Name: 出芽酵母における5-エチニル-2-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶEdU取り込み法によるSaccharomyces cerevisiaeのS期持続時間測定。クリック化学とフローサイトメトリーでDNA複製を可視化し、従来法では検出困難な軽微な合成欠陥も同定できる迅速で再現性の高い手法です。

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著者らは、J.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche sur le Cancer(ARC)が博士課程のフェローシップをJ.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche(ANR)に財政支援(助成金ANR-18-CE12-0018-01)として認める。サイトメトリーと顕微鏡検査は、モンペリエMRIバイオキャンパスイメージング施設で実施されました。

1. S. セレビシエ 細胞培養
注:使用した酵母株は表1に記載されています
注意: Sフェーズの持続時間は、さまざまな方法で監視できます。対処すべき問題に応じて、細胞は、G1 停止後に非同期または同期的に増殖させることができる。
<ol><li>非同期に増殖 するS.セレビシエ 細胞から 注:この方法では、非同期的に成長する細胞集団におけるS期の細胞の割合を決定できます。倍増時間を決定することにより、Sフェーズ(および他のフェーズ)の持続時間を外挿できます。<ol><li>10 mLの合成完全(SC)培地に S. cerevisiae 細胞を低細胞濃度(5 ×10 4 細胞/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。 注:濃度はセルカウンターで測定されます。倍加時間を効率的に計算するには、まだ指数関数的段階にある(理想的には2 ×10 7 cells/mL未満)の一晩培養から培養物を接種することをお勧めします。リッチ培地(YPD)で細胞を増殖させることは、EdU検出が効率的ではないため推奨されません。</li>
		<li>翌日、細胞を20 mLの新鮮なSC培地で最終濃度5×105 細胞/mLで希釈します。</li>
		<li>細胞を120rpmで横振とうしながら振とう水浴中で30°Cで培養した。</li>
		<li>細胞濃度は、1 ×10 7 cells/mLに達するまで1時間ごとに測定します。 注:この手順により、時間の経過に伴う細胞濃度の増加をグラフィカルに表示できます。倍増時間の計算に使用される式は、 表2の凡例で説明されています。</li>
		<li>細胞濃度が約2 ×10 6-5×10 6 細胞/mLの場合、EdU標識のステップ2と並行して進めます。</li>
	</ol></li>
	<li>G1- 同期したS.セレビシエ 細胞から 注:この方法では、フローサイトメトリーおよび/または顕微鏡分析によってS期の開始時期と終了時期を決定できます。<ol><li>S. cerevisiae細胞を10 mLのSC培地に低細胞濃度(5 ×10 4 cells/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。 メモ: 手順 1.1.1 以降の注を参照してください。</li>
		<li>翌日、細胞を20 mLの新鮮なSC培地で最終濃度2 ×10 6-3×106 細胞/mLで希釈します。</li>
		<li>水で希釈した1 mg/mLのα因子を40 μL加えます。</li>
		<li>細胞を30°Cで130rpmで1時間軌道撹拌しながら培養する。</li>
		<li>水で希釈した1 mg/mLのα因子を40 μL再度加えます。</li>
		<li>細胞を30°Cで130rpmで1時間軌道撹拌しながら培養する。</li>
		<li>光学顕微鏡下で細胞を可視化し、G1 停止をモニターする。セルの90%以上がshmooを表示し、他のセルが丸みを帯びた芽のないセルである場合に進みます。 注:使用する背景に応じて、shmoo視覚化の前に細胞を超音波処理することをお勧めします。W303の背景のために、40-50の振幅で、毎回2秒間、2x超音波処理します。</li>
		<li>1,500 × gで3分間遠心分離します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>細胞を20 mLのSC培地に再懸濁します。</li>
		<li>手順1.2.8〜1.2.9を1回繰り返します。 注:これらのステップでα因子が洗い流され、細胞が細胞周期で放出されます。あるいは、真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコにセットされた漏斗を使用して、1.2μmのニトロセルロースフィルターで酵母細胞をろ過することにより、α因子を洗い流すことができます。</li>
		<li>5分ごとに1 mLの細胞を2回収集し、EdU標識のステップ2に進みます。 注:2本のチューブのうち1本のみの細胞にEdUをパルスラベル付けします。非パルス標識細胞は、二変量ヨウ化プロピジウム(PI)-EdUグラフ上でEdU陽性細胞とEdU陰性細胞を区別するために使用されます。</li>
