテントスクリーニング(HCS)に使用してADCC調節化合物を同定する方法を示します。このモデルは、JIMT-1乳癌標的細胞、CD16.176V.NK-92エフェクター細胞、およびヒト化モノクローナル抗HER2抗体トラスツズマブに基づいています。この方法により、ADCCを妨害する低分子を同定することで、NK細胞の殺腫瘍作用を増強できる薬剤を同定したり、NK細胞を介したADCCのメカニズムを解明したりすることができます。ADCCに関して細胞媒介性細胞毒性の定量化を目指す生命科学者は、このアッセイを発見科学または医薬品開発のいずれかに使用することで恩恵を受ける可能性があることを示唆しています。このアッセイは、ラボが蛍光イメージングと定量画像分析にアクセスし、ある程度の経験がある場合の代替手段となる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>化合物ライブラリの</td><td>5-フルオロウラシル</td><td>Applichem</td><td>A7686</td></tr><tr><td>96ウェルセルキャリアウルトラプレート</td><td>PerkinElmer</td><td>LLC 6055302 Betulin</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>B9757</td>の<td>化合物ライブラリ</td></tr><tr><td>CD16.176V.NK92細胞</td><td>Nankwest Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr>化合物ライブラリ <tr><td>Cisplatin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200896</td><td>の</td></tr> <tr><td>Cerulenin</td><td>ChemCruz</td><td>sc-200896</td><td></td></tr> の <tr><td>Colchicine</td><td>Sigma</td><td>C9754</td><td>の化合物ライブラリ</td></tr><tr><td>Concanavalin-A</td><td>Calbiochem</td><td>の 234567</td><td>の</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>の化合物ライブラリー</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培地</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td>in JIMT-1 EGFP 培地</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>in compound library</td></tr><tr><td>エトポシド</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td>E1383</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Biosera</td><td>FB-1090/500</td><td>JIMT-1 EGFP and NK medium</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma</td><td>F4043</td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO リキッドハンドリングロボット</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gallotannin</td><td>Fluka Chemical Corp.</td><td>化合物ライブラリGlutamine</td>Gibco 35,050&ndashの<td>16201</td></tr><tr><td></td><td></td><td>。061</td><td>in NK medium</td></tr><tr><td>Harmony software&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト化抗HER2モノクローナル抗体 (Herzuma)</td><td>EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R (insulin)</td><td>Eli Lilly</td><td>HI0219</td><td>JIMT-1 EGFP medium</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis Hung&aacute;リアKft。</td><td>NK培地中の</td><td>PHC0026</td></tr><tr>化合物<td>ライブラリ</td>中の<td>イサチン</td><td>シグマ</td><td>114618</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11,140&ndash;NK</td><td>媒体の</td>050</tr><tr><td>Na-ピルビン酸</td><td>ロンザ</td><td>BE13-115E</td><td>NK媒体の</td></tr><tr><td>ナリンゲニンシ</td><td>グマ</td><td>N5893</td><td>化合物ライブラリ</td></tr><tr><td>のNQDI-1</td><td>Sigma</td> SML0185<td>化合物ライブラリの</td><td>Opera</td></tr><tr><td>Phenixハイコンテント分析機器</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash;ストレプトマイシン</td><td>バイオセラ</td><td>LM-A4118</td><td>JIMT-1 EGFPおよびNK培地</td></tr>ペン<tr><td>トキシフィリン</td><td>シグマ</td><td>P1784</td><td>化合物ライブラリ</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ロンザ</td><td>BE17-517Q</td><td>で細胞を洗浄するための</td></tr>化合物ライブラリ<tr><td>Quercetin</td><td>Sigma</td><td>Q4951</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>の細胞Podophyllotoxin Sigma P4405化合物ライブラリのタンニン酸</td><td>シグマ</td><td>T8406</td><td></td></tr><tr><td>化合物ライブラリ</td>の<td>テモゾロミド</td><td>シグマ</td><td>T2577</td> 化合物ライブラリ</tr>の<tr><td>トリパンブルー0.4%溶液</td><td>シグマ</td><td>T8154</td><td></td></tr> 化合物<tr><td>ライブラリの</td>硫酸<td>ビンクリスチン</td>シ<td>グ</td>マ<td>V0400000</td></tr> &<tr><td>α;-NK</td><td>培地の</td>MEM<td>シグマ</td><td>M8042</td></tr></tbody></table>

抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語)

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

抗原特異的抗体または免疫チェックポイント阻害剤による免疫療法は、乳がんの治療に革命をもたらしました。上皮成長因子受容体HER2を発現する乳癌細胞は、抗HER-2抗体トラスツズマブによって標的とすることができる。抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、HER-2の抗腫瘍作用に関与する重要なメカニズムです。がん細胞に結合したトラスツズマブは、ADCCエフェクター細胞(ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、顆粒球など)のFc受容体によって認識され、これらの免疫細胞の細胞傷害活性を引き起こし、がん細胞死につながります。私たちは、ハイコンテントスクリーニングによって新規ADCCモジュレーター化合物を同定するために、ADCCを定量するための画像ベースのアッセイの開発に着手しました。本アッセイでは、HER2過剰発現JIMT-1乳癌細胞をトラスツズマブ存在下でNK-92細胞と共培養し、自動顕微鏡および定量画像解析により標的細胞死を定量します。標的細胞は、EGFP蛍光に基づいてエフェクター細胞と区別されます。ADCCモジュレーター薬を同定するために、アッセイで化合物ライブラリをテストする方法を示します。この目的のために、ラボの棚からランダムに選択されたファインケミカルを使用して、化合物ライブラリのテストプレートをセットアップしました。NK細胞の移動と脱顆粒を妨げると予想される3つの微小管不安定化化合物(コルヒチン、ビンクリスチン、ポドフィロトキシン)もテストライブラリに含まれていました。テストスクリーニングでは、3つのポジティブコントロール化合物すべてがヒットとして識別され、化学ライブラリ内のADCC修飾薬を同定するための方法の適合性が証明されました。このアッセイでは、化合物ライブラリースクリーニングを実施して、抗がん免疫療法を受けている患者の治療のための補助治療薬として使用できるADCC増強化合物を同定することができます。さらに、この方法は、異なる適応症のために癌患者によって服用された治療薬の望ましくないADCC阻害副作用を特定するためにも使用することができる。

アッセイが実際にどのように機能するかを示すために、ラボの棚からランダムに選択された16化合物のテストライブラリを作成しました(図3)。さらに、DMSOも陰性対照として、3つの微小管重合阻害剤化合物(コルヒチン、ビンクリスチン、およびポドフィロトキシン)を陽性対照として含めた。後者は、NK細胞のがん細胞への遊走やNK細胞の脱顆粒を妨害することでADCCを阻害することが期待された。すべての試験化合物およびDMSOを4重に試験ライブラリープレート上に置き、DMSOもプレートの最初と最後のカラムに添加しました(図3)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64485/64485fig03.jpg"> 図3:HCS ADCCアッ...

このプロトコルは、治療用抗HER-2抗体の存在下でナチュラルキラー細胞媒介性乳がん細胞死滅を調節する化合物を同定するための自動化された画像ベースのハイスループット技術を提示します。

