Name: 健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ、ヒトiPS細胞から網膜オルガノイドを作製する方法。接着培養と浮遊培養を組み合わせ、網膜疾患モデルや再生医療への応用を可能にする効率的なプロトコルを解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、遺伝学者のチトラ・カンナビラン博士からの科学的および技術的支援を認めています。スバドラ・ジャラリ博士、網膜コンサルタント;ミリンド・ナイク博士、眼球形成外科医;ハイデラバードのLVプラサド眼科研究所の眼腫瘍医であるスワティカリキ博士は、正常および患者固有のiPS細胞株の生成に向けて取り組んでいます。著者らは、科学技術省(IM)、(SB/SO/HS/177/2013)、バイオテクノロジー省(IM)、(BT/PR32404/MED/30/2136/2019)、およびインド政府のICMR(S.M.、D.P.)、UGC(T.A.)、CSIR(V.K.P.)の上級研究員からのR&D助成金を認める。

<ol><li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+visual+impairment+in+India%3A+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li>
<li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li>
<li>RetNet - Retinal Information Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022).</li>
<li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa%3A+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361(2019).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li>
<li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882(2018).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047(2014).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

すべての著者には、利益相反や財務開示はありません。

hiPS細胞は、in vitroで臓器や組織の発達を研究するための強力なツールです。健康なhiPS細胞と疾患特異的なhiPS細胞を網膜系統に分化させることによって疾患表現型を再現することは、さまざまな形態の遺伝性網膜ジストロフィーの病態生理学に関する新しい洞察を得るのに役立ちます。PSCの網膜細胞型へのインビトロ分化のために、いくつかのプロトコルが記載され、採用されている。それらのほとんどは、組換え成長因子、サプリメント、小分子、およびN1、N2、およびB27サプリメントなどの試薬の複雑なカクテルを含む培養培地の使用を含みます。ノギン、SB431542、LDN193189、フォリスタチンなどのBMPおよびTGFβシグナル伝達遮断薬、またはアクチビンA、レフティ、IDE1などの誘導物質。DKK1、SFRP、IWP-2、IWR-1-endoなどの標準的なWntシグナル伝達遮断薬、またはCHIR99021、SB216763、CKI-7などの誘導物質。PD0325901およびPD173074などのFGF受容体シグナル伝達遮断薬、またはbFGFなどの誘導物質;DAPTなどのノッチシグナル伝達阻害剤;インスリン様...

