Name: 新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 学ぶ 3Dプリントホルダーを用いた無傷のex vivo眼球の生細胞イメージング法。マウス角膜上皮のカルシウムシグナルと細胞移動をリアルタイムで観察し、傷治癒メカニズムの解明に貢献します。

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RO1EY032079 (VTR)、R21EY029097-01 (VTR)、1F30EY033647-01 (KS)、および 5T32GM008541-24 (KS) の無償資金協力に感謝いたします。また、マサチューセッツ・ライオンズ眼科研究基金とニューイングランド角膜移植基金にも感謝します。

動物被験者を含む手順は、眼科ケアおよび視覚研究における動物の使用のための視覚眼科学研究協会およびボストン大学IACUCプロトコル(201800302)によって承認されました。
1. 3Dプリントされたホルダーとカバーバーの設計
<ol><li>マウスグローブの平均直径を考慮して3Dプリントされたホルダーとカバーバーを設計し、デザインを3Dプリントします(図1A、B)。</li>
	<li>ホルダーの内壁の直径を地球の平均直径よりわずかに大きくして、個々のマウスのサイズの違いを考慮してください。ホルダーの高さを地球の直径の約半分に保ち、3Dプリントされたカバーバーで固定したときに地球儀がしっかりとフィットするようにします。</li>
	<li>ホルダーカバーバーのサイズをホルダーの外径の長さに合わせ、幅はホルダー直径の1/4〜1/2にします。カバーバーは、水分補給と実験終了時の目の除去のためにホルダーに固定されたときに地球にアクセスできるようにサイズになっています。</li>
	<li>ホルダーとカバーバーを印刷します。</li>
</ol>2. サンプル収集
<ol><li>施設のガイドラインに準拠して確立されたプロトコルを使用して、マウス(9〜12週齢および27週齢の雄C57BL / 6マウスがこの研究に使用されました)を安楽死させます。このプロトコルでは、二酸化炭素による安楽死とそれに続く斬首を行います。</li>
	<li>マウスの頭を取り外し、すぐに氷の上に置いて組織の生存率を維持します。組織の損傷を防ぎながら、解剖ツールを使用して地球儀を除核します。</li>
	<li>ピンセットを使用して地球を支えます。ピンセットで保持されている場所のすぐ下に解剖ハサミを使用して視神経をクリップします。 注意: その他の予防措置については、層流フードで次の手順を実行します。</li>
	<li>カルシウムインジケーターおよび/または細胞膜染色を含むp35細胞培養皿の2 mL培地でグローブを低照度条件の37°C、5%CO2 インキュベーターで1時間インキュベートします。均一な染色のために、グローブが染色媒体に沈んでいることを確認してください。<ol><li>ここで実施する実験では、カルシウムインジケーターFluo4-AM(1:100)2、および細胞膜カウンター染色、深赤色原形質膜染色(1:10,000)2を使用し、最終濃度1%(v / v)DMSOおよび0.1%(w / v)プルロン酸を2 mLのケラチノサイト無血清培地(KSFM)に次の成長サプリメントを含む:25 μg / mLウシ下垂体抽出物、 0.02 nMの上皮成長因子、0.3 mM CaCl2、およびペニシリン-ストレプトマイシン(それぞれ100単位/ mLおよび100 μg / mL)。 注:インキュベーションの条件と時間は、カルシウムインジケーター、組織の種類、およびサンプル量によって異なります。プルロン酸を使用する場合は、組織を透過性にするため注意が必要です。このプロトコルは10%プルロン酸を必要とします。低濃度のプルロン酸は実験的に効果がないと判断されており、高濃度は組織に損傷を与える危険性があります。.</li>
	</ol></li>
</ol>3. サンプルホルダーの作製
<ol><li>ホルダーを、以前に使用されていない接着剤できれいなガラス底カバーガラスに接着します。このプロトコルで使用される接着剤は、無菌性を確保するために使い捨て容器から供給され、毎回新しい未開封の容器が使用されます。</li>
	<li>ホルダーを70%エタノールで洗います。ホルダーに接着剤を置き、ホルダーをガラス底カバースリップに接着します。接着剤は蛍光を発し、イメージングを複雑にする可能性があるため、ホルダーの内側に接着剤がないことを確認してください。</li>
