Name: 組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ GPCRの二重付加カルシウム蛍光アッセイによるハイスループットスクリーニング手法。CHO-K1細胞を用いてアゴニストとアンタゴニストを同時検出し、創薬研究の効率化に貢献します。

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この研究は、USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-being賞(賞番号2022-67015-36336、PVP [プロジェクトディレクター])およびTexas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program(FY'22-23)からP.V.P.への競争的資金から支援されました。 農業生命科学部TAMUのA.W.E.S.O.M.E.教員グループは、原稿の編集を支援したことで認められています。 補足表S2 には、テキサスA&M大学のJames Sacchettini博士の研究室とTexas A&M AgriLife Researchから入手した社内のランダム低分子ライブラリからのデータが含まれています。

1. セルメンテナンス
注: R. MICROPLUS由来のキニン受容体を安定に発現するCHO-K1細胞株(BMLK3)は、Holmesらによって開発された16。細胞株の開発の詳細は、他の14箇所に提示されている。以下のすべてのステップは、クラスIIバイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で実行されます。
<ol><li> </li><li></li><li> </li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li><ol><li></ol></li><li><li></li><li><ol><li></ol></li><li> <ol><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li><li><li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq03.jpg" style="margin: auto;"></li></ol>

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<li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li>
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<li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinin+peptide+family+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li>
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</ol>

著者は開示する利益相反はありません。

HTSの目標は、膨大な数の低分子をスクリーニングすることにより、ヒット分子を特定することです。したがって、この例の結果は、従来のHTS実験のごく一部にすぎません。さらに、同定されたヒット分子は、同じ組換え細胞株および空のベクターのみを保持するCHO-K1細胞株での用量依存アッセイなどのダウンストリームアッセイで検証する必要があり、小分子を保存するために同時に実行できます。細胞毒性アッセイは、2回目の添加における応答の欠如が細胞死亡率によるものではないことを実証するのに役立ちます。他のバイオアッセイは、単離された組織の活性を検証するためにin vitroで、または小分子を生きた節足動物に適用または給餌することによって実行する必要があります。ダニキニン受容体の小分子リガンド同定の完全なパイプラインは、以前の刊行物31に見出すことができる。このパイプラインを通じて、ダニキニン受容体の合計36のアンタゴニストヒットが同定された。これらのアンタゴニストのうち3つは、組織収縮阻害アッセイでさらにテストされ、オーソログ蚊キニン受容体が発現している蚊の後腸で抗筋向性活性を示しました<su...