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

抗体依存性細胞傷害性、略してADCCは、NK細胞、顆粒球、マクロファージと呼ばれるナチュラルキラー細胞によって媒介されます。これらはADCCのエフェクターセルです。上皮成長因子受容体HER2を標的とするトラスツズマブなどの抗体が腫瘍細胞に結合すると、これらのエフェクター細胞はFcyR受容体を使用して抗体の定常FC領域に結合します。この抗体は、腫瘍細胞とFcyR受容体担持エフェクター細胞を橋渡しし、それらの細胞傷害性顆粒の放出を引き起こします。これは癌細胞のアポトーシスをもたらす。ADCCは、トラスツズマブの抗増殖効果に反応しない腫瘍に対して有効である可能性がある。ADCCシステムをセットアップするには、抗HER2抗体トラスツズマブの存在下で、抗HER2陽性JIMT-1乳癌細胞をNK-92細胞株と共培養する必要があります。本アッセイに用いたJIMT-1細胞株は、緑色蛍光タンパク質を安定に発現しています。まず、96ウェルハイコンテントスクリーニングプレートをJIMT培地でコードします。50マイクロリットルの培地をプレートの各ウェルにピペットで入れる。プレートをCO2インキュベーターに1時間入れます。JIMT-1細胞をプレートのガラス表面に付着させるためには、コーティングが重要です。コーティング工程中に、JIMT-1細胞をトリプシン化する。2ミリリットルの滅菌PBSで細胞を洗浄します。次に、1ミリリットルのトリプシン-EDTAをフラスコに加えます。フラスコをCO2インキュベーターに10分間戻します。インキュベーション後、フラスコをタップしてJIMT-1細胞が剥離したかどうかを確認します。2ミリリットルのJIMT-1培地で消化を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに回収します。次いで、JIMT-1細胞を青色キャストチャンバー内でトリパンブルーで計数する。細胞数を133, 000細胞/mlに調整します。コーティング培地を吸引し、次いで75マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加える。CO2インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベーションしている間、細胞が付着するのを待ちます。翌日、培地を吸引し、50マイクロリットルの新鮮なJIMT-1培地をウェルに加え、プレートをハイスループットスクリーニングラボに移します。このロボットは、試験化合物をハイコンテントスクリーニングマイクロプレートに移すために使用されます。ロボットアームを使用して、ロボットは25ナノリットルを転送するように校正されたピンツールユニットをつかみます。合計100ナノリットルの試験化合物を化合物ライブラリープレートからアッセイプレートに4段階で移します。試験化合物の最終濃度が20マイクロモルであることを確認してください。各ステップの間に、最初にピンツールを50%DMSOで洗浄し、次に70%エタノールで洗浄します。プレートを摂氏37度のCO2インキュベーターで1時間インキュベートします。T25組織培養フラスコでNK細胞を培養する。JIMT-1細胞の薬物処理が進行中の間、T25フラスコから15ミリリットルの遠沈管にNK細胞を回収します。NK-92細胞をトリパンブルーでブルーカウントチャンバーでカウントします。細胞数をmlあたり400, 000細胞に調整します。1mlあたり400, 000細胞を含むNK細胞懸濁液の量を150gで室温で3分間遠心分離する。JIMT-1培地に抗HER2抗体トラスツズマブを1mlあたり20マイクログラム添加してADCC培地を調製する。20, 000 NK細胞を50マイクロリットルADCC培地でピペットで、JIMT-1 GFP細胞を標的とする。最終容量は100マイクロリットルであり、最終トラスツズマブ濃度は1mlあたり10マイクログラムである。アッセイプレートを、摂氏37度に設定されたインキュベーターを内蔵したハイコンテント分析装置に入れます。プレートは2つの時点で画像化されます。まず、標的細胞にエフェクター細胞を添加した直後に画像を取得し、2番目の画像セットはNK細胞を添加してから3時間後に撮影します。まず、マイクロプレートの種類を選択します。96ウェルのハイコンテントスクリーニングプレートを使用してください。焦点を選ぶには、非共焦点モードで10倍の対物レンズを備えたプレートでアッセイを行うため、焦点を選択します。ビニングを2つ選択して、信号対雑音比を2倍にします。適切なチャンネル、露光時間、レーザー出力、焦点面、波長を選択します。650-760ナノメートルの明視野画像を撮影し、488ナノメートルの励起と500-550ナノメートルの発光波長を持つEGFP形質導入JIMT-1細胞を検出します。測定を開始する前に、スナップショット機能でサンプル画像を撮影し、正しい設定を確認してください。最後に、イメージングのフィールド数と時間ポイント数を設定します。たとえば、9 つのフィールドと 2 つの時間ポイントを選択します。ADCC効率を分析するために、対照ADCCウェル中の生存可能なJIMT-1細胞をカウントする。ファインセルモジュールを使用して、セルに対応する画像上の領域を検出します。各細胞を、周囲の細胞よりも蛍光強度が高い画像上の領域として検出します。直径が80マイクロメートルの組み込みMアルゴリズムを使用してセルを選択します。大きなオブジェクトを小さなオブジェクトに分割する分割感度設定を値 0.5 に設定します。ピクセル強度の最低レベルである共通しきい値を 0 に調整します。2段階でEGFP蛍光強度の高いバックグラウンド領域の検出を除外します。まず、強度特性の計算機能を適用して、以前に選択した細胞領域におけるEGFP蛍光強度を決定します。その後、選択集団オプションを使用して最小強度と最大強度のしきい値を設定し、ADCCの最後に生存可能なJIMT-1 GFPターゲット細胞の数を取得します。3時間後に検出されたセル数を時間ゼロで検出されたセル数で割ることにより、ADCC効率を計算します。本手法の実用化を代表的な結果とともに実証したい。棚からランダムに取り出された16個の化合物でテストプレートを設置しました。また、ADCC阻害効果が期待されるコルヒチン、ビンクリスチン、ポドフィロトキシンの3化合物を組み入れた。DMSOを陰性対照として用いた。各薬物は、プレート上で4回繰り返して使用した。図は、テスト画面の結果を示しています。マイナスNK群において、JIMT-1細胞に対する薬物の毒性を試験した。プラスNK群では、NK細胞とトラスツズマブが添加され、約50%の細胞毒性を引き起こしました。3つの試験化合物の期待されるADCC阻害剤効果は、アッセイで検出することができました。乳がん細胞、NK細胞、治療用モノクローナル抗体トラスツズマブの臨床的に関連する相互作用をモデル化した共培養アッセイ系を設置しました。このアッセイは、自動顕微鏡と画像解析を組み合わせたもので、ADCC修飾薬を同定するための化合物ライブラリーのスクリーニングに適しています。この手順は、抗腫瘍反応を増強するアジュバント分子を同定したり、有害作用を有する化学物質を同定するために潜在的に使用することができる。

