紅藻生理機能を評価するための自己蛍光イメージング
February 17th, 2023
本プロトコルは、スペクトル分析に基づく紅藻におけるフィコビリタンパク質変化の段階的な自己蛍光イメージングおよび評価を記載する。これは、希少な材料しか利用できず、実験室条件下で細胞がゆっくりと成長するか、まったく成長しない場合に、極端な生息地への細胞の適応を評価するためのラベルフリーで非破壊的な方法です。
この共焦点顕微鏡プロトコルは、色素の自家蛍光を使用して、実験室でゆっくりと成長する極端な環境からの微細藻類の生態学的行動と適応の解釈を可能にします。この技術は侵襲的ではなく、化合物を使用しないためアーチファクトを最小限に抑えます。独立栄養生物の色素の性能とそれに対応する成長を知ることで、観光洞窟や建築記念碑にとって最大の関心事である制御方法の設計が可能になります。
Chroothece mobilisの接種材料を寒天培養物から海水培地またはSWES液体培地に移すことによって準備を開始します。すべての培養物を、低い白色光強度の下で、所望の細胞密度が得られるまで振とうすることなく、摂氏20度で16〜8の明るい暗い写真期間で2週間維持する。1ミリリットルの細胞密度につき10〜3番目の細胞密度の5倍を有する1ミリリットルの指数相培養物を使用して、異なる実験のために24ウェルプレートに接種する。
単色光の効果を再現するには、緑色フィルターを使用して、506ナノメートルの波長にピークを持つ470〜570ナノメートルの緑色光を通過させ、590〜720ナノメートルのフィルターを使用して調整された赤色光と678ナノメートルのピークを通過させます。細胞培養物をこの光に2週間さらします。レーザーを含む倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡のすべてのコンポーネントの電源を入れます。
SWES増殖培地中の細胞を、24ウェルプレートの各実験ウェルから35ミリメートルのガラス底皿にマウントしてイメージングします。63Xまたは1.30の絞り数またはNAグリセロール液浸対物レンズを選択し、グリセロールをレンズの上に置きます。次に、ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、画像取得中に標本が動かないようにします。
標本を光路の中心に配置し、蛍光強度が最も高い平面を選択して細胞の中心に焦点を合わせます。完了したら、画像取得ソフトウェアを開き、取得モードのドロップダウンリストからXYラムダを選択します。レーザーの励起線561ナノメートル、8ビットのダイナミックレンジ、1024 x 1024ピクセルを選択します。
10ナノメートル帯域幅の蛍光発光スペクトルと、570〜760ナノメートルの範囲内の4ナノメートルのラムダステップサイズを収集します。ピンホールを1つのエアユニットに設定し、ラムダスキャン取得を実行します。このプロセスをさまざまな視野で、赤と緑のライトのさまざまな条件下で繰り返した後、すべてのデータを保存します。
ラムダスキャンが取得されたら、ソフトウェアの上部にある定量ウィンドウをクリックして、収集された蛍光発光スペクトルを評価します。開いているプロジェクトウィンドウに移動し、XYラムダファイルを1つ選択します。イメージングソフトウェアでスタックプロファイル解析を選択し、細胞の中心に4マイクロメートル四方の関心領域を定義して、平均蛍光強度を分析します。
データとCSVをエクスポートしてから、さまざまな条件下でさまざまなセルでプロセスを繰り返す。次に、CSVファイルを開き、CSVファイル内のフィコエリスリンフィコシアノビリン、C.フィコシアニン、アロフィコシアニン、クロロフィルAの最大蛍光データをそれぞれ選択することにより、すべての測定対象領域の異なる蛍光発光ピークを選択します。完了したら、各フィコビリタンパク質とクロロフィルピークから得られたすべての最大蛍光値を含む新しいテーブルを作成し、データをグラフにプロットします。
平均蛍光強度に有意差は認められなかった。フィコエリスリンフィコシアノビリンの平均蛍光強度は、細胞が単色緑色光にさらされると有意に減少した。対照的に、対照と比較して赤色光に差は認められなかった。
緑色光は、アロフィコシアニンとクロロフィルAに逆の効果をもたらし、とりわけアンテナ複合体の量の増加または接続性の改善によるアンテナ複合体の適応により、平均蛍光強度が大幅に増加しました。赤色光は、アロフィコシアニンおよびクロロフィル蛍光の有意でない増加をもたらした。培養中の細胞に対するさまざまな増殖条件の影響を調べるには、まったく同じ顕微鏡設定で測定を行うことが重要です。
自家蛍光生物の培養に関連する他の環境パラメータや、可視スペクトル内の蛍光シグナルを分析することが可能です。この技術は、いくつかの自己蛍光色素を有する生命生物を研究するための非常に強力なアプローチである。
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概要
このプロトコルは、自家蛍光イメージングを使用して紅藻のフィコビリプロテインの変化を評価する非破壊的な方法を概説しています。これは特に、従来の培養方法が困難な極端な環境における細胞の適応を研究するのに有用です。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 生態学
背景
- 微細藻類はしばしば極端な環境に生息します。
- 従来の実験室での成長方法は効果的でない場合があります。
- 自家蛍光イメージングはラベルフリーの分析を提供します。
- この技術は化学化合物を避けることでアーチファクトを最小限に抑えます。
研究の目的
- 微細藻類の生態学的挙動を分析すること。
- 極端な生息地への適応を理解すること。
- 自栄養生物のパフォーマンスをモニタリングする手法を開発すること。
使用された方法
- アガー培養から海水培地への接種物の準備。
- 特定の光と温度条件下での培養の維持。
- イメージング用の共焦点顕微鏡の使用。
- 分析のための色素の自家蛍光の評価。
主要な結果
- 紅藻のフィコビリプロテインの成功したイメージング。
- 微細藻類の生態学的適応に関する洞察。
- 非侵襲的技術の有効性の実証。
- 観光洞窟のような環境のモニタリングへの潜在的な応用。
結論
- 自家蛍光イメージングは微細藻類を研究するための貴重なツールです。
- この方法は生態学的ダイナミクスの理解に役立ちます。
- これは極端な環境でのさらなる研究の道を開きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Autofluorescence imaging of red algae pigments enables non-invasive, quantitative assessment of photosynthetic adaptation under variable light conditions, supporting early-stage discovery in photosynthetic organism research. This approach is particularly valuable for evaluating physiological responses in slow-growing or extreme-environment strains, where traditional culturing is impractical. The method enhances predictive confidence in selecting and optimizing model systems for biopharma R&D pipelines focused on photosynthetic biology and pigment-based functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of pigment adaptation mechanisms at the cellular level.
- Supports functional validation of photosynthetic targets under controlled light conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying pigment responses to environmental variables.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible fluorescence readouts for assay development.
- Allows preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
- Enables quantitative comparison of pigment responses across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pigment adaptation data with environmental relevance for translational model selection.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in photosynthetic research.
- Reduces risk in advancing slow-growing or extreme-environment strains for further study.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for photosynthetic organism research, enabling robust hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Quantifies pigment adaptation to light, clarifying photosynthetic pathway responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides emission spectra and intensity data for statistical comparison of experimental variables.
- Translational Research: Informs model selection for studies in environmentally relevant or extreme conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, non-destructive platform for pigment-based physiological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pigment function and adaptation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for advancing photosynthetic models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of slow-growing or extreme-environment strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and spectral analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of microscope settings for cross-condition comparability.
- May require adaptation for different pigment profiles or organism types.
- Limited to organisms with detectable autofluorescent pigments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Sample Preparation for Reproducing