酵母からヒトに存在するGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、多くの生物において受容体の最大のスーパーファミリーを表しています1。それらは、動物のほぼすべての生物学的プロセスを調節する上で重要な役割を果たします。節足動物のゲノムには50〜200個のGPCRがあり、それらは最大の膜受容体スーパーファミリー2を表しています。それらは、配列の類似性と関数に基づいて、6つの主要なクラス、A〜Fに分類されます3。GPCRは、ホルモン、神経ペプチド、生体アミン、グルタミン酸、プロトン、リポ糖タンパク質、光子など、さまざまな細胞外シグナルを伝達します4。GPCRはヘテロ三量体Gタンパク質(Gα、Gβ、およびGγ)に結合して、下流のシグナルを伝達します。GαsまたはGαi/oタンパク質に結合したGPCRは、アデニリルシクラーゼを活性化または阻害することにより、細胞内の3',5'-サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)レベルをそれぞれ増加または減少させます。Gαq/11に結合したGPCRは、ホスホリパーゼC(PLC)-イノシトール-1,4,5-三リン酸(IP3)経路を活性化することにより、小胞体カルシウム貯蔵部からのカルシウム放出を誘導します。Gα12/13に結合したGPCRは、RhoGTPaseヌクレオチド交換因子5,6を活性化します。GPCRは、ヒトの薬物の50%以上と殺ダニ剤であるアミトラズ4の標的です。GPCRはこのような多様なシグナルを伝達するため、無脊椎動物特有の生理機能を破壊する新規農薬の開発の標的として期待されています。
HTSの目標は、受容体機能を調節できるヒット分子を特定することです。HTSには、アッセイ開発、小型化、自動化が含まれます7。節足動物の神経ペプチドGPCRは、発生、脱皮および異質、排泄、エネルギー動員、生殖など、ほとんどの生理学的機能に関与しています4。節足動物および後生動物の神経ペプチドGPCRのほとんどは、黒脚ダニIxodes scapularisの筋抑制ペプチドおよびSIFamide受容体など、カルシウムシグナル伝達カスケード2,6,8,9,10を介してシグナル伝達する。それらのリガンドは後腸運動アッセイにおいて拮抗的であり、SIFは収縮を誘発し、MIPはそれを阻害する11,12。黄熱病の蚊のNPY様受容体であるネッタイシマカは、13を求める女性の宿主を調節します。エクオリンカルシウム生物発光アッセイ14などの他の代替カルシウム動員アッセイと比較して、カルシウム蛍光アッセイは実行が容易であり、他の組換えカルシウム検出タンパク質のトランスフェクションを必要とせず、費用効果が高い。カルシウム蛍光アッセイは、エクオリンカルシウム生物発光アッセイ14、15で得られた高速速度論的シグナルと比較して延長シグナルを生成する。
この例では、牛熱ダニ由来のキニン受容体であるリピセファルスマイクロプラスをCHO-K1細胞株で組換え発現させ、カルシウム蛍光アッセイに使用しました。R.マイクロプラスに見られるキニン受容体遺伝子は1つだけです。受容体は、Gqタンパク質依存性シグナル伝達経路を介してシグナルを送り、カルシウム貯蔵から細胞内空間16へのCa2+の流出を引き起こす。このプロセスは、カルシウムイオンと結合すると蛍光シグナルを誘発する蛍光色素によって検出および定量できます(図1)。
キニン受容体は無脊椎動物特異的GPCRであり、クラスAロドプシン様受容体に属する。キニンは、軟体動物、甲殻類、昆虫、およびアカリに存在する古代のシグナル伝達神経ペプチドです4,17,18。鞘翅目(甲虫)はキニンシグナル伝達システムを欠いています。蚊のネッタイシマカでは、3つのエデスキニンに結合するキニン受容体は1つだけですが、ショウジョウバエメラノガスターは、ドロソキニンを固有のリガンドとして持つキニン受容体を1つ持っています19,20,21。脊椎動物には相同なキニンやキニン受容体はありません。キニンの正確な機能はダニでは不明ですが、R. microplusのキニン受容体RNAiサイレンシングされた雌は、生殖適応度が大幅に低下しています22。キニンは昆虫の多面性ペプチドです。ショウジョウバエメラノガスターでは、それらは中枢および末梢神経調節系23、前泄化24、摂食25、代謝26、および睡眠活動パターン26,27、ならびに幼虫の移動28の両方に関与している。キニンは、蚊A.エジプト29,30,31の後腸収縮、利尿、および摂食を調節します。キニンペプチドは、保存されたC末端ペンタペプチドPhe−X1−X2−Trp−Gly−NH2を有し、これは生物学的活性32のために必要最小限の配列である。節足動物の特異性、内因性リガンドのサイズが小さいため、低分子干渉を受けやすいこと、および昆虫の多面的機能により、キニン受容体は害虫駆除の有望な標的となっています4。
「二重付加」アッセイ(図2)は、同じHTSアッセイ15におけるアゴニストまたはアンタゴニストの同定を可能にする。これは、創薬のために製薬業界で一般的に使用されている「二重付加」アッセイから適応されています33。簡単に言えば、細胞プレートへの薬物の最初の添加は、溶媒制御の適用と比較してより高い蛍光シグナルが検出されたときに、化学ライブラリー内の潜在的なアゴニストの同定を可能にする。これらの小分子とのインキュベーションの5分後、既知のアゴニスト(キニンペプチド)をすべてのウェルに適用します。薬物プレートからアンタゴニストを無作為に受けたウェルは、最初の添加で溶媒を受け取ったコントロールウェルと比較して、アゴニスト添加時に低い蛍光シグナルを示します。次いで、このアッセイは、同じ細胞を有する潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの同定を可能にする。