	<li>接着剤が固まるまで待ちます。ホルダーがカバーガラスにしっかりと固定されていることを確認します。 注:この原稿で提示された実験には、ガラス底カバーガラスを備えたP35セルプレートが使用されました。他のガラス底スライドおよび/またはプレートは、実験のニーズに基づいて代用することができる。</li>
</ol>4.アイグローブの傷
<ol><li>滅菌点眼器を使用して染色溶液からグローブを取り除き、関心領域への組織の損傷を防ぐように注意します。滅菌リン酸緩衝生理食塩水を使用して室温で5分間グローブを洗浄し、余分な汚れを取り除き、顕微鏡に輸送するためにグローブを培地に入れます。</li>
	<li>関心のある領域で滅菌25 G針を使用して地球儀を巻きます。<ol><li>滅菌点眼器を使用して、目の後ろから地球を持ち上げて保持します。これにより、地球が安定し、転がるのを防ぎ、一貫した傷を作ることができます。この設定を使用すると、視神経はスポイトノズルの内側にあり、角膜は外側を向いています。</li>
		<li>引っかき傷の場合は、露出した角膜を横切って滅菌25G針をそっと動かします。穿刺傷の場合は、針を中央角膜に直接そっと押し込みます。傷が角膜に穴を開けないようにしてください。 注:実験に創傷反応または創傷環境が必要ない場合は、この手順をスキップしてください。以前の研究では、この方法を使用して作成されたマウス角膜への引っかき傷と穿刺傷の両方が直径と深さの両方で一貫していることが示されています10。独立した地球儀間の創傷寸法の確認は、関心領域分析を用いて行った。</li>
	</ol></li>
</ol>5.ホルダーへのサンプル配置
<ol><li>角膜または辺縁部をホルダーの内側のカバーガラスに置き、3Dプリントされたカバーを使用して安定させます(図1C-H)。</li>
	<li>グローブが正しく配置されていること、および対象サイトがガラスカバーガラスと接触していることを確認します。グローブをホルダーに入れたら、組織の損傷を引き起こす可能性があるため、グローブを取り外そうとしないでください。</li>
	<li>接着剤を使用して3Dプリントされたカバーをホルダーに接着し、安定性を確保します。カバーバーが地球儀ではなくホルダーに付着していることを確認してください。 注:プロトコルは倒立顕微鏡で使用するために書かれているため、画像化する領域は下に配置されています。このプロトコルは、内半径の小さいホルダーとカバーバーの取り外しを使用して、正立顕微鏡に適合させることができます。これにより、地球の安定化が少なくなります。</li>
</ol>6. サンプルイメージング
<ol><li>顕微鏡と環境チャンバーの電源を入れ、チャンバーが加湿されていることを確認します。実験期間中、恒温槽を35°Cおよび5%CO2 に設定する。 注:この手順では、脱水を防ぎ、地球を最適な温度に保つために、環境チャンバーを備えた顕微鏡が適していますが、必須ではありません。</li>
	<li>カバーガラス、ホルダー、および安定化された地球儀を環境チャンバー内の顕微鏡ステージに配置し、ライブセルイメージング技術を使用して画像化します9。</li>
	<li>追加の成長培地をカバーガラスにピペットで固定して、脱水を防ぎ、組織の生存率を維持します。ホルダーの地球を覆うのに十分な培地が井戸にあることを確認してください。イメージングの期間に応じて、実験全体を通して必要に応じて新しい培地を追加します。</li>
	<li>ライブセルイメージング技術とプロトコルを使用して実験を開始します。低出力レーザー設定を使用して組織を保存し、長期間の実験での組織の損傷を防ぎます。長い作動距離には適切な対物レンズを使用してください。この原稿の実験は、20倍の対物レンズを使用して実行されました。 注:レーザーの出力とゲイン、実験時間、位置、およびイメージングの平面はすべて、実験パラメータに応じて変数です。持続時間1時間から4時間の範囲の無傷の地球儀でのイメージング実験は、過去の出版物10で成功裏に行われています。</li>
	<li>好みのファイル形式でデータを記録および保存します。顕微鏡で使用されるソフトウェアは、データ記録用の.cziファイルを生成します。</li>
	<li>プロトコルの最後にある標準的な制度プロトコルに従って地球儀を廃棄してください。</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
<li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin1%3A+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).</li>
<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