網膜は脊椎動物の目の後ろに存在する光感受性組織であり、光伝達経路として知られる生化学的現象によって光信号を神経インパルスに変換します。網膜の視細胞で生成された最初の神経インパルスは、他の網膜介在ニューロンと網膜神経節細胞(RGC)に形質導入され、脳の視覚野に到達し、画像知覚と視覚反応に役立ちます。
世界保健機関(WHO)によると、推定150万人の子供が失明しており、そのうち100万人がアジアにいます。遺伝性網膜ジストロフィー(IRD)は、世界中の4,000人に1人が罹患する主要な失明性疾患ですが1,2,3、加齢黄斑変性症(AMD)に関連する失明の有病率は、発展途上国では0.6%〜1.1%の範囲です4。IRDは、網膜の発生と機能に関与する300以上の異なる遺伝子の遺伝性遺伝的欠陥によって引き起こされます5。このような遺伝的変化は、正常な網膜機能の破壊と網膜細胞、すなわち光受容体細胞と網膜色素上皮(RPE)の段階的な変性をもたらし、したがって重度の視力喪失と失明につながります。角膜、水晶体などを含む他の失明状態では大きな進歩が見られました。しかし、網膜ジストロフィーと視神経萎縮症は、これまでに証明された治療法を持っていません。成人のヒト網膜には幹細胞がないため6、胚性幹細胞(ESC)や患者由来の人工多能性幹細胞(iPSC)などの代替ソースは、目的の細胞タイプを無制限に供給でき、in vitro疾患モデリング研究や再生療法の開発に必要な複雑な組織オルガノイドの開発に大きな期待を寄せています7。8,9,10。
数年の網膜研究により、初期の網膜発生を調整する分子イベントの理解が深まりました。PSCから網膜細胞と3Dオルガノイドを生成するためのほとんどのプロトコルは、成長因子と低分子の複雑なカクテルで細胞を培養して既知の生物学的プロセスを段階的に調節することにより、これらの発生イベントをin vitroで再現することを目的としています。このようにして生成された網膜オルガノイドは、主要な網膜細胞、すなわち網膜神経節細胞(RGC)、介在ニューロン、光受容体、および網膜色素性上皮(RPE)で構成されています11,12,13,14,15,16,17,18,19.網膜オルガノイドを用いたIRDのモデリングは成功しているが、分化中の成長因子と低分子の複雑なカクテルの必要性と網膜オルガノイド生成の比較的低い効率は、ほとんどのプロトコルで大きな課題となっている。それらは主に胚様体の形成とそれに続くin vitro発生の異なる段階での複雑な培養条件を使用した網膜系統への段階的な分化を含む20,21,22。
ここでは、健常対照および網膜疾患特異的なhiPS細胞から複雑な3D神経-網膜オルガノイドを開発するための簡単で堅牢な方法が報告されています。ここで説明するプロトコルは、胚様体形成を必要とせずに、ほぼコンフルエントなhiPS細胞培養物の直接分化を利用します。また、培地の複雑さが簡素化され、新しい研究者が簡単に採用できる費用対効果と再現性の高い技術になります。これには、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムが含まれます。さらに、各EFP内の円形の神経網膜島を手動でピックし、浮遊培養で1〜2週間増殖させて、PAX6+およびCHX10+増殖神経網膜前駆体からなる多層3D網膜カップまたはオルガノイドを調製します。100 μMタウリン含有培地中での網膜オルガノイドをさらに4週間延長培養すると、RCVRN+およびCRX+光受容体前駆体と、初歩的な内部セグメントのような伸長を有する成熟細胞が出現しました。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m シリンジフィルター</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離チューブ</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>抗 Chx10 抗体;マウスモノクローナル</td><td>Santa Cruz</td><td>SC365519</td><td>1:50</td></tr>希釈<tr><td>抗CRX抗体;ウサギモノクローナル</td><td></td><td>Abcam ab140603</td><td>1:300</td></tr>希釈<tr><td>抗MiTF抗体、マウスモノクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab3201</td><td>1:250</td></tr>希釈<tr><td>抗回復抗体;ウサギのポリクローナル&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>1:300</td></tr>希釈<tr><td>B-27サプリメント(50倍)、無血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar(50 mL)</td><td>Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (基礎培地)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco's リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 中型キット</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Not TC-treated Treated Pedri Dish, 60 mm&nbsp;</td><td>コーニング351007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェタル&nbsp;ウシ&nbsp;血清、認定済み、米国&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+ と Image ラボ ソフトウェア</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>Agarose Gel ドキュメンテーション システム&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>1:300 希釈</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>1:300 希釈</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>1:300 希釈</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L),Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:300 希釈</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td></td><td>切片化ノ</td></tr><tr><td>ックアウト用 血清 補充</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Acsorビン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2サプリメント (100個)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>To quantify RNA</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Qualigens</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー15140-122</td><td></td></tr><tr><td>組換え抗Otx2抗体、ウサギモノクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab183951</td><td>1:300希釈</td></tr><tr><td>組換え抗PAX6抗体;ウサギモノクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>1:300</td></tr>希釈<tr><td>組換え抗RPE65抗体、ウサギモノクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab231782</td><td>1:300</td></tr>希釈<tr><td>組換えヒトNogginタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 10 mL</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 5 mL</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>スターフロスト (シランコーティング) 顕微鏡スライド</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI&nbsp;</td><td>ベクター研究所</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩(Rhoキナーゼ阻害剤)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr></tbody></table>

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

多能性幹細胞は、in vitro疾患モデリング研究や再生医療の開発に役立つ複雑な組織オルガノイドを生成することができます。このプロトコルは、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの間に、付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムで網膜オルガノイドを生成する、より簡単で堅牢かつ段階的な方法について説明しています。さらに、各EFP内のドーナツ型、円形、および半透明の神経網膜島を手作業でピックし、網膜分化培地中の非付着培養皿を使用して懸濁下で1〜2週間培養して、多層3D光学カップ(OC-1M)を生成します。これらの未熟な網膜オルガノイドには、PAX6+およびChX10+が増殖する多能性網膜前駆体が含まれています。前駆細胞はオルガノイド内で直線的に自己組織化しており、明確な放射状の縞模様として現れます。浮遊培養後4週間で、網膜前駆細胞は有糸分裂後停止および系統分化を経て、成熟網膜オルガノイド(OC-2M)を形成します。光受容体系統コミット前駆体は、網膜オルガノイドの最外層内に発達する。これらのCRX+およびRCVRN+光受容体細胞は、形態学的に成熟し、内部セグメントのような伸長を示します。この方法は、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を用いた網膜オルガノイドの作製に採用できます。すべてのステップと手順は、再現性を確保し、基礎科学およびトランスレーショナルリサーチにおけるより広いアプリケーションのために明確に説明および実証されています。