標準的なHTSプロジェクトでは、これらのヒット分子は、用量反応アッセイおよび追加の生物学的活性アッセイによってさらに検証されますが、ここには示されていません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> 図1:カルシウム蛍光アッセイ機構の説明図。Gqタンパク質は、細胞内カルシウムシグナル伝達経路をトリガーします。キニン受容体(Gタンパク質共役型受容体)をCHO-K1細胞で組換え発現させた。アゴニストリガンドが受容体に結合すると、キニン受容体に関連するGqタンパク質がPLCを活性化し、これがPIP2分子のIP3およびDAGへの変換を触媒する。次に、IP 3は小胞体表面のIP3 Rに結合し、Ca2+が細胞質に放出され、そこでCa2+イオンが蛍光色素に結合して蛍光シグナルを誘発します。蛍光シグナルは、490 nmでの励起によって得られ、514 nmで検出されます。略語:GPCR = Gタンパク質共役型受容体;PLC = ホスホリパーゼC;PIP2=ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸;IP3 =イノシトール三リン酸;DAG =ジアシルグリセロール;IP3 R = IP3受容体。BioRender.com で作成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> 図2:CHO-K1細胞で発現するGタンパク質共役型受容体上の低分子のハイスループットスクリーニングのワークフロー。 (A)キニン受容体を安定に発現する組換えCHO-K1細胞を、リキッドハンドリングシステム(25μL/ウェル)を用いて384ウェルプレート(10,000細胞/ウェル)に添加し、加湿したCO2インキュベーターで12〜16時間インキュベートした(B)蛍光色素を含むアッセイバッファー(25 μL/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用して細胞プレートに加えました。プレートを37°Cで30分間インキュベートし、RTでさらに30分間平衡化した。 (C)各ウェル内の細胞のバックグラウンド蛍光シグナルをプレートリーダーで測定した。(D)384ウェルライブラリープレートからの薬物溶液とブランク溶媒(すべて0.5 μL/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用して細胞アッセイプレートに加えました。(E)細胞性カルシウム蛍光応答は、薬物溶液の添加直後にプレートリーダーで測定され、平均よりも高い蛍光シグナルを惹起する化合物をアゴニストヒットとして選択した。GPCRをブロックするアンタゴニストヒット(下のアイコン)は、ステップGの間にペプチドアゴニストを添加した後に明らかにされた。(f)同じアッセイプレートにおいて、スクリーニング化合物と共に細胞を5分間インキュベートした後、ダニキニン受容体の内因性アゴニストペプチドRhimi-K-1(QFSPWGamide)を各ウェル(1μM)に添加した。(g)アゴニストペプチド添加後の細胞蛍光応答を直ちにプレートリーダーにより測定した。蛍光シグナルを阻害する化合物をアンタゴニストヒットとして選択した。略語:GPCR = Gタンパク質共役型受容体;RT =室温;RFU = 相対蛍光単位。BioRender.com で作成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15050-065</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td>0.4% トリパンブルー</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154</td><td>液体、滅菌</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM12400</td><td>RNase-free マイクロフュージチューブ</td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペット</td><td>Corning</td><td>29443-045</td><td>Corning Costar Stripette 個別包装&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mL血清学的ピペット</td><td>Corning</td><td>29443-047</td><td>Corning Costar Stripette 個別包装&nbsp;</td></tr><tr><td>15mLコニカルチューブファ</td><td>ルコン</td><td>352196</td><td>滅菌20</td></tr><tr><td>&マイクロ;Lフィルターチップ</td><td>USA Scientifc Inc.</td><td>P1121</td><td>滅菌、バリア</td></tr><tr><td>25 mL 血清学的ピペット</td><td>Corning</td><td>29443-049</td><td>Corning Costar Stripette 個別包装&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430828</td><td>目盛り付き、滅菌済み</td></tr><tr><td>150 mL オートフレンドリーリザーバー</td><td>インテグラバイオサイエンス</td><td>6317</td><td>滅菌済み、1日目の細胞播種用に個別に包装</td></tr><tr><td>150 mL