開示する利益相反はありません。

このプロトコルは、3Dプリントされたホルダーを使用して無傷の動物の目を安定させ、固定化する生細胞イメージング技術について説明しています。これは、 ex vivo 角膜組織の以前の生細胞イメージングプロトコルで認識されたいくつかの重大な欠点を回避するように設計されています。このプロトコルは、インタクトグローブのライブセルイメージングに多くの利点を提供します。実験的に誘発された引っかき傷に対する創傷治癒応答を妨げる可能性のある不要な組織損傷を大幅に低減します。これには、解剖および紫外線への曝露による神経および上皮の損傷が含まれる。さらに、このプロトコルは、実験を中断することなく増殖培地を定期的に適用できるように組織を固定化することにより、組織の水分補給と生存を促進します。ホルダー内の目の向きを変えることで、このプロトコルは地球上のさまざまな領域のイメージングを可能にします。このプロトコルと一緒に共焦点顕微鏡を使用すると、地球のさまざまな平面のイメージングが可能になり、組織構造間の相互作用を観察できます。このプロトコルは非常に汎用性が高く、マウスや他の種のさまざまなサイズの地球儀に適合させることができます。ホルダーとカバーは...

角膜 角膜は、目の前面を覆う透明な無血管構造であり、光を屈折させて視力を可能にし、目の内部を損傷から保護します。角膜は環境にさらされているため、機械的原因(引っかき傷)と感染の両方による損傷を受けやすくなります。他の点では健康な患者の角膜損傷は、通常1〜3日以内に治癒します。しかし、辺縁系幹細胞欠損症やII型糖尿病などの基礎疾患のある患者では、角膜創傷治癒プロセスを大幅に延長することができます1。角膜は高度に神経支配されているため、これらの非治癒性の角膜潰瘍と再発性角膜びらんは非常に痛みを伴い、それらを経験している患者の生活の質を大幅に低下させます1。
細胞シグナル伝達 他の点では健康な角膜が損傷すると、創傷に隣接する細胞内のカルシウムシグナル伝達イベントが先行し、創傷床への細胞移動を促し、そこで瘢痕化のリスクなしに損傷を閉じます2,3。これらのシグナル伝達イベントは、ライブセルイメージングを用いた角膜上皮細胞培養モデルで十分に特徴付けられています2。予備実験は、糖尿病細胞と比較して、非糖尿病細胞における傷害後の有意に多くのカルシウムシグナル伝達を実証する。しかしながら、ex vivoグローブにおける細胞シグナル伝達事象の特性評価は、技術的な課題であることが証明されている。
ライブセルイメージング 以前の研究では、角膜創傷治癒のin vitro細胞培養モデルからのカルシウムシグナル伝達イベントを記録することに成功しています4、5、6。ex vivo組織におけるこれらのシグナル伝達事象の高品質の画像を生成する方法論を開発することは、より複雑で現実的なシステムでこれらの事象の研究を可能にするため、非常に興味深いものである。以前のアプローチは、角膜の解剖とそれに続くUV誘発PEGゲルへの固定化を含んでいた7、8、9。固定化は、実験の過程を通して生存可能で水和されたままでなければならないため、生きた組織を扱う際に不可欠でありながら困難なステップです。さらに、固定化は組織を傷つけてはならない。PEG溶液は組織を固定化しましたが、生成された画像の解像度と品質は一貫していませんでした。そのため、3Dプリントホルダーは、無傷の地球儀を固定して、組織の損傷のリスクが少なく高品質の画像を生成するために開発されました。
アプローチ 生細胞イメージングのために無傷の ex vivo グローブを固定化するために、独自の3Dプリントホルダーが開発されました。このホルダーは、角膜を解剖することなく除核球体のイメージングを可能にし、紫外線への曝露を排除するという2つの主要な光源からの損傷を防ぎます。これらの損傷源がなければ、得られた画像は、実験的に行われた引っかき傷に対する反応をより正確に表した。さらに、3Dプリントされたホルダーは、マウスアイの正確な寸法に合わせてキャリブレーションされました。これにより、PEG溶液での固定よりもはるかに優れたフィット感が得られ、組織の動きが減少するため、低出力の対物レンズでより高品質の画像が得られます。ホルダーの上部に取り付けられたカバーバーは、実験期間中、グローブが動かないままであり、水分補給と生存能力を維持するために成長培地が適用されたときにグローブが変位しないようにします。ホルダーを正確な寸法に印刷する機能により、年齢や病気の状態に応じてさまざまなサイズのマウスの目に最適なフィット感を生成することもできます。この技術は、寸法に基づいて異なる種の目のホルダーを開発するために、より広く適用することができます。

