Name: 肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶ、差動遠心分離を用いた肝癌組織由来微小細胞外小胞の高純度濃縮法。この簡便な技術はがん生物学研究と細胞間情報伝達解析に有用です。

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著者らは、この研究を支援してくれた甘南医科大学第一付属病院に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82260422)の支援を受けました。

ヒト肝癌組織は、甘南医科大学第一附属病院で肝悪性腫瘍と診断された患者から採取されました。すべての患者がインフォームドコンセントフォームに署名し、ヒト組織サンプルの収集は甘南医科大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. 事前準備
<ol><li>転写脱色シェーカーをインキュベーターに入れ、温度を37°Cに設定する。 その他の必要な機器については、 図1 を参照してください。</li>
	<li>メスと鉗子に75%のアルコールをスプレーして清掃します。</li>
	<li>6 mgのコラゲナーゼD(4 mg/mL)と24 μLのDNase Ι(80 U/mL)を測定し、1.5 mLのRPMI-1640塩基性培地に添加して消化液を調製します。添加剤が完全に溶解するまで、穏やかな反転で混合します。</li>
	<li>事前に、70 μmおよび0.22 μmのセルストレーナーを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で湿らせます。</li>
	<li>100 mmの滅菌細胞培養皿をアイスボックスの上に置き、解凍後の肝臓組織を保持します。</li>
	<li>肝細胞癌組織単離後15分以内に、組織ブロック表面の血液をPBSで洗い流し、組織を滅菌凍結チューブに移し、実験まで-80°Cで2週間以内保存します。</li>
</ol>2.組織解離
<ol><li>-80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出し、2 mm x 2 mm x 2 mmの断片にカットした約400 mgの組織をアイスボックスの10 cm細胞培養皿に入れます。</li>
	<li>組織を1.5 mLの消化液を含む6ウェルプレートに移動します。次に、プレートを転移脱色シェーカー(20 rpm / min)に置き、37°Cで20分間インキュベートして、肝がん組織を完全に解離させ、sEVを放出します。</li>
	<li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、アイスボックスに置きます。80 μLのホスファターゼ阻害剤と200 μLの完全プロテアーゼ阻害剤溶液を加えて、消化を停止します。</li>
	<li>消化液を70 μmのセルストレーナーに移し、ゆっくりとろ過して大きな組織の破片を取り除きます。ろ液を集め、2 mLの遠沈管に入れます。</li>
</ol>3.差動超遠心分離
注:すべての遠心分離ステップを4°Cで実行します。
<ol><li>ろ液を500 × g で10分間遠心分離し、新しい2 mL遠沈チューブに上清を回収します。その後、小さな組織の破片のほとんどを取り除くことができます。</li>
	<li>上清を3,000 × g で20分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。ピペットの先端が表面の白い物質に触れるまで、上清を新しい遠心チューブに慎重に移します。</li>
	<li>残りの液体を3,000 × gで3分間遠心分離します。次いで、上清を吸引して小胞の採取を容易にする。sEVの純度を確保するために、白い物質が吸引されていないことを確認してください。</li>
	<li>採取した上清を12,000 × g で20分間遠心分離し、900 μLの上清を4.7 mLの超遠心チューブに移します。残りの液体を12,000 × g で3分間遠心分離し、両方の上清を集めて同じ超遠心チューブに混合します。チューブをPBSで完全に満たします。</li>
	<li>上清を100,000 × g で60分間遠心分離します。上清を廃棄し、超遠心チューブにPBSを満たし、100,000 × g で60分間遠心分離してペレットを再懸濁します。ペレットを50 μLのPBSで再懸濁します。</li>
	<li>1 mL滅菌シリンジを使用してsEV懸濁液を吸引し、0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。ろ液を600 μLの遠沈管に集め、-80°Cで保存してさらに分析します。</li>
</ol>4.濃縮品質の評価
<ol><li>透過型電子顕微鏡でsEVの形態を観察します。<ol><li>次に、10μLのsEVサンプルを銅ネットに落とし、室温で10分間インキュベートし、無菌蒸留水で洗浄し、吸収紙を使用して余分な液体を取り除きます。</li>
		<li>10 μLの2%酢酸ウラニルを銅ネットに滴下し、1分間陰性染色します。ろ紙を使用して銅ネットの表面の液体を吸収し、白熱灯の下で2分間乾燥させます。</li>
		<li>銅メッシュを透過型電子顕微鏡で観察し、80kVで画像化します。</li>
	</ol></li>
	<li>ナノ粒子フローサイトメーターを使用して、sEVのサイズ分布と純度を測定します。<ol><li>機械を始動する前に、200 μLの品質管理、200 μLのシリカナノスフィア、2 x 200 μLの超純水、2 x 200 μLの洗浄液、および200 μLのPBSを含むチューブを準備します。 注:sEVサンプルをテストする前に、機器の品質管理を実行し、粒子サイズ標準をテストする必要があります(サイズ分布は、同じ検出条件下で直径の異なる複数のナノミクロスフェア[68-155 nm]で生成された標準曲線を使用して計算する必要があります)。QCビーズとシリカナノスフィアを超純水で100倍希釈し、全量200μLとした。</li>
		<li>洗浄液の量(>10 mL)を確認し、シース液と廃液のレベル(20〜30 cm)の違いに注意してください。</li>
		<li>機器の主電源をオフにします。20秒後、コンピューターの電源を入れ、ソフトウェアを実行するために機器が正しく接続されていることを示すビープ音が鳴るのを待ちます。</li>
		<li>[ スタートアップ ]をクリックして、カメラ、レーザー、エアポンプの電源を入れます。</li>