オートフレンドリーリザーバー</td><td>インテグラバイオサイエンス</td><td>6318</td><td>滅菌済み、積み重ねられ、2日目に色素をロード用</td></tr><tr><td>384/12.5 &micro;L 低保持チップ</td><td>Integra Bioscience</td><td>6405</td><td>ロング、滅菌フィルター</td></tr><tr><td>384/12.5 &micro;Lチップ</td><td>インテグラバイオサイエンス</td><td>6404</td><td>ロング、滅菌</td></tr><tr><td>フィルター384ウェルプレート</td><td>グライナー 781091</td><td></td><td>CELLSTAR、透明ポリスチレン、&マイクロ;クリア、ブラック/フラット</td></tr><tr><td>アルミニウム プレート シール</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td>ポリエステル</td></tr><tr><td>ベース アルミ ホイル ラップ</td><td>ウォルマート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオサフティ キャビネット II</td><td>NuAire</td><td>NU-540-300</td><td></td></tr><tr><td>セル カウンター</td><td>Nexcelom</td><td>AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>セル カウント スライド</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>20 & マイクロ;Lチャンバー</td></tr><tr><td>CO2加湿インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>フォーマシリーズII</td><td></td></tr><tr><td>デスクランプ</td><td>SunvaleeyTEK</td><td>RS1000B</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ドミリポアシグマ</td><td>276855</td><td>無水、>99.9%</td></tr><tr><td>薬剤プレート</td><td>コーニング</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS、カルシウムとマグネシウムなしの1x</td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>Koptec</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>F-12K栄養混合物&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>45000-354</td><td>(Kaighn's Mod.) と L-グルタミン</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Equitech-Bio</td><td>SFBU30</td><td></td></tr><tr><td>蛍光カルシウムアッセイキット</td><td>ENZO ライフサイエンス</td><td>ENZ-51017</td><td>10x96 試験</td></tr><tr><td>G418 硫酸塩</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10131-027</td><td>ジェネチシン選択的抗生物質 50 mg/mL</td></tr><tr><td>ハンク緩衝液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>55037C</td><td>HBSS修飾、カルシウム付き、マグネシウム付き、フェノールなし</td></tr><tr><td>HEPESバッファー</td>読み取りなし <td>Gibco Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>1モル</td></tr><tr><td>HTSデータストレージプレートフォーム</td><td>CDDボールト&nbsp;</td><td></td><td>https://www.collaborativedrug.com/</td></tr> <tr><td>リキッドハンドリングシステム</td><td>インテグラ バイオサイエンス</td><td>ビアフロ</td><td>384/12.5 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>プレート遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ソルバル ST8</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BMGテクノロジー</td><td>クラリオスター</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>リミ-K-1 アゴニストペプチド</td><td>ジェンスクリプト</td><td>カスタムオーダー</td><td>QFSPWGamide</td></tr><tr><td>T-75 フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353136</td><td></td></tr></tbody></table>