<table><tbody><tr><td>1.75青色ポリ乳酸(PLA)プラスチック</td><td>Creality(深セン、中国)</td><td>N / A</td><td>ホルダー用材料</td></tr><tr><td>35 mm皿、No.1.5カバーガラス、14 mmガラス直径、Poly-D-LysineコーティングMatTek</td><td>Corporation(マサチューセッツ州アッシュランド)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>イメージング用井戸。</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360ソフトウェア</td><td>Autodesk(カリフォルニア州サンラファエル)。</td><td>N/A</td><td>ホルダーの印刷に使用するソフトウェアです。</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 滅菌針 単回使用 100 針/箱</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (マサチューセッツ州ウォルサム)</td><td>305124</td><td>球体への実験的に誘発された創傷の場合</td></tr><tr><td>CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)</td><td>C10046</td><td>細胞膜対比染色。カルシウムインジケーター。1:10,000濃度、最終濃度1%(v / v)DMSOおよび0.1%(w / v)プルロン酸</td></tr><tr><td>コンプリートホームスーパーグルー</td><td>ウォルグリーン(イリノイ州ディアフィールド)</td><td>N / A</td>ホルダーを<td>イメージングウェルに取り付けるため</td></tr><tr><td>Ender 3 Pro 3Dプリンター&nbsp;</td><td>Creality (Shenzen, China)</td><td>N/A</td><td>ホルダーの印刷用</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>ImageJ (Bethesda, MD)</td><td>ライセンス番号: GPL2</td><td>関心領域分析を使用して独立したグローブ間の創傷の深さと直径の一貫性を確認するために使用</td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>F14201</td><td>カルシウムインジケーター. 1:100 濃度、最終濃度 1%(v/v) DMSO および 0.1% (w/v) プルロン酸</td></tr><tr><td>ケラチノサイト無血清培地</td><td>Gibco (マサチューセッツ州ウォルサム)</td><td>17005042</td><td>25 mg/mL ウシ下垂体抽出物、0.02 nM EGF、0.3 mM CaCl2、およびペニシリン-ストレプトマイシン (100 units/mL, 100 & micro;それぞれg / mL)中型の</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Corning、Medlabtech(バージニア州マナッサス)</td><td>21-040-CV</td>を<td>イメージングする前に角膜の余分な汚れを洗い流すために使用されました</td></tr><tr><td>Zeiss Confocal 880顕微鏡とAiryScan</td><td>Zeiss(ソーンウッド、NY)</td><td>N / A</td><td>20倍倍倍対物レンズを使用しました</td></tr></tbody></table>

新しい3dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

角膜上皮創傷治癒は、上皮細胞上に発現するプリン作動性受容体の活性化によって開始される遊走過程である。この活性化は、細胞から細胞へと伝播するカルシウム動員イベントをもたらし、これは創傷床への細胞運動を開始するために不可欠であり、効率的な創傷治癒を促進する。Trinkaus-Randall研究室は、 ex vivo マウスグローブの角膜創傷治癒反応をリアルタイムでイメージングするための方法論を開発しました。このアプローチでは、確立されたプロトコルに従って安楽死させたマウスから無傷のグローブを取り出し、カルシウム指示色素でグローブを直ちにインキュベートします。細胞の他の特徴を染色する対比染色をこの段階で適用して、イメージングを支援し、細胞のランドマークを示すことができます。このプロトコルは、アクチンを染色するSiRアクチンや細胞膜を染色するための深赤色原形質膜染色など、対比染色に使用されるいくつかの異なる生細胞色素でうまく機能しました。創傷への反応を調べるために、25Gの針を使用して角膜上皮を損傷し、グローブを3Dプリントされたホルダーに入れます。3Dプリントされたホルダーの寸法は、実験期間中の地球儀の固定化を確実にするために調整され、さまざまなサイズの目に対応するように変更できます。創傷応答のライブセルイメージングは、共焦点顕微鏡を用いて経時的に組織全体の様々な深さで連続的に行われる。このプロトコルにより、共焦点顕微鏡で20倍の空気対物レンズを使用して、高解像度の出版品質の画像を生成できます。このプロトコルには、他の目的も使用できます。これは、 ex vivo マウスグローブでの生細胞イメージングの品質の大幅な改善を表し、神経と上皮の識別を可能にします。

