Name: スケーラブルで柔軟性があり、費用対効果の高い苗接ぎ木 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ シリコーンエラストマーと29ゲージワイヤーを用いた苗接ぎ木法。事前訓練不要で低コストに実施でき、植物の長距離シグナル伝達研究を支援します。分子生物学研究室で容易に利用可能です。

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シロイヌナズナの苗を接ぎ木するための初期トレーニングと指導を提供してくれたハビエル・ブルモスに感謝します。

1.デバイスの準備
<ol><li>正方形のペトリ皿(100 mm x 100 mm)にシリコーンエラストマー溶液をキャストして、シリコーングラフトデバイスを作成します。製造元のガイドラインに従って、15 mLのエラストマー溶液を調製します。 注意: シリコーンエラストマーキットには通常、シリコーンベースの液体と硬化剤が含まれており、混合するとシリコーンが固化します。</li>
	<li>正方形のペトリ皿に29Gのワイヤーの4つの直線片を互いに等距離に置いて、正方形のペトリ皿を準備します(図1A)。ワイヤが金型の底面と同じ高さになっていることを確認します。ワイヤーを完全にまっすぐにするには、重くて平らな物体(金属製のチューブラックなど)のある硬くて均一な表面にワイヤーを転がします。 注意: ツイストタイには29Gのワイヤーが含まれていることが多く、アセトンで外側の紙のコーティングを取り除いた後に使用できます。</li>
	<li>混合シリコーンエラストマー溶液をワイヤーの上に注ぎ、ペトリ皿の上部で覆います。シリコーンを室温で24〜48時間硬化させます。</li>
	<li>きれいな鉗子を使用してペトリ皿からシリコンシートを取り除き、きれいな平らな面に移動します。</li>
	<li>シリコンシートからワイヤーを取り外します。チャネルの外側に残っているシリコーンの薄層を細かい点鉗子で取り除き、チャネルの片側が開くようにします(図1A)。</li>
	<li>清潔なはさみを使用して、シリコンシートをチャネルに対して垂直に3 mmのストリップにカットします。各ストリップをアルミホイル封筒に移動し、オートクレーブテープで密封します。</li>
	<li>ストリップを121°Cで少なくとも30分間オートクレーブし、使用できるようになるまで保管します。</li>
</ol>2.苗の準備
<ol><li>種子を殺菌して春化する。<ol><li>シ ロイヌナ ズナの種子100個まで、0.1%Tween 20を含む50%漂白剤溶液1 mLに1.5 mLマイクロ遠心チューブに懸濁し、5〜10分間インキュベートします。無菌条件下でピペッティングまたは吸引によって漂白剤溶液を除去します。1mLの滅菌dH2Oで種子をすすぎ、チューブをひっくり返して種子を適切にすすぎ、チューブの上部に残っている漂白剤溶液を取り除きます。すすぎを4回繰り返します。</li>
		<li>種子を入れたチューブに約0.25 mLの水を残し、4°Cで暗所で3日間保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>接ぎ木に備えて種子を盛り付けます。<ol><li>1LのMS(0.5%スクロース)固体培地に対して、MS塩4.4g、スクロース5g、寒天10gを800mLの水に混合し、KOHでpHを5.7に調整し、さらに水で全量を1Lにします。オートクレーブを少なくとも20分間行い、~25 mLを正方形のペトリ皿に注ぎます。</li>
		<li>無菌条件下で、20 μLのピペットチップを使用して、適切な数の準備されたシードをプレートに移動し、シードを吸引して移します。</li>
		<li>種子の位置決めをガイドするためにプレート表面に滅菌ストリップを置き、種子がストリップ上のチャネルに整列するようにします。種がメッキされたらストリップを取り除きます。 注意: 1つの100 mm x 100 mmの正方形のプレートは、2列の苗を収容できます(図1B)。</li>
		<li>プレートが立ったら、液体を固体培地から蒸発させ、プレートの底に溜めます。種子をプレート上に置いた後、プレートカバーの上に置き、2列の種子に平行なプレートの片側( 図1Bの青色の強調表示された領域で示されている)をパラフィルムで密封します。パラフィルムの上とプレートの他のすべての端に通気性テープを巻きます。</li>
	</ol></li>
	<li>パラフィルムシール面を下に向けて2枚のプレートを慎重に立てます。水平の15 mL遠心チューブをそれらの間に置き、輪ゴムで固定することにより、下部の2つのプレートを分離します。プレートの表面がベンチトップの表面と100°〜110°の角度を形成していることを確認します(図1C)。</li>
	<li>プレートをこの向きにして21°Cの全暗所で72時間保存し、苗の胚軸の長さが~5mmになるようにします。72時間後、プレートを暗所から取り出し、移植前に同じ温度でさらに2〜4日間、16時間の光(100μE m-2 sec-1の強度)および8時間の暗サイクル下で成長させる。</li>
	<li>播種後5〜7日で苗を接ぎ木します。苗の上に接ぎ木ストリップを置き、それらの胚軸をチャネルに取り付けます。根と胚軸の接合部がシリコンストリップの下部に配置されるように苗をそっと配置して、苗を刈り取りの準備をします(図1D)。</li>
</ol>3.接ぎ木手順
<ol><li>解剖スコープを70%エタノールで消毒し、2対の細い先端の鉗子とメスのハンドルをオートクレーブ滅菌することにより、無菌の作業環境を準備します。滅菌フード内で、必要に応じて解剖スコープを使用して、すべての移植手順を実行します。10.5倍の倍率を使用してほとんどのグラフトを実行します。</li>
	<li>穂木を準備します。新しいメスの刃を使用して胚軸を垂直にカットし、まっすぐなきれいなカットを作成します。苗が寒天に押し込まれるのを防ぐために、植物に押し下げるのではなく、ブレードを前方に押します(ビデオ1)。</li>
	<li>シュートを削除します。メディア表面との接触を確実にすることにより、シュートのカット部分を水和させるように注意してください。あるいは、使用できるようになるまで、滅菌dH2Oで満たされたペトリ皿の上部などの指定された保持領域にシュートを移動します。</li>
	<li>台木を準備します。閉じた鉗子の間に残ったスペースに根をつかんで回し、台木の切断部分をストリップの中央に残して、根をそっと引っ張ります(ビデオ2)。 注意: 閉じた鉗子の間で直接押しつぶされると、壊れやすい根が損傷するため、組織を操作するためにピンセットの端の鋭角で根をくさびで留める必要があります。</li>
	<li>細い先端の鉗子を使用して目的のシュートをそっと拾い上げ、チャネルの上部に挿入します。 注意: 接ぎ木を成功させるには、接ぎ穂と台木の間の接触を視覚的に確認することが重要です(ビデオ3)。</li>
	<li>すべての移植片ができたら、パラフィルムと通気性テープでプレートを包み、苗やシリコンストリップを邪魔することなく、以前と同じ方法でプレートをセットアップします。プレートを26°Cに設定された成長チャンバーに慎重に移動し、16時間の明/8時間の暗サイクルを行います。</li>
	<li>7〜10日後に無菌条件下で接ぎ木苗を評価します。片側をはがして鉗子を使用してシリコンストリップを慎重に取り外し、チャネルが苗を解放できるようにします。接ぎ穂から生えている不定根を新鮮なメスの刃で切り取るか、細い先端の鉗子を使って押しつぶして取り除きます。台木が接ぎ穂にしっかりと付着して移植片を形成したかどうかを視覚的に評価します(図2)。</li>
	<li>成功した接ぎ木を苗繁殖土壌に移動して、必要なだけ成長します。苗が確立されたら、数日間透明なプラスチックで土を覆います。植物を土壌に移した後、前述の明暗サイクルで21°Cで生育します。</li>
</ol>