		<li>シースフロー-起動をクリックし、超純水をローディングプラットフォームに置きます。4分後(楽器のカウントダウン)、[サンプルブースト]をクリックします|サンプルアンロード。</li>
		<li>30秒後、ブランクチューブをローディングプラットフォームに置き、 サンプルブースト|サンプルアンロード。次に、超純水を入れたチューブをローディングプラットフォームに置き、同時にサンプル ブースト|シースフローパージ。</li>
		<li>手動操作をクリックし、粒子濃縮チューブをローディングプラットフォームに置きます。次に、サンプルブーストを1分間クリックし、同時に「SAMP」で250 nm標準FL SiNPsの品質管理を選択します。インフ」</li>
		<li>サンプルサンプリングをクリックし、SPCMをクリックして検出器をオンにします。 注:この時点で、リアルタイムの信号波形を確認できます。</li>
		<li>[自動サンプリング]をクリックし、[サンプリングSETに1.0]と入力して、圧力を1KPaに固定します。ツールバーをクリックし、[大信号]を選択します。</li>
		<li>レーザーの水平位置を調整し、レーザーを 2μmに設定します。次に、 L または R をクリックして、信号が強く均一であることを確認します。</li>
		<li>[ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データをNafファイルに保存し、[ サンプル-アンロード]をクリックします。</li>
		<li>洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、サンプル ブーストをクリックし、1分後に サンプルアンロードをクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。</li>
		<li>粒子サイズの標準チューブをローディングプラットフォームに置き、 サンプルブースト を1分間クリックします。</li>
		<li>68-155 nm Std FL SiNPsの品質管理を「SAMP.Inf」をクリックし、[サンプルサンプリング]をクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。</li>
		<li>[ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に [バッファ ]にジャンプします。次に、データをNafファイルに保存し、[ サンプル-アンロード]をクリックします。</li>
		<li>洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、[サンプル ブースト]をクリックし、[ サンプルアンロード ]をクリックしてから1分後に配置します。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。</li>
		<li>PBSチューブをローディングプラットフォームに置きます。 サンプルブースト を1分間クリックします。</li>
		<li>68-155 nm Std FL SiNPsの品質管理を「SAMP.Inf」をクリックし、[サンプルサンプリング]をクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。</li>
		<li>[ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に [バッファ ]にジャンプします。データを Naf ファイルに保存し、[ サンプル - アンロード] をクリックします。</li>
		<li>洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、1分後にサンプル ブースト と サンプルアンロード をクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。</li>
		<li>手順 4.2.17-4.2.20 で前述したサンプル情報を確認します。PBS (ステップ 4.2.17) を sEV サンプルに変更し、データを分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>ウェスタンブロットでsEVをさらに特定します。<ol><li>製造元の指示に従って、BCAタンパク質定量キットを使用して、sEVおよび組織のタンパク質濃度を測定します。</li>
		<li>これらの定量結果に基づいて、sEVの負荷量を計算します(たとえば、ウェルあたり5 μgのタンパク質の場合)。ローディングバッファーを1:4の比率で追加し、混合物をボルテックスします。</li>
		<li>100°Cの金属浴(ドライサーモスタット)で10分間変性させた後、12%ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を60Vで80分間分離します。</li>
		<li>転写バッファー(25 mM Tris、192 mM グリシン、20% メタノール)を使用して、ゲルを 0.22 μm ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに 220 mA で 2 時間移します。</li>
		<li>メンブレンをトリス緩衝生理食塩水トゥイーン(TBST)中の5%脱脂粉乳で室温で1時間ブロックし、一次抗体(ウサギモノクローナル抗ヒトCD9抗体、ウサギモノクローナル抗ヒトCD63抗体、ウサギモノクローナル抗ヒトTSG101抗体、マウスモノクローナル抗ヒトGM130抗体)とともに4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体を5%無脂肪乳で1:1,000で希釈します。</li>
		<li>TBSTで3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体でメンブレンを室温で1時間インキュベートします。</li>
		<li>ECLブロッティング基質を用いてHRP結合抗体を検出し、画像を収集・解析します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
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<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
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<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