このプロトコルは、出版品質のデータおよび画像を一貫して生成するために使用されてきた10。得られた画像は、以前のアプローチと比較して大幅な改善を表しています(図2)。3Dプリントされたホルダーを使用すると、角膜の層全体で画像をキャプチャでき、さまざまなz平面でのカルシウム動員を観察できます(図3)。このアプローチは、若齢マウスと老齢マウスの創傷における頂端細胞層と基底細胞層の間の細胞間シグナル伝達を比較するために使用されています10。
安定性の向上により、以前よりも大幅に長いグローブのイメージングが可能になりました。これにより、創傷床への細胞移動の研究を以前の能力を超えて数時間延長することができました。この延長されたタイムラインにより、角膜損傷後の若齢マウスと老齢マウスの間の創傷治癒応答中に細胞挙動の実質的な違いが観察され得る10</s...

本研究では、3Dプリントホルダーを利用して、除核球体の高解像度ライブセルイメージングを可能にする新しい実験プロトコルについて説明します。このプロトコルを通じて、 ex vivo グローブからの創傷角膜上皮における細胞カルシウムシグナル伝達活性をリアルタイムで観察することができる。

新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

このプロトコルで使用される3Dプリントホルダーにより、損傷した角膜における短期の細胞シグナル伝達と長期的な細胞移動イベントをリアルタイムで監視できます。地球を無傷で、生存可能で、動かないようにすることで、このプロトコルは上皮や神経を含む角膜細胞の高品質のライブ画像を生成します。3Dプリントされたホルダーは、さまざまなサイズや種の地球儀に合わせて簡単に変更できます。また、他の領域を画像化したり、ナノインデント実験を行ったりするために、目の向きを変えることもできます。まず、安楽死させたマウスの頭を取り除いた後、すぐに氷の上に置いて組織の生存率を維持します。次に、ピンセットを使用して、それを居眠りさせることによって地球儀を核出します。そして、ピンセットで保持されている場所のすぐ下で解剖ハサミを使用して視神経をクリップします。P-35細胞培養皿で2ミリリットルの培地で、カルシウムインジケーターおよび/または細胞膜染色を含む2ミリリットルの培地で、摂氏37度、5%二酸化炭素の低照度条件下でインキュベートし、均一な染色のためにグローブを染色培地に沈めます。ホルダーをきれいなガラスボトムカバースリップに取り付けるには、ホルダーを70%エタノールで洗い、接着剤をホルダーに置きます。次に、ホルダーをガラス底カバースリップに接着し、接着剤が蛍光を発してイメージングを複雑にする可能性があるため、ホルダーの内部領域に接着剤がないことを確認します。接着剤が固まったら、ホルダーがカバースリップに対して固定されていることを確認します。滅菌スポイトを使用して染色溶液からグローブを取り除き、関心領域への組織の損傷を防ぐように注意します。滅菌リン酸緩衝生理食塩水を使用して室温で5分間グローブを洗浄し、余分な汚れを取り除き、顕微鏡に輸送するためにグローブを培地に入れます。関心のある領域で滅菌25ゲージの針を使用してグローブを巻き取るには、滅菌スポイトを使用してグローブを目の後ろから持ち上げて保持し、グローブを安定させ、転がらないようにします。引っかき傷の場合は、露出した角膜を横切って滅菌25ゲージの針をそっと動かすか、刺し傷の場合は針を中央角膜に直接そっと押して、傷が角膜基底膜を貫通しないようにします。角膜または辺縁部をホルダーの内側のカバースリップに置き、地球儀が正しく配置されていること、および関心のある部位がガラスカバースリップと接触していることを確認します。接着剤を使用して、ホルダーに接着された3Dプリントカバーを使用して安定させます。そして、これは組織の損傷を引き起こす可能性があるので、地球を取り除こうとしないでください。顕微鏡の電源を入れ、環境チャンバーを摂氏35度、二酸化炭素5%に設定し、加湿チャンバーを確認します。カバースリップホルダーと安定化された地球儀を、ライブセルイメージング技術を使用して、環境チャンバー内の顕微鏡ステージに配置し、画像化します。追加の成長培地をカバースリップに吟味して脱水を防ぎ、組織の生存率を維持し、ホルダー内の地球を覆うのに十分な培地がウェルにあることを確認します。ライブセルイメージング技術を使用して実験を開始し、低出力レーザー設定を使用して組織を保存し、組織の損傷を防ぎ、長期間の実験に適した対物レンズを使用します。データ記録用のCZIファイルの優先ファイル形式でデータを記録および保存します。3Dプリントホルダーで安定化されたX vivo角膜について、多層構造の高品質のイメージングデータが得られ、角膜の頂端層、基底層、および間質層におけるカルシウムシグナル伝達イベントが実証されました。3Dプリントホルダーに固定された角膜のZスタック画像は、引っかき傷で取得され、角膜の層全体の細胞膜とカルシウムシグナル伝達、および異なるZ平面でのカルシウム動員を視覚化しました。治癒応答中の創傷床への細胞移動を研究するために角膜の時系列実験が行われ、X、Y、またはZ方向への地球の動きがほとんどないことが判明しました。地球儀をホルダーに配置することにより、中央および角膜辺縁領域の両方で、角膜の異なる領域を視覚化できることが観察された。このプロトコルにより、創傷治癒に違いを示す疾患モデルから眼を画像化することができます。細胞シグナル伝達の異常と生きた組織の運動性を特徴付けることができます。