<ol><li>Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Reviews%22%5BJournal%5D)">A history of grafting.</a> Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).</li>
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<li>Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FERONIA+is+a+key+modulator+of+brassinosteroid+and+ethylene+responsiveness+in+arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls.</a> Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

概要と意義 接ぎ木組合の形成は接ぎ木を成功させるために重要であり、それは台木と接ぎ穂との間の直接かつ邪魔されない接触を必要とする。シロイヌナズナなどの小さな植物の苗のミニチュアサイズと脆弱性は、この要件を満たすことを技術的に困難にします。初期のシロイヌナズナ苗接ぎ木法で開発された1つの技術は、接ぎ木接合部10を支えるために、接ぎ穂と台木の両方を短いシリコンチューブカラーに挿入することでした。この方法は、2つの移植片部分を分離から保護するのに非常に効果的ですが、壊れやすい接ぎ穂と台木を狭口径チューブに挿入するのは簡単な作業ではありません。さらに、成長による接合部の肥厚は、接ぎ木された苗を損傷することなく狭口径シリコーンチューブを除去することをしばしば困難にする。他の方法では、接ぎ木から両方の子葉を取り除き、斜めの表面で接ぎ木苗を育てるなど、成長中に苗が動くのを防ぎながら接ぎ木襟の使用を避けるために代替技術を使用しました9,11<sup class=...