hiPS細胞の眼系統への分化は、図1に示すように、サプリメントと成長因子を含む培養培地の異なるカクテル中で細胞を異なる時点で順次培養することによって達成されます。このhiPSC培養物は、多能性幹細胞維持培地であるエッセンシャル8培地で維持される。70%〜80%のコンフルエンシーに達したら(図2A)、培地は0日目に分化誘導培地(DIM)に交換されます(ステップ3.2を参照)1 ng / mL bFGF、1 ng / mLノギン、および1%N2サプリメント。神経誘導N2サプリメントとともに、BMPシグナル伝達阻害剤であるNogginは、中胚葉および内胚葉の関与をブロックすることにより、細胞を神経外胚葉系譜に向ける上で重要な役割を果たします。1日目、2日目、および3日目に、Nogginの濃度が10 ng / mLに増加します(ステップ3.3および3.4を参照)。4日目から、DIMを網膜分化培地(RDM)に交換し(ステップ3.5)、培養液を...

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

このプロトコルは、研究および再生アプリケーションのために、ヒトIPCを複雑な3次元神経網膜オルガノイドに分化させる簡単で効率的な方法を説明しています。この技術には、接着培養と浮遊培養の両方が含まれ、網膜オルガノイドとRP細胞の両方を選択的にピッキングして濃縮することができます。網膜変性疾患の細胞ベースの治療法を開発するための細胞源の実行可能で定期的な供給を提供することができます。このような幹細胞由来網膜オルガノイドやRPE細胞は、眼の発達や遺伝性網膜疾患を研究するためのin vitroモデルとして有用である。この方法は、ヒトIPSC培養の取り扱いにすでに精通している研究室でも簡単に再現できます。視覚的デモンストレーションは、眼野の識別と、空間的位置と形態学的特徴に基づく神経網膜カップの分離を大幅にサポートします。まず、使用済み培地を70〜80%コンフルエントなヒトIPSC培養液を6ウェルプレートで吸引します。PBSをウェルに加え、それらを回転させ、洗浄バッファーを吸引します。次に、1ミリリットルの細胞解離溶液またはCDSを各ウェルに加え、細胞が切り上げられるまでプレートを摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。CDSを吸引し、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠沈管に回収します。チューブを室温で4分間1, 000 RPMで回転させます。上清を廃棄し、細胞ペレットを1.2ミリリットルのエッセンシャル8培地に再懸濁します。1.5ミリリットルのIPSC培地と10マイクロモルのY27632を含むマトリックスコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。12〜24時間後、使用済みの培地を取り除き、培養を維持するためにY27632を含まない予熱した完全上昇培地を追加します。培養液が70〜80%のコンフルエントに達するまで、24時間ごとに培地を交換します。0日目に、ヒトIPSC維持培地を吸引し、1ミリリットルのBFGFあたり1ナノグラムと1ミリリットルのNogginあたり1ナノグラムを含む分化誘導培地を6ウェルプレートに追加します。5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞をインキュベートします。初日目に、使用済み培地を吸引し、1ミリリットルのBFGFあたり1ナノグラムと1ミリリットルのノギンあたり10ナノグラムを含む分化誘導培地を追加します。5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞を再びインキュベートします。2日目と3日目に、使用済みの培地を取り除き、1ミリリットルあたり10ナノグラムのNogginを含む分化誘導培地を追加します。6ウェルプレートに1ウェルあたり2ミリリットルの培地を加えた後、5%二酸化炭素インキュベーター内で細胞を摂氏37度でインキュベートし、24時間ごとに培地を交換します。4日目に、使用済みの培地を取り除き、網膜分化培地またはRDMを追加します。同じ手順に従って、ウェルあたり2ミリリットルの培地を6ウェルプレートに追加し、培養液をインキュベートします。培地は毎日交換してください。14日目と18日目頃に、初期の眼野前駆細胞からなる神経ロゼット様ドメインの出現について、10倍の倍率で顕微鏡下で培養を観察します。21日目と28日目頃に、4倍と10倍の倍率で顕微鏡下で培養物を観察し、神経上皮と眼表面上皮の連続した成長に囲まれた円形の3D神経網膜構造の中央島を持つ自己組織化された異なるEFPの出現を観察します。滅菌パスツールピペットを取り、片手でベースを持ち、もう片方の手でキャピラリーチップを持ちます。ガラスが柔軟になるまで、キャピラリーチップの中央近くの領域を回転運動で火炎滅菌および加熱します。次に、炎から離れ、キャピラリーチップをすばやく外側に引っ張って、閉じたルーメンを持つ細かいキャピラリーチップを作成します。細い先端を炎の前で水平に持ち、外側にすばやく炎に通して、滑らかなフックまたはL字型の毛細管先端を作成します。実体顕微鏡下で、キャピラリーフックの滑らかな外側曲率ゾーンを細かいスクープとして使用して、個々のEFPから整形式の神経網膜カップを手動で選択します。