このプロトコルは、肝臓癌組織からsEVを抽出するための再現性のある方法について説明しています。高品質のsEVは、鋭い組織分離、消化酵素による処理、差動超遠心分離、および0.22μmフィルター膜ろ過および精製によって得られます。ダウンストリーム分析では、sEVの高純度を確保することが非常に重要です。差動遠心分離の過程で、上清の表面に白い物質(未知の組成)の層が現れます。この層はsEVを汚染するため、遠心分離(3,000 × g 、12,000 × g)と0.22 μmの膜ろ過を繰り返して可能な限り除去しました(補足表S1)。この白い層の干渉により、上澄みを吸引しながらsEVを失うリスクがありました。そのため、複数回の遠心分離を慎重に進め、白い物質に触れずにできるだけ慎重に上清を回収することが重要です。
このプロトコルは、高品質の肝臓組織由来sEVを精製することができますが、いくつかの制限があります。これらの実験では、組織ブロックの容量は通常~300-500 mgです。非常に小さな組織ブロックから分離されたsEVの数...

小さな細胞外小胞(sEV)は、直径が約30 nmから150 nmで、さまざまな細胞から分泌されます1。それらは組織細胞と通信し、脂質、タンパク質、DNA、RNAなどの重要な生体分子をさまざまな臓器、組織、細胞、および細胞内部分に輸送することにより、局所または遠隔の微小環境を調節することができます。したがって、それらはまた、受信者セル2、3の挙動を変えることができる。特定のsEVの単離と精製は、病気の発症および経過中の生物学的挙動を研究するための不可欠な前提条件です。ゴールドスタンダードと見なされている差動超遠心分離は、sEVを通常存在する組織から分離するために一般的に使用されます4。組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、sEVのみを残してこの技術によって除去することができます。
コラゲナーゼDおよびDNaseIは、細胞または小胞の分子特性に影響を及ぼさないことが示されており、両方の酵素の特性が細胞外マトリックス5における小胞の放出に寄与する。これらの酵素は、ヒト転移性黒色腫組織、結腸癌組織、および結腸粘膜組織からsEVを抽出するために使用されています5、6、7。しかし、これらの方法におけるコラゲナーゼDとDNase Iの濃度と消化時間は異なり、一貫性のない結論につながります。他のサブタイプのsEVの共沈を避けるために、研究者はろ過および/または示差遠心分離によってより大きな細胞外小胞(直径0.1 μmまたは0.2 μm)を除去しました8。ソース組織に応じて、単離および精製の異なる方法が必要とされる場合がある9、10。
従来の差動超遠心分離法を使用して肝臓組織からsEVを抽出すると、上清の表面に白質の層が形成され、その特性を決定する方法はありません。以前の研究11では、この白質の層がsEVの純度に影響を与えることがわかりました。従来の方法で分離されたサンプルの粒子数とタンパク質濃度は現在の方法よりも高かったが、多くの汚染物質が結果の再現性を低下させる可能性があるため、変動係数は大きかった。すなわち、洗剤を用いて(すなわち、1%Triton X-100中の粒子の溶解度を検出する)と、この方法で得られたsEVの純度が高いことを見出した。そこで、この方法を用いて大腸がん組織由来のsEVを単離・精製し、プロテオミクス研究を行っています。
現在、肝臓がんにおけるsEVの研究は、主に血清、血漿、および細胞培養の上清に焦点を当てています12,13,14。しかし、肝臓がん組織由来のsEVは、肝臓がんの生理学的病理と周囲の微小環境をより正確に反映し、他のEVの劣化や汚染を効果的に回避することができます15,16。示差超遠心法を使用することで、この方法は収量を豊かにし、高品質のsEVを得ることができ、肝臓がんのさらなる研究のための重要な基礎を提供します。この方法により、肝癌組織を鋭利な分離により分離し、コラゲナーゼDおよびDNaseIによって解離させることができます。次いで、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、濾過および示差超遠心分離によってさらに除去される。最後に、sEVは後の研究のために分離および精製されます。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m メンブレンフィルターユニット</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 滅菌シリンジ</td><td>湖北省 Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2% 酢酸ウラニル</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4.7 mL 遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル セルキューチャープレート</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mLビーカー</td><td>天津Kangyiheng実験器具販売会社</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70&マイクロ;m 細胞ストレーナー</td><td>バイオシャープ</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 細胞培養皿</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro;L 遠心分離チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質定量キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン・コールター Optima-Max-TL</td><td>ベックマン&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini トランスブロット</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>ロシュ</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>銅ネット</td><td>河南省 Zhongjingkeyi 技術会社</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>ドライ サーモスタット</td><td>杭州 allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD9 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗マウス抗体&nbsp;</td><td>プロテインテック</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>ヤギワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役二次抗ウサギ抗体&nbsp;</td><td>プロテインテック</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>上海鎮興化学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノ粒子フローサイトメーター</td><td>ナノFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤(PhosSTOP)</td><td>ロシュ</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニリデン メンブレン</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC ビーズ</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 基本媒体</td><td>生物産業&nbsp;</td><td></td><td></td>C11875500BT</tr>メス広<tr><td></td><td>州Kehuaトレーディング</td><td>カンパニーNN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>シリカナノスフィア</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>転移脱色シェーカーTS-8</td><td>Kylin-BellE0018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101抗体</td><td>プロテインテック</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット広</td><td>州Ligeテクノロジー会社</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