		<li>放出後30分で水で希釈した1 mg/mL α因子400 μLを加えます。. 注:この高用量のα因子は、次の細胞周期のG1 期で細胞を阻止し、細胞が次のS期に再入するのを防ぐために必要です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. EdUラベリング
<ol><li>1 mLの細胞培養液を、1 μLの10 mM EdUを含む2.0 mLの微量遠心チューブに移します。反転でよく混ぜます。 注:PI-EdU二変量FACSでEdU陽性細胞とEdU陰性細胞を区別するには、さらに1 mLの細胞培養液を、1 μLのDMSOを含む2.0 mLのマイクロフュージチューブに移します。</li>
	<li>振とう水浴中で攪拌しながら30°Cで3〜5分間インキュベートします。 注:顕微鏡でのEdU検出には3分で十分です。フローサイトメーターで最適なEdUを検出するには5分かかります。</li>
	<li>100 μLの100%エタノールを加えて反応を停止します。<ol><li>細胞サイズの測定が必要な場合は、100 μLの20%パラホルムアルデヒドを添加して反応を停止します。 注:Click反応後のさらなる分析のために有糸分裂細胞の核構造をそのまま維持する場合は、細胞を氷上に置くのではなく、室温(RT)で2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定することをお勧めします。</li>
		<li>100 μLの100%エタノールを添加する前に、可変速ロッカーで20チルト/分で穏やかに攪拌しながら、細胞をRTで20分間放置します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 細胞の固定と透過処理
<ol><li>細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。真空ピペットを使用して上清を除去します。</li>
	<li>細胞ペレットを500 μLの70%エタノールに再懸濁します。ボルテックスでよく混ぜます。</li>
	<li>可変速ロッカーでRTで20チルト/分で≥1時間放置し、細胞を透過させます。 注:SC培地で増殖した細胞は、マイクロフュージ壁に付着する傾向があるため、うまくペレット化されません。エタノールの添加はペレット化を改善し、細胞損失を減少させる。細胞は4°Cで一晩保存することも、-20°Cで長期間保存することもできます。</li>
	<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
	<li>細胞をPBS中の500 μLの10%エタノールで2回洗浄します。 注:洗浄は、細胞から取り込まれていないEdUを除去するために重要です。</li>
</ol>4.クリック反応
<ol><li>サイトメトリー分析用<ol><li>細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>0.1 mg/mL RNase Aおよび0.2 mg/mLプロテイナーゼKを含む200 μLのPBSにペレットを再懸濁します。</li>
		<li>時々振とうしながら50°Cで1〜2時間インキュベートします(または37°Cで一晩)。</li>
		<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>細胞を500 μLのPBSで洗浄します。</li>
		<li>細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>細胞ペレットを200 μLのPBS + 1%ウシ血清アルブミン(BSA)に再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。 注:より長い時間は必要ではなく、クリック反応の効率にさえ悪影響を及ぼします。</li>
		<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>ペレットを300 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。</li>
		<li>細胞を2本のチューブに分配します:クリック反応用の1.5 mLマイクロ遠心チューブに200 μL、Sytox Green染色用に別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに100 μL。</li>
		<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>シトックスグリーン染色用 注:高品質のDNA含有量参照プロファイルを取得するために、Sytox Green染色(クリックなし)のアリコートを採取することを強くお勧めします。実際、クリック反応は、Sytox GreenおよびPI蛍光を含むインターカラント蛍光を強く消光します。その結果、クリック反応はDNA含有量の読み取りを歪める可能性があります。<ol><li>細胞ペレットを100 μLのPBSに再懸濁します。</li>
			<li>10-30 μL(細胞濃度に応じて)を、300 μLの50 mM Tris-HCl、pH 7.5、および0.5 μMのSytox Greenを含むフローサイトメーターチューブに移します。</li>
			<li>40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。</li>