接ぎ木は、紀元前500年までに確立された農業慣行となった古代の園芸技術です1。収量を改善するためにさまざまな種類の作物を接ぎ木することは、この技術の最初の使用であり、今日でもこの目的のために使用され続けています。過去10年間で、接ぎ木は、分子生物学者が植物の長距離シグナル伝達を研究するためのツールとしてますます注目を集めています2,3,4,5。成体植物の接ぎ木は比較的簡単ですが、発芽後すぐに植物を接ぎ木することは困難です。それにもかかわらず、植物の発育、環境応答、開花などのプロセスにおける長距離シグナル伝達の影響を評価する必要がある場合があります6,7,8。
シロイヌナズナは、植物生物学のモデル生物として確立されており、サイズが比較的小さく、実験室内で成長しやすいなど、さまざまな理由から確立されています。しかし、シロイヌナズナの苗のサイズが小さくてもろいため、幼苗の接ぎ木は非常に困難です。多くの場合、苗の接ぎ木をうまく入手するには、広範な実践的なトレーニングが必要です。何年にもわたって多くの方法論的改善が行われ、理想的な成長条件と苗接ぎ木の成功率を高めるための新しい技術が特定されてきました9,10,11。導入された最新のツールはシロイヌナズナの苗接ぎ木チップで、経験の浅いユーザーでも許容レベルの接ぎ木成功を達成できます12。この進歩により、苗接ぎ木の技術的障壁は大幅に低下しましたが、チップデバイスは高価であり、並行して迅速に実行できる移植の数は法外なコストになります。
さらに、この装置は、野生型の苗に似た胚軸寸法を有するシロイヌナズナの苗にのみ使用できます。シロイヌナズナは植物分子遺伝学の世界の要種ですが、最近は他の種でも苗接ぎ木を用いた研究が行われています。例としては、ダイズと一般豆の接ぎ木、トマトへのタバコ、シロイヌナズナへのキャノーラの接ぎ木、続いて低分子RNAについて両方の組織をサンプリングすることが含まれます13,14。したがって、ほとんどの実験室が利用でき、大きな技術を変更することなく幅広い植物種に容易に適応できる接ぎ木法が非常に望ましい。
このプロトコルは、ほとんどの植物種にわたるあらゆる苗形態に対応するために接ぎ木チャネルの直径と長さの完全なカスタマイズを可能にする単純な接ぎ木装置の社内生産を採用する方法を詳述しています。必要なコンポーネントは、シリコーンエラストマー、正しいサイズの配線またはチューブ、高精度のブレード、および金型として機能する容器だけであるため、これらのデバイスの製造は非常に手頃な価格で非常にスケーラブルです。ここで詳述するグラフトプロトコールに従って、ユーザは、以前に報告されたグラフト結果に匹敵する45%(n = 105)の成功したグラフト率を達成することができる10,12。

<table><tbody><tr><td>15 mLコニカルチューブVWR</td><td>International Inc</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>ACETONE(HPLC &ACS認定溶剤) 4 L</td><td>VWR</td><td>BJAH010-4</td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Sigma</td><td>A1296-500g</td><td></td></tr><tr><td>ダウ SYLGARD 184 シリコーン封止剤 透明 0.5 kg キット</td><td>ダウ</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>D-スクロース (分子生物学)、1 kg</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ スナップキャップ マイクロ遠心分離機フレックスチューブ チューブ (1.5 mL)、500</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィック</td> <td>パック20901-551 / 05-402</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド高精度 #4 スタイルメスハンドル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-000-164</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド鉛フリーオートクレーブテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドスクエアシャーレ</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>ライカズーム 2000 実体顕微鏡</td>顕微鏡<td>セントラル</td><td>L-Z2000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロポアテープ3M</td><td></td><td>B0082A9FEM</td><td></td></tr><tr><td>村重とスクーグ基礎媒体</td>シ<td>グマ</td><td>M5519-10L</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>16-101</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化カリウム</td><td>VWRインターナショナルインク</td><td>AA13451-36</td><td></td></tr>レ<tr><td>ディアースプラグと苗のミックスサン</td><td>グロ園芸</td><td>SUN239274728CFLP</td><td></td></tr><tr><td>スコッツOsmocote Plus</td><td>Hummert International</td><td>7630600</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-697</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Teezer DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM</td><td>VWR</td><td>102091-580</td><td></td></tr></tbody></table>