組換えgタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、受容体の最大のスーパーファミリーであり、多くのヒト薬物の標的となっています。GPCRに対するランダム低分子ライブラリーのハイスループットスクリーニング(HTS)は、製薬業界で標的特異的創薬に使用されています。この研究では、HTSを使用して、無脊椎動物特異的神経ペプチドGPCRの新規低分子リガンドを、致命的なヒトおよび獣医病原体のベクターの生理学的研究のためのプローブとして同定しました。
無脊椎動物特異的キニン受容体は、利尿、摂食、消化など、無脊椎動物の多くの重要な生理学的プロセスを調節するため、標的として選択されました。さらに、多くの無脊椎動物GPCRの薬理学は、十分に特徴付けられていないか、まったく特徴付けられていません。したがって、他の後生動物、特にヒトにおける関連するGPCRに関するこれらの受容体群の鑑別薬理学は、スーパーファミリーとしてのGPCRの構造活性関係に知識を追加します。HTSアッセイは、ウシコレラダニまたはミナミウシマダニ、 Rhipicephalus microplusからのキニン受容体のリガンドの発見のために、384ウェルプレート中の細胞用に開発されました。このダニキニン受容体はCHO-K1細胞で安定に発現していた。
キニン受容体は、内因性キニン神経ペプチドまたは他の小分子アゴニストによって活性化されると、カルシウム貯蔵から細胞質へのCa2+ 放出を引き起こす。「二重付加」アプローチと組み合わせたこのカルシウム蛍光アッセイは、同じアッセイプレート内の機能的アゴニストおよびアンタゴニスト「ヒット」分子を検出することができます。各アッセイは、320個のランダムな小分子のアレイを担持した薬物プレートを用いて実施した。0.7の信頼性の高いZ'因子が得られ、HTSが2μMの最終濃度にあるときに3つのアゴニストヒット分子と2つのアンタゴニストヒット分子が同定されました。ここで報告されるカルシウム蛍光アッセイは、Ca2+ シグナル伝達カスケードを活性化する他のGPCRをスクリーニングするように適合させることができる。