			<li>フローサイトメーターでサンプルを処理するまで、暗所に置いてください。 注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。</li>
		</ol></li>
		<li>クリック反応の場合<ol><li>36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO4、0.2 μLの2 mM Cy5アジド、および2 μLの1 Mアスコルビン酸の順(1本のチューブの量)で試薬を混合して、新しいアジ化物色素バッファーを調製します。 注:アジド色素バッファーのマスターミックスを調製することが可能です。試薬は、上記と同じ順序で混合する必要があります。</li>
			<li>細胞ペレットを40 μLの新しく作られたアジド染料ミックスで再懸濁します。暗闇の中でRTで60分間インキュベートします。</li>
			<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
			<li>PBS中の300 μLの10%エタノールで細胞を3回洗浄します。 注:洗浄は、すべての可溶性EdU-Cy5アジドを除去するために重要です。</li>
			<li>細胞を 100 μL の 50 μg/mL PI の PBS に再懸濁します。暗闇の中で10分間放置してください。</li>
			<li>10〜30 μLの細胞懸濁液(細胞濃度に応じて)を、300 μLの50 mM Tris-HCl、pH 7.5を含むフローサイトメーターチューブに移します。</li>
			<li>40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。</li>
			<li>サイトメーターでサンプルを処理するまで暗所に置いてください。 注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。</li>
		</ol></li>
		<li>488 nmの励起青色レーザーと530/30 BPフィルターを使用して、Sytox Greenサンプルを読み取ります。典型的な結果については 、図1A を参照してください。PI(x軸)には488nmの励起青色レーザーと615/20 BPフィルター、640 nmの励起赤色レーザーと660/20 BPフィルター(y軸)を使用して、ドットプロット上の二変量PI-EdUサンプルを読み取ります。典型的な結果については 、図1B を参照してください。 注: 図1C は、EdU陰性細胞の典型的なPI-EdU二変量FACS結果を表しています。これにより、EdU陰性細胞とEdU陽性細胞との識別が可能になります。</li>
	</ol></li>
	<li>顕微鏡分析用<ol><li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>ペレットを200 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>試薬を次の順序(1本のチューブに対する量)で混合して、新鮮なアジ化物色素バッファーを調製します:36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO4、0.2 μLの2 mM Dy-530アジ化物、2 μLの1 Mアスコルビン酸。 注:アジド色素バッファーのマスターミックスは、前述の順序で試薬を混合することにより、新鮮に調製できます。</li>
		<li>ペレットを40 μLの新しく作られたアジド染料バッファーで再懸濁します。暗闇の中でRTで60分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>細胞をPBS中の300 μLの10%エタノールで2回洗浄します。 注意: 洗浄は、すべての可溶性Dy-530アジドを除去するために重要です。</li>
		<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>細胞を0.5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)の 100 μL に PBS で再懸濁します。室温で暗所に30分間放置します。</li>
		<li>細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>300 μLのPBSで洗浄し、余分なDAPIを除去します。</li>
		<li>細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。</li>
		<li>細胞濃度に応じて、ペレットを10〜50 μLのPBSで再懸濁します。</li>
		<li>40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。 注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。</li>
		<li>1.7 μLの細胞を顕微鏡スライドガラス上にピペットで移し、清潔なカバーガラスで覆います。</li>
		<li>DAPIおよびTexasRedまたはCy3フィルターを備えた蛍光顕微鏡で直ちに観察してください。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