スケーラブルで柔軟性があり、費用対効果の高い苗接ぎ木

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

初期段階の苗の接ぎ木は、植物内の根とシュートの関係を研究するための分子遺伝学の人気のあるツールになっています。小型モデル植物である シロイヌナズナの初期段階の苗木の接ぎ木は、その苗木のサイズと脆弱性のために技術的に困難で時間がかかります。公開されているメソッドのコレクションが増えており、成功率、難易度、および関連するコストがさまざまでこの手法について説明しています。本稿では,シリコーンエラストマーミックスを用いて社内で再利用可能な接ぎ木装置を作る簡単な手順と,この装置を苗接ぎ木に使用する方法について述べる.この出版物の時点では、各再利用可能なグラフトデバイスの製造には、消耗品のコストはわずか0.47ドルです。この方法を使用すると、初心者は最初から最後まで3週間以内に最初の苗木をうまく接ぎ木することができます。この非常にアクセスしやすい手順により、植物分子遺伝学ラボは、実験プロセスの通常の部分として苗の接ぎ木を確立することができます。ユーザーがこれらの接ぎ木装置の作成と設計を完全に制御できるため、この技術は、必要に応じてトマトやタバコなどのより大きな植物で使用するために簡単に調整できます。

グラフトストリップの設計のさまざまな側面をテストして、最小限の技術的スキルを必要とする最適なグラフト条件を特定しました(表1)。全ての移植試験は、理想的な移植培地であることが以前に報告されている0.5%スクロースMS培地上で完了した11、12。
最適な苗の成長は、ストリップ上の発芽では達成できません シリコーンストリップの最初の反復では、ワイヤーがシリコーンシートから取り外された後、ストリップチャネルの背面に残るシリコーンの薄層を残すことによって、密閉されたチャネルが作成されました。苗をプレート上で直接発芽させ、後で接ぎ木ストリップを実生胚軸の上に置く代わりに、種子を少量のMS培地で満たされたチャネルに挿入した後、種子をストリップ上で直接発芽させた。この技術を使用すると、苗の半分が発芽中にチャネルに詰まり、伸びることができませんでした。非発芽苗と非長苗を含めると、接ぎ木成功率25%(n=16)...

このプロトコルは、事前の経験やトレーニングを必要とせず、ほとんどの分子生物学ラボで簡単にアクセスできる材料を使用して非常に低コストで実行できる堅牢な苗接ぎ木方法について説明しています。

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...