live-cell-imaging-intact-ex-vivo-globes-using-novel-3d-printed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルは、次の3つについて説明します...

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。...

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。...

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

我々は、マウス胚の皮膚の切開およびex vivoでの文化について説明します。培養系は、組織表面を横切って気液界面を維持し、倒立顕微鏡でイメージングを可能にする。メラノブラスト、現像皮膚の成分は、それらの蛍光挙動は、共焦点顕微鏡を用いて観察することを可能に標識される。...

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

私たちは、デバイスと、細胞や胚を研究するための新しい方法を報告しています。単一細胞が正確にマイクロキャビティアレイに並べられます。その3Dの閉じ込めは、生理的条件に遭遇した3D環境への第一歩であり、細胞小器官の向きを可能にします。セル形状を制御することにより、この設定は、標準的なアッセイで報告変動を最小限に抑えることができます。...

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

反復可能なパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するための手順を紹介します。組織パターン形成のための多方向の画像を達成するために 2...

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御

このプロトコルは、神経系の発達中にH2O2の生理的シグナル伝達役割を評価するための培養ゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫における遺伝的にコードされた過酸化水素(H2O2)バイオセンサーの使用を記述する。それは、異なる細胞タイプに適用し、一般的な開発で活性酸素種(ROS)を研究するために実験的な治療で変更することができます。...

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

ニワトリ胚は、 ovo および ex vivo 脳スライス共培養におけるヒト膠芽腫(GBM)脳腫瘍の研究に使用されます。GBM細胞の挙動は、 ex vivo 共培養におけるタイムラプス顕微鏡によって記録することができ、両方の調製物は、詳細な3D共焦点分析によって実験エンドポイントで分析することができる。...

ニワトリ胚脳をモデルとしてヒト膠芽腫細胞挙動の in vivoおよび ex vivo 解析(英語)

学ぶ 3Dプリントホルダーを用いた無傷のex vivo眼球の生細胞イメージング法。マウス角膜上皮のカルシウムシグナルと細胞移動をリアルタイムで観察し、傷治癒メカニズムの解明に貢献します。

新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング

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