酵母は細胞周期研究の主要なモデル生物ですが、そのS期の特徴付けは、DNA複製のトレーサーとして使用されるBrdUなどの外因性ヌクレオシドを組み込むことができないために長い間妨げられてきました。酵母に単純ヘルペスチミジンキナーゼ(TK)の高発現を装備し、ヒトヌクレオシドトランスポーター(hENT)を添加することで、この問題は大部分が解決されました15,16。EdUは、抗BrdU抗体とは異なり、小さな蛍光アジドおよびクリックケミストリーによる検出が透過処理酵母細胞およびFACS分析に適しているため、BrdUよりも用途が広い17。ここでは、このTK-hENT1株におけるEdUの標識と検出の条件を最適化し、これまで検出されなかった複製欠陥をFACSまたは顕微鏡によってこのプロトコルを使用して定量できることを示しました。
同じメカニズムに干渉する可能性のあるツールを使用して生物学的メカニズムを研究することは、生物学の一般的な問題...

有糸分裂によるゲノム安定性は、2つの産生された細胞子孫への完全かつ等しい染色体のセットの伝達によって保証される。これは、細胞周期の各段階において所与の時間に起こる一連の事象の正確な完了に依存する。G 1では、複製元は、Cdc61を含むいくつかのライセンス要素の採用時にライセンスされます。S期では、全ゲノム複製は複数のアクティブな複製起点から開始され、複製ファクトリー2と呼ばれる顕微鏡的に見える焦点に集まる複製機械によって実行されます。M期では、複製された姉妹染色分体が有糸分裂紡錘体上に付着し、双配向して、有糸分裂細胞3の反対側の極に分離することを可能にする。各フェーズの調節、適切な完了、および期間は、ゲノムの安定性を確保するための鍵です。実際、これらの段階のいずれかからの時期尚早の終了は、ゲノムの不安定性につながります。例えば、出芽酵母CDK阻害剤Sic1の欠失またはG1サイクリンの過剰発現によって誘導されるより短いG1は、その後のS期4,5,6を変化させるであろう。その結果、複製ストレスに関連するかどうかにかかわらず、これらの規制緩和は、染色体の切断、再配列、および誤分離をもたらします4,5,6。したがって、S期の持続時間、より広義には細胞周期の他の段階の持続時間を監視することは、異なる変異体および異なるストレスの多い条件で発生する欠陥を特定するために重要であり得る。
細胞周期の持続時間を測定する従来の方法には、単純なDNA含有フローサイトメトリー(図1A)が含まれ、1Cおよび2Cピークから集団をG1、S、およびG2 + Mフェーズフラクションに分離するために使用されるフィッティングアルゴリズム(ほとんどのサイトメトリーソフトウェアで利用可能)に依存します。次に、分数に母集団倍増時間7を掛けます。ただし、この方法は推定値のみを提供し、特定のフラクション内で均一な細胞サイズ分布を必要とし、同期培養には適用できません。哺乳類細胞におけるS期持続時間を研究するために、EdUを含むいくつかのチミジン類似体が開発され、広く使用されている。細胞外培地からの取り込みとチミジンキナーゼ(以下TK)によるリン酸化により、DNAポリメラーゼがDNA合成(複製、組換え、修復)の部位に取り込むことができます。 サッカロミセス・セレビシエ 細胞におけるTK遺伝子の不在を回避するために、酵母株は、単純ヘルペスウイルスTK8 およびヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター(hENT1)9の安定かつ構成的発現を可能にするように操作されている。DNAに取り込まれると、EdUは選択的クリック反応 を介して 検出され、そのアルキン部分をアジド修飾蛍光色素10に化学的に結合します。
この論文は、顕微鏡とフローサイトメトリーによって単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能で、DNA複製期間とダイナミクス、および細胞周期の他のフェーズの持続時間を正確に視覚化および測定するために、EdUで非同期および同期TK-hENT1操作細胞をパルス標識するための2つの最適化された包括的なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>&alpha;-factor&nbsp;</td><td>Genescript</td><td>RP01002</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>04-100--812-E</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅</td><td>Σ</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Σ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ジスルホシアニン5 アジド (Cy5 アジド)</td><td>Interchim</td><td>FP-JV6320</td><td>Alexa647-Azide</td></tr><tr><td>Dy-530 アジド</td><td>ジオミクス</td>の代替品<td>&nbsp;530-10</td><td></td></tr><tr><td>EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)</td><td>カルボシンス</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>カルロエルバ試薬</td><td>P013A10D16</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A4544</td><td></td></tr>ヨ<tr><td>ウ化プロピジウム</td><td>シグマ</td><td>P4864</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テイナーゼKユーロ</td><td>メデックス</td><td>EU0090</td><td></td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Invitrogen</td><td>S-7020</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellカウンター</td><td>OLS</td><td>CASY</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>Agilent</td><td>NovoSampler Pro</td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベーター</td><td>Infors</td><td>444-4230</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>振とう水バス</td><td>ジュラボ</td><td>SW22</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>もの ソニケーター</td><td>ソニックス</td><td>ビブラセル</td><td></td></tr><tr><td>広視野顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>サンダー イメージャー</td><td>または同等のもの</td></tr></tbody></table>

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたs期持続時間の決定

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

真核生物のDNA複製は、染色体分離の前に細胞の遺伝的青写真が正しく複製されることを保証する高度に制御されたプロセスです。DNA合成の欠陥は染色体再配列の根底にあるため、DNA複製のモニタリングは、ゲノム不安定性の基礎を理解するために不可欠になっています。 Saccharomyces cerevisiae は、細胞周期調節を研究するための古典的なモデルですが、S期の細胞の割合やS期の持続時間などの重要なDNA複製パラメータを決定することは依然として困難です。このプロトコルは、チミジン類似体である5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の短い非毒性パルスを改変されたTK-hENT1酵母細胞で使用し、続いてクリック反応で検出することで、顕微鏡およびフローサイトメトリーによる単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能でDNA複製の視覚化と定量を可能にします。この方法は、酵母変異体のS期および細胞周期進行におけるこれまで見過ごされてきた欠陥を特定し、それによってゲノム安定性を確保するために不可欠な新しいプレーヤーの特性評価を可能にする可能性があります。