初期段階の播種接ぎ木は、植物の長距離シグナル伝達を設定するための強力なツールです。この方法が、実践的なトレーニングなしで播種接ぎ木を成功させるのに役立つことを願っています。シリコーンエラストマーを鋳造するための100x100ミリメートルを測定する正方形のペトリ皿を準備することから始めます。29ゲージのワイヤーをアセトンでワイヤーの外側の紙のコーティングを取り除いた後、ツイストタイで取ります。そして、金属製のチューブラックのような重い平らな物体で硬くて均一な表面にワイヤーを転がして、ワイヤーを完全にまっすぐにします。次に、正方形のペトリ皿に互いに等距離にある4本のまっすぐなワイヤーを置き、ワイヤーが皿の底に平らになるようにします。混合シリコンエラストマー溶液をペトリ皿のワイヤーの上に注ぎ、カバーを皿の上に置きます。シリコーンを室温で24〜48時間硬化させた後、きれいな鉗子を使用してペトリ皿からシリコーンシートをはがし、清潔で平らな面に移動します。シリコンシートからワイヤーを取り外します。チャネルが片側で開いていることを確認するには、細かい点の鉗子を使用して、チャネルの開いた側を塞いでいるシリコンの薄層を取り除きます。きれいなはさみを使用して、チャネルに垂直にシリコンシートを3ミリメートルのストリップにカットします。各ストリップをアルミホイル封筒に入れ、オートクレーブテープで密封します。ストリップを摂氏121度で少なくとも30分間オートクレーブしてから、必要になるまで保管します。種子を殺菌して春化するには、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに0.1%Tween 20を含む1ミリリットルの50%漂白剤溶液を取り、その中に最大100個のシロイヌナズナ種子を懸濁させます。種子懸濁液を室温で5〜10分間インキュベートします。インキュベーション後、無菌条件下で漂白剤溶液を吸引またはピペットで取り出します。1ミリリットルの滅菌蒸留水で種子を洗い流します。種子をすすぐ間、チューブを適切に反転させるようにしてください。チューブの上部に残っている漂白剤溶液を取り除くには、すすぎを4回繰り返します。種子を入れた状態で約250マイクロリットルの水をチューブに入れておき、種子を摂氏4度の暗所で3日間保管します。次に、シードをプレーティングする前に、準備したMSプレートの表面に滅菌ストリップを置き、ストリップ上のチャネルとのシードの位置合わせをガイドします。次に、無菌条件下で作業し、20マイクロリットルのピペットチップを使用して、適切な数の準備された種子を吸引し、プレートに移します。種子がメッキされたら、滅菌ストリップを取り除きます。プレートを覆います。そして、種子の列に平行なプレートの側面の1つをパラフィルムで密封します。パラフィルムの上とプレートの他のすべての端に通気性テープを巻き付けて、インキュベーション中の空気交換を可能にします。パラフィルムで密封された側面を下に向けて、2つのプレートを慎重に垂直に向けます。15ミリリットルの遠沈管を間に水平に配置し、輪ゴムで上に固定して、下部で分離します。プレートの表面がベンチトップの表面と100から110の角度を形成していることを確認します。プレートをこの向きで摂氏21度の完全な暗闇で72時間保管し、苗の胚軸の長さが約5ミリメートルになるようにします。その後、セットアップを暗闇から取り外し、接ぎ木する前に同じ温度で2〜4日間、16時間の光と8時間の暗闇のサイクルに保ちます。メッキ後5〜7日の間に苗を接ぎ木します。苗の上に接ぎ木ストリップを置き、それらの胚軸をチャネルに取り付けます。苗をそっと配置して、根と胚軸の接合部がシリコーンストリップの底に残り、苗を刈る準備をします。解剖スコープの助けを借りて滅菌フードで作業し、接ぎ木のために接ぎ穂を準備します。新鮮なメスの刃を使用して、胚軸を横切ってまっすぐできれいな垂直にカットします。苗を押し下げて寒天に押し込まないでください。次に、シュートを取り外し、シュートの切断部分をメディア表面との接触を確保して水和させます。あるいは、シュートを滅菌蒸留水で満たされたペトリ皿に移動させることができる。台木を準備するには、閉じた鉗子の間のスペース内の根を注意深くつかみ、台木の切断部分をストリップの中央に残して、ゆっくりと回して引っ張ります。次に、先端の細い鉗子を使用して目的のシュートをそっと持ち上げ、チャネルの上部に挿入します。視覚的に、接ぎ穂と台木の間の接触を確認して、成功した移植片を得てください。すべての移植片が作成されたら、パラフィルムと通気性テープでプレートを包み、苗やシリコンストリップを乱すことなく、前に示したのと同じ方法でプレートをセットアップします。プレートを摂氏26度に設定された成長チャンバーに慎重に移動し、16時間の明と8時間の暗のサイクルで行います。7〜10日後、鉗子を使用してシリコンストリップを片側から慎重に剥がし、苗をチャネルから解放することにより、無菌条件下で接ぎ木苗を評価します。接ぎ穂から生えている不定根を新鮮なメスの刃で切るか、先端の細かい鉗子で押しつぶして取り除きます。もう一度、台木が接ぎ穂にしっかりと付着して移植片を形成しているかどうかを視覚的に評価します。成功した接ぎ木を苗繁殖土壌に移動し、苗が確立されるまで数日間透明なプラスチックで土壌を覆います。植物が摂氏21度で前述の明暗サイクルの下で成長するのを待ちます。最適な接ぎ木プロトコルを決定するための接ぎ木試験では、種子が密閉されたチャネルを備えたシリコーンストリップ上で直接発芽した場合、全体的な接ぎ木成功率は25%であることが明らかになりました。胚の子葉を保つために種子の向きを変え、発芽中に下向きに急降下させると、接ぎ木効率がわずかに33%に増加しました種子と成長培地との接触を可能にするためにチャネル上のシリコーンを閉じると、苗の85%が正常に発芽しました。しかし、接ぎ木成功率は31%にとどまり、ストリップ発芽では最適な苗成長を達成できなかったことを示しています。興味深いことに、苗木を接ぎ木プレート上で垂直に栽培してからストリップの開いたチャネルに挿入するという実証されたプロトコルでは、最初の2回の試験で全体的な接ぎ木成功率が48%になりました。接ぎ木部位のわずかなばらつきに起因する可能性のある3回目の試行の成功率の低さと比較的小規模な試行を考慮すると、全体的な接ぎ木成功率は45%であることがわかりましたこれは、苗を水平プレートで栽培し、固体表面で切断し、接ぎ木ストリップに挿入する方法に匹敵します。ただし、実証されたプロトコルは比較的時間がかかりません。このプロトコルを使用すると、苗接ぎ木に不慣れなラボは、特定のニーズに合わせてデバイスを簡単にカスタマイズしながら、多数の接ぎ木サポートデバイスを迅速に作成できます。

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