high-content-screening-assay-for-identification-antibody-dependent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、母乳食細胞による抗体依存性細胞食作用(ADCP)を測定するアッセイを示しています。抗原-抗体複合体に結合した蛍光標識マイクロスフェアを母乳から単離した細胞懸濁液と組み合わせ、食作用性白血球による抗体依存性細胞食作用を誘導します。一般的な白血球抗原(CD45)に対する抗体で細胞を標識すると、フローサイトメトリーを使用して、マイクロスフェア陽性の生存貪食性白血球の蛍光強度を測定し、ADCP活性のレベルを示します。...

食細胞による抗体依存性細胞貪食作用を測定するためのin vitroアッセイ

このビデオは、蛍光タンパク質を発現する3D腫瘍スフェロイドに対するCAR-T細胞の細胞毒性効果を評価するin...

腫瘍スフェロイドに対するCAR-T細胞の細胞毒性を評価するためのin vitroアッセイ

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター -...

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

全血細胞毒性アッセイ（WCA）は、蛍光顕微鏡および自動化された画像処理をハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって開発された細胞毒性アッセイである。ここでは、抗CD20抗体で処置したリンパ腫細胞の定量的な細胞傷害性分析を提供するために、ヒト全血中でリアルタイムに分析することができる方法について説明します。...

ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ

この研究の目的は、インピーダンスベースのリアルタイム細胞分析装置とin...

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

中和抗体や血清や脳脊髄液 (CSF) など、行列の人間の酵素補充療法の細胞内取り込みを妨げるその他の要因を検出する細胞ベースのフロー...

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

液体および固形腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞の効力を評価する定量的なインビトロ細胞質アッセイシステムを説明する。このプロトコルは、他の免疫エフェクター細胞、ならびに組み合わせ治療を評価するために拡張することができる。...

固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

本稿では、抗腫瘍抗体の重要ながん細胞死滅機構であるADCC機構を調節する化合物を同定する方法について紹介する。NK細胞の細胞毒性効果は、トラスツズマブの存在下で乳がん細胞スフェロイドで測定されます。画像解析により、スフェロイドの生細胞と死細胞、および標的細胞が同定されます。...

腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

ここでは、ADCCバイオアッセイキットを使用した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)アッセイのプロトコールを紹介します。この方法は、がん免疫療法におけるADCCメカニズムの解明と抗体の治療可能性を評価するための貴重なツールを提供します。...

抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価

ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

キメラ抗原受容体T細胞を単一細胞レベルで評価するための液滴ベースの細胞毒性アッセイ

学ぼう、ハイコンテントスクリーニングアッセイを用いてNK細胞による乳がん細胞傷害を調節する化合物を同定する方法。抗HER-2抗体トラスツズマブ存在下での抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を自動画像解析で評価し、がん免疫療法の新規薬剤発見に応用する。

抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語)

さらに動画を探す