S期持続時間および、より広義には、G1 およびG2 +Mの持続時間を決定するために(プロトコルステップ1.1)、 S. cerevisiae W303野生型細胞(WT、 表1)をSC培地中で7時間非同期に増殖させた。1時間毎に、細胞濃度をモニターし、倍加時間を決定した(図2B)。これらの増殖条件において、計算された倍加時間は、25°Cで120分±13分であった(表2)。細胞が指数関数的段階(2 × 106-5 × 106 cells/mL)にある場合、細胞のアリコートをEdU(10 μM)で5分間パルス標識して、S期の細胞を選び出し、G1、S、およびG2 + M期にあった細胞の割合を決定しました。3つの細胞集団が二変量EdU−PIサイトメーター分析において観察された(図1B)。EdU陰性集団とEdU陽性集...

我々は、in vivoに組み込まれ、顕微鏡およびフローサイトメトリーによってクリックケミストリーを使用して検出されるチミジン類似体であるEdUを使用して、S.cerevisiaeのS期持続時間を正確に決定するための2つの補完的なプロトコルについて説明します。これにより、DNA複製の持続時間や変異体の見落とされた複製欠陥を簡単に特徴付けることができます。

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

このプロトコルにより、同期した出芽酵母細胞におけるS期持続時間を正確に決定することができます。これは、迅速、簡単、再現可能な方法です。さらに、従来のプロトコルでは検出されない軽度の合成欠陥を検出するのに十分な感度があります。この方法は、出芽酵母の細胞周期調節に取り組んでいる多くの研究者にとって有用であろう。このプロトコルを実演するのは、上級研究員のニコラス・タラレクと、研究室の博士課程の学生であるフアン・デ・ディオス・バルバ・テナです。サッカロミセス・セレビシエ細胞を10ミリリットルのSC培地に低細胞濃度で接種し、摂氏30度で一晩培養し、毎分130回転の軌道攪拌を行います。翌日、細胞を20ミリリットルの新鮮なSC培地で、1ミリリットルあたり10〜6細胞の2〜3倍の最終濃度で希釈する。水で希釈した1ミリリットルあたり1ミリグラムの40マイクロリットルでアルファ因子。次に、細胞を摂氏30度で培養し、毎分130回転で1時間軌道攪拌します。この手順を一度繰り返します。光学顕微鏡で細胞を可視化し、G1停止を監視します。セルの90%以上がshmooを表示し、他のセルが丸みを帯びた未突起のセルである場合は続行します。サンプルを1, 500 Gで3分間遠心分離し、上清を真空ピペットで捨て、細胞を20ミリリットルのSC培地に再懸濁します。この手順を一度繰り返します。5分ごとに2回1ミリリットルの細胞を採取し、EDUラベリングに進みます。リリースの30分後に400マイクロリットルのアルファファクターを追加します。1ミリリットルの細胞培養物を、1マイクロリットルの10ミリモルEDUを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、転倒によりよく混合する。Pi EDUバイバリアントファクト上のEDU陽性細胞とEDU陰性細胞を区別するには、さらに1ミリリットルの細胞培養物を、1マイクロリットルのDMSOを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。振とう水浴中で攪拌しながら摂氏30度で3〜5分間インキュベートする。100マイクロリットルの100%エタノールを加えて反応を停止します。細胞を微量遠心機で10, 000 Gで2分間ペレット化します。真空ピペットを使用して上清を除去します。細胞ペレットを500マイクロリットルの70%エタノールに再懸濁し、ボルテックスによりよく混合する。サンプルを室温で、可変速ロッカーで毎分20回の傾斜で少なくとも1時間放置し、細胞を透過させます。細胞をマイクロ遠心分離機で10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで捨てます。500マイクロリットルの10%エタノールとPBSで細胞を2回洗浄します。細胞をマイクロフュージで10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで捨てます。RNase AとプロテイナーゼKを含む200マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁し、摂氏50度で1〜2時間、または摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞をマイクロ遠心分離機で10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで廃棄します。細胞を500マイクロリットルのPBSで洗浄します。次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。細胞ペレットを1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。室温で30分間インキュベートします。次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄し、1%BSAを含む300マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。細胞を2本の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分配します。最初のチューブはクリック反応用の200マイクロリットルの細胞培養物で構成され、2番目のチューブにはsytox緑色染色用の100マイクロリットルの細胞培養物が含まれている必要があります。