例として、320個のランダムな小分子で構成される社内の薬物プレート(SAC2-34-6170)を使用して、このHTSアッセイを実証しました。HTSは、Z'係数が0.7と優れたアッセイ品質を有していました(表1)。このZ'因子は、試験化合物34とは無関係のアッセイ品質を反映する。0.5以上のZ′係数は、ポジティブコントロールとネガティブコントロールのRFU間のアッセイシグナルダイナミックレンジが良好であることを示します。Z'係数が0.5未満のアッセイは、シグナルダイナミックレンジが最適ではなく、通常はヒット選択に有益ではないため、破棄されます。陽性対照からの応答(相対蛍光単位、RFUで測定)(64の陽性対照の応答の平均RFU、μc+ = 130,139)は、陰性対照のそれよりも平均19倍高かった(64の陰性対照の応答の平均RFU、μc- = 6,675)。ここで「アゴニストヒット」を選択するためのカットオフ蛍光は、正規化パーセント活性化(NPA)最大比&gt;50%に設定...

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、 CHO-K1細胞で発現している。このアッセイは、1つの「二重付加」アッセイで同じ細胞を使用するアゴニストとアンタゴニストを同定する。

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

ハイスループットスクリーニングカルシウム蛍光二重付加アッセイは、細胞内カルシウムカスケードを介してシグナル伝達するGタンパク質共役型受容体の新規低分子リガンドの同定を可能にします。二重付加アッセイの主な利点は、蛍光シグナルが2分間続く同じ細胞を用いた単一のアッセイでアゴニストおよびアンタゴニストHTSを検出できることである。この方法は、カルシウムカスケードを介してシグナルを伝達する任意のGPCRに適用することができ、これは、ほとんどの節足動物ニューロンペプチドファミリーである、GPCRsを含む。アッセイの再現性のためには、第2版の既知のアゴニストの細胞密度、注入速度、および濃度を最適化することが重要です。手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるビアンカ・エンリケス・サントスです。カルシウム蛍光アッセイは、70〜90%コンフルエントなBMLK3細胞を含むT−75フラスコから使用済み培地を除去することによって開始する。10ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSで細胞を洗浄します。DPBSを除去した後、2ミリリットルの0.25%トリプシンエチレンジアミン四酢酸またはEDTAを使用して細胞を剥離し、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。8ミリリットルの選択培地を加え、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。細胞懸濁液を1000 x gで3分間遠心分離する前に。上清を廃棄し、1%ウシ胎児血清またはFBSおよび1ミリリットルあたり400マイクログラムのG418硫酸塩を含む10ミリリットルのF-12K培地に細胞ペレットを再懸濁します。さらに希釈するために懸濁液の細胞密度を決定するには、20マイクロリットルの細胞懸濁液を20マイクロリットルの0.4%トリパンブルーに混合し、次に20マイクロリットルの混合物を細胞計数チャンバーにロードして、細胞密度についてセルカウンターで読み取る。同じF-12K培地を使用して細胞懸濁液を希釈し、ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の4倍の密度で最終容量を15ミリリットルに構成します。細胞をPoly−DリジンまたはPDLコード化された384ウェルプレートに播種する。液体処理システムを使用して、25マイクロリットルの希釈細胞懸濁液をプレートの384ウェルに加えます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、加湿インキュベーター内で5%二酸化炭素をインキュベートします。翌日、90%コンフルエントな384ウェルプレートをすばやく反転させます。使用済み培地を除去し、滅菌ペーパータオル上で2〜3回穏やかに吸い取り、プレートからすべての液体を除去します。バイオセーフティキャビネット内の柔らかい薄暗いライトで次のステップを実行します。次に、液体処理システムを使用して、毎秒3.8マイクロリットルの吸引および分注速度で12.5マイクロリットルを各ウェルに分注することにより、25マイクロリットルのローディング染料を各ウェルに追加します。このピペッティングステップを繰り返して、各ウェルの最終容量25マイクロリットルに到達します。完了したら、プレートをアルミホイルで覆い、周囲光から保護し、二酸化炭素加湿インキュベーター内で摂氏37度で30分間インキュベートします。カバープレートをさらに30分間平衡化した後、細胞はハイスループットスクリーニングまたはHTSの準備が整います。次に、薬剤プレートをプレート遠心分離機で1200 x gで1分間遠心分離します。Rhimi-K-1の10倍アゴニストペプチド溶液を150ミリリットルの自動対応リザーバーに移します。プレートリーダーで、[プロトコルの管理]をクリックします。次に、エンドポイント蛍光強度プロトコルで、Flow Forteプレリードを選択し、測定開始をクリックして、HTSアッセイ全体のバックグラウンドシグナルを測定します。セルプレートをプレートリーダーに挿入します。インストルメントパネルで、プレート上のランダムなウェルをクリックしてから、新しいフォーカスの高さをクリックします。フォーカス調整をクリックします。ゲイン調整をクリックします。測定可能な最大蛍光値の5%から10%として割り当てます。[調整の開始] をクリックします。[測定開始]をクリックして、相対蛍光単位またはRFUのバックグラウンド蛍光シグナルについてプレート全体を読み取ります。プレートの読み取り中に、現在の状態をクリックして、リアルタイムの読み取り値を確認します。二重添加アッセイでは、リキッドハンドリングシステムを使用して10マイクロリットルの薬液を3回上下にピペットし、毎秒1.0マイクロリットルの吸引速度で薬物プレートの各ウェルから1.5マイクロリットルを吸引します。0.5マイクロリットルの化合物をセルアッセイに分注し、0.2%ジメチルスルホキシドまたはDMSOで2マイクロモルの最終濃度に達します。スクリーニング化合物を添加した後、アッセイプレートを直ちにプレートリーダーに入れます。プリセットの読み取りプログラムをクリックして、プレートを順方向と逆方向の読み取り方向に読み取ります。チップに残っている1マイクロリットルの薬液を、約50ミリリットルのDPBSを含む150ミリリットルの廃棄物リザーバーに浸して廃棄します。スクリーニング化合物を細胞と一緒に、ライトを消した状態でバイオセーフティキャビネットのプレートリーダー内の時間を含めて、合計5分間インキュベートします。次に、384個の12.5マイクロリットルのチップを使用して、リザーバーから3マイクロリットルのアゴニストペプチドRhimi-K-1をリザーバーからアッセイプレートに追加します。プレートをすぐにプレートリーダーに入れます。プリセットの読み取りプログラムをクリックして、プレートを順方向と逆方向の読み取り方向に読み取ります。手動で各プレートアッセイの品質管理のためのZ'factorを計算します。オンラインHTSデータプラットフォームのヒートマップからヒット分子を手動で選択し、正規化された活性化率またはNPAおよび阻害活性、またはアゴニストヒットおよびアンタゴニストヒットのI0を計算します。このHTSアッセイを実証するために、320個のランダムな小分子で構成される社内の薬物プレートSAC2-34-6170を使用しました。HTSは、テストされた化合物に依存しないアッセイ品質を反映して、0.7のZ'factorで優れたアッセイ品質を有していました。アゴニストを添加した直後にプレートを読み取ることは、蛍光シグナルが短命であるため、必須である。この手順の後、同定されたヒット分子は、用量反応アッセイを通じて検証され、オフターゲットヒットを排除するために標的GPCRを発現しない細胞で試験されるべきである。

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組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

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