組織由来の小さな細胞外小胞(sEV)は、ソース細胞の機能状態と組織の間質空間の特性を反映することができます。これらのsEVの効率的な濃縮は、それらの生物学的機能の研究にとって重要な前提条件であり、臨床検出技術と治療キャリア技術の開発の鍵です。sEVは通常ひどく汚染されているため、組織から分離することは困難です。この研究は、肝癌組織から高品質のsEVを迅速に濃縮する方法を提供します。この方法には、消化酵素(コラゲナーゼDおよびDNase Ι)と組織とのインキュベーション、70 μmセルストレーナーによるろ過、差動超遠心分離、および0.22 μmメンブレンフィルターによるろ過の4段階のプロセスが含まれます。差動超遠心分離ステップの最適化とろ過ステップの追加により、この方法で得られるsEVの純度は、従来の示差超遠心分離によって達成されるものよりも高くなります。これは、組織由来sEVの研究のための重要な方法論と裏付けとなるデータを提供します。

ヒト肝がん組織由来のsEVは、肝臓がん患者の診断、治療、予後において重要な役割を果たしてきました。この方法では、一般的な実験機器を使用して、肝臓がん組織に由来するsEVを分離および精製しました。これは、sEVの研究に方法論的サポートを提供する可能性があります。図2は、肝がん組織からsEVを濃縮する一般的なプロセスを示しています。組織の細胞間空間におけるsEVは、組織の切断と酵素加水分解によって完全に放出されます。さらに、消化液を70μmのフィルターでろ過して、大きな組織片を除去します。さらに、微分遠心分離ステップ(500 × g、3,000 × g、および12,000 × g)を実行して、小さな組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス体を除去しました(図3A-C)。
高純度のsEVを得るために、表面の白色物質が除去されるまで、2つの差...

ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

この方法は、肝臓癌組織由来の小さな細胞外小胞を、古典的な差動超遠心分離によって達成されるものよりも高い純度で単離することを可能にする。この技術は、シンプルで便利で操作が簡単で、小さな細胞外小胞の研究に方法論的サポートを提供できます。まず、80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出します。アイスボックス上の10センチの細胞培養皿に約400ミリグラムの組織を入れ、メスで細かく刻みます。組織を1.5ミリリットルの消化液を含む6ウェルプレートに移します。次に、プレートを転移脱色シェーカーに置き、摂氏37度で20分間インキュベートして、肝臓がん組織を完全に解離させ、小さな細胞外小胞(sEV)を放出します。インキュベーション後、6ウェルプレートをアイスボックスに置きます。80マイクロリットルのホスファターゼ阻害剤と200マイクロリットルの完全プロテアーゼ阻害剤溶液を加えて消化を停止します。次に、消化液を2ミリリットルの遠沈管に置いた70マイクロメートルのセルストレーナーに移し、ゆっくりとろ過して大きな組織の破片を取り除きます。ろ液を500gで10分間遠心分離して小さな組織片を取り除き、新しい2ミリリットルの遠沈管に上清を回収します。上清を3, 000 gで20分間遠心分離して、細胞破片を除去します。ピペットの先端が底部の白い破片に触れるまで、上清を新しい遠心チューブに慎重に移します。残りの液体の遠心分離を繰り返した後、破片を乱すことなく上清をチューブにプールします。回収した上清を12, 000 gで20分間遠心分離し、900マイクロリットルの上清を4.7ミリメートルの超遠心管に移します。残りの液体の遠心分離を繰り返し、両方の上清を集めて同じ超遠心チューブに混合します。チューブをPBSで完全に満たします。上清を100, 000 gで60分間遠心分離します。上清を廃棄した後、超遠心チューブにPBSを充填してペレットを再懸濁する。100, 000gで60分間遠心分離を繰り返した後、ペレットを50マイクロリットルのPBSで再懸濁する。1ミリリットルの滅菌シリンジでsEV懸濁液を吸引し、0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターを通して600マイクロリットルの遠沈管にろ過します。さらなる分析のために、ろ液を摂氏80度で保管してください。ナノ粒子フローサイトメーターを使用して、sEVのサイズ分布と純度を測定します。洗浄液の量を確認してください。次に、シースと廃液のレベルの違いに注意してください。機器の主電源を20秒間オンにした後、コンピューターの電源を入れます。ソフトウェアを実行するには、機器が正しく接続されていることを示すビープ音が鳴るのを待ちます。[スタートアップ]をクリックして、カメラ、レーザー、エアポンプの電源を入れます。次に、シースフローをクリックし、起動を選択します。4 分後、[サンプルとブースト] をクリックし、[サンプルでアンロード] を選択します。30秒後、ブランクチューブをローディングプラットフォームに置きます。[サンプル] をクリックし、[ブースティング] を選択して、[サンプルでアンロード] を選択します。次に、超純水の入ったチューブを荷台に置きます。同時に、[サンプル]と[ブースト]をクリックし、続いて[シースフロー]と[パージ]をクリックします。手動操作をクリックし、粒子濃縮チューブをローディングプラットフォームに置きます。次に、[サンプル]をクリックし、[1分間ブースト]を選択し、同時に[サンプル情報]で250ナノメートルの標準蛍光シリカナノスフィアの品質管理を選択します。[サンプルからのサンプリング]を選択し、SPCMをクリックして検出器をオンにします。次に、[自動サンプリング]をクリックし、[サンプリングセット]に1.0と入力して、圧力を1キロパスカルに固定します。ツールバーをクリックし、[大信号]を選択します。レーザーの水平位置を調整し、レーザーを2マイクロメートルに設定します。次に、LとRを継続的にクリックして、信号が強く均一であることを確認します。[記録する時間]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データを Nfa ファイルに保存し、[サンプル] をクリックして [アンロード] を選択します。洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置きます。[サンプル]をクリックし、[ブースト]を選択し、1分後に[サンプル]と[アンロード]をクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。粒子サイズの標準チューブをローディングプラットフォームに置き、サンプルブーストを1分間クリックします。サンプル情報で68〜155 S16M-Exo品質管理を選択し、[サンプル]、[サンプリング]の順にクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。[記録する時間]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データを Nfa ファイルに保存し、[サンプル] をクリックして [アンロード] を選択します。洗浄液で残留物を除去した後、PBSチューブをローディングプラットフォームに置き、粒子サイズ標準チューブについて実証された手順を実行します。次に、前に示したようにキャピラリーチップを洗浄し、sEVサンプルをロードして、粒子サイズ標準チューブについて前述のデータを分析します。精製したsEVを透過型電子顕微鏡で調べたところ、カップ状の形態を持つsEVの存在が明らかになりました。sEVのフローサイトメトリーを実施した。また、粒子サイズは40〜200ナノメートルの範囲であり、平均粒子サイズは89ナノメートルでした。濃縮されたsEVの純度は68.32%であることが判明しましたCD63、CD9、TSG101などのsEVのタンパク質マーカーはウェスタンブロットによって検出されました。GM130はsEVの陰性対照マーカーとして使用され、組織細胞には見られましたが、sEVには見られませんでした。酵素消化、示差超遠心、膜ろ過のステップは、小さな細胞外小胞の純度を確保するために細心の注意を払って実行することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぶ、差動遠心分離を用いた肝癌組織由来微小細胞外小胞の高純度濃縮法。この簡便な技術はがん生物学研究と細胞間情報伝達解析に有用です。

肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法

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