次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。sytox緑色染色の場合は、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次いで、細胞濃度に応じて、300マイクロリットルのsytox緑色混合物を含むフローサイトメーターチューブに10〜30マイクロリットルを移す。40〜50%の振幅で2秒間サンプルを2回超音波処理フローサイトメーターでサンプルを処理するまで暗所に置いておきます。クリック反応では、新たに調製したアジド色素バッファー40マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。暗所で室温で60分間インキュベートします。細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。次に、PBS中の300マイクロリットルの10%エタノールで細胞を3回洗浄します。次に、細胞を1ミリリットル当たり50マイクログラムのヨウ化プロピジウム100マイクロリットルにPBSに再懸濁し、暗所に10分間放置する。細胞濃度に応じて、10〜30マイクロリットルの細胞懸濁液を、300マイクロリットルの50ミリモルトリスHCl、pH 7.5を含むフローサイトメーターチューブに移します。40〜50の振幅で2秒間2回超音波処理します。サンプルをサイトメーターで処理するまで、暗所に置いておきます。488ナノメートルの励起青色レーザーと530 x 30バンドパスフィルターを使用して、sytoxグリーンサンプルを読み取ります。Pi X軸に488ナノメートルの励起青色レーザーと615 x 20バンドパスフィルターを使用し、Y軸に640ナノメートルの赤色励起レーザー、660 x 20バンドパスフィルターを使用して、ドットプロット上のバイエルンPi EDUサンプルを読み取ります。3つの細胞集団がバイ変量EDU Piサイトメーター分析で観察された。摂氏25度では、細胞集団の約27%がG1期、29%がS期、約44%がG2プラスM期でした。同期細胞では、S期の持続時間は、sytoxグリーンフローサイトメータープロファイル上でDNA含有量が1つのCから2つのCに変化した時間に基づいて約25分であり得る。EDUパルスラベリングは、Sフェーズ期間を正確に決定しました。放出の15分後、EDU陽性細胞の一部が検出され、S期の開始が示されました。S期を通る進行は、バイエルン円周率EDUグラフの細胞雲が上向きおよび右向きに移動することによって見られました。最後に、放出から35分で、細胞の一部はEDU陰性でしたが、2倍の量のDNAがあり、S期が終了し、細胞がG2プラスM期であったことを示しています。高い同期性が観察されたにもかかわらず、一部の細胞は放出後60分でS期を終了し、S期は放出後約65分で全集団で完了しました。完全な同期を行い、細胞が第2S期に入るのを防ぐことが重要です。細胞は、核DNA複製の先見性を監視および定量できる顕微鏡で画像化できます。この手法は、軽度のS期欠損を有する見落とし変異体、および細胞周期持続時間欠損を有する変異体を特定するのに役立つ。

determination-s-phase-duration-using-5-ethynyl-2-deoxyuridine

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用...

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。...

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II...

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

このプロトコルは、マスサイトメトリープラットフォームで使用するために細胞周期測定に適合させます。マスサイトメトリーのマルチパラメータ機能により、ヨウ素取り込みを直接測定することでS期の細胞を同定でき、細胞内サイクリングマーカーはさまざまな実験条件で各細胞周期状態の特性評価を可能にします。...

ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、...

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。...

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

次のプロトコルはRPA2 immunofluorescent stainingに先行している細胞周期の同期を利用して細胞周期のG1段階のsingle-stranded...

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

RNAの二次構造は主に成熟RNAで構造プローブ法を用いて観察されています。共転写構造追跡シーケンシング(CoSTseq)は、新生RNA上のポリメラーゼ位置の研究に用いられてきた核ランオンと構造プロービングを統合します。これにより、活性転写下のRNAのRNA二次構造の観察が可能になります。...

サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析

学ぶEdU取り込み法によるSaccharomyces cerevisiaeのS期持続時間測定。クリック化学とフローサイトメトリーでDNA複製を可視化し、従来法では検出困難な軽微な合成欠陥も同定できる迅速で再現性の高い手法です。

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

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