25日目と30日目に、4ミリリットルの事前に温めた網膜分化培地を低付着性60ミリメートルディッシュに入れて培養し、3D網膜オルガノイドを生成するための網膜カップを維持します。これは、神経網膜カップを収穫する前に行う必要があります。1ミリメートルのマイクロピペットを100マイクロリットルの吸引にセットし、広い口径開口部を持つ1ミリリットルのマイクロチップを使用して吸引し、浮遊する網膜カップを吸引し、以前に準備した新鮮な低付着性培養皿に移します。網膜カップを非付着性浮遊培養としてRDMに維持し、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートします。30日目と45日目に、部分供給法に従って、使用済み培地の半分の容量を取り除き、等量の新鮮な培地と交換します。45日目と60日目に、100マイクロモルのタウリンを含むRDMで網膜オルガノイドをさらに2週間培養し、神経網膜前駆細胞のより良い生存と系統分化、および成熟網膜細胞タイプの発達をサポートします。網膜オルガノイドは、RT-PCRおよび免疫組織化学を用いて、いくつかの網膜前駆細胞マーカーの発現について、成熟のさまざまな段階で特徴付けられます。RT-PCRの結果、1ヶ月齢の網膜オルガノイドと2ヶ月齢の網膜オルガノイドにおける神経網膜マーカーの誘導と発現が確認されました。神経網膜前駆マーカーChx10、PAX6、Otx2に対する抗体を用いた未熟網膜オルガノイドの免疫標識切片と、視細胞前駆体マーカーリカバーインおよびCRXに対する抗体を用いた成熟網膜オルガノイドの共焦点画像を示します。分化した光受容体細胞を有する網膜オルガノイドの顕著な最外層がズームされ、これらの画像に示される。初歩的な内部セグメントのような延長は白い矢印でマークされています。EFPクラスターは、神経網膜カップを中心に、RPEの成長物の移動は、前縁に沿って色素沈着を示します。神経網膜島周辺の複数のEFPからの高分化色素性上皮成長がここに示されています。EFPのより高い倍率は、RPE前駆細胞の遊走帯および神経網膜カップを囲む眼表面上皮を示す。色素細胞と非色素細胞の両方を含む未熟RPE細胞の単層を発達させた拡張接着培養をここに示します。完全に成熟した色素性RPE細胞の単層培養は、60日目に石畳の形態を示します。PAX6、MITF、およびRPE65を発現するRPE細胞をこの図に示します。これらの画像は、歪んだ積層と縞模様の欠如を伴う網膜前駆細胞の異常な凝集体を有するEFPを表しています。ミニチュア神経網膜カップを有するが、RPEおよび眼表面上皮の周囲領域を欠いているEFPがこの図に示されている。代表的な画像は、浮遊培養で形成された不規則な神経網膜凝集体を示しています。3〜4週間以内に眼野の効率的な誘導を達成するためには、IPCのほぼコンフルエントな成長培養物を使用して分化プロセスを開始することが非常に重要です。正常および患者特異的IPCから生成された網膜オルガノイドおよびRPE細胞は、網膜疾患モデルとして、また新規治療薬の試験に使用できます。

generation-retinal-organoids-from-healthy-retinal-disease-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

多能性幹細胞から特殊な網膜細胞の生産は、網膜疾患の幹細胞を用いた治療法の開発のターニング...

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

ここでは、成熟ヒト網膜オルガノイドを生成し、それらを光受容体毒性アッセイに利用して、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の医薬品候補を特定するための段階的なプロトコルを紹介します。...

創薬のためのヒト網膜オルガノイドの毒性スクリーニング

自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。...

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。...

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。...

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。...

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ここで紹介する方法は、多能性幹細胞からのヒト肝細胞様細胞を生成するための拡張性と優れた製造基準（GMP）-Readyビデオ分化システムを記載しています。これは、基礎および応用ヒト肝臓研究のためのヒト肝細胞様細胞を生成するために、費用対効果の高い標準化されたシステムとして機能します。...

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

学ぶ、ヒトiPS細胞から網膜オルガノイドを作製する方法。接着培養と浮遊培養を組み合わせ、網膜疾患モデルや再生医療への応用を可能にする効率的なプロトコルを解説します。

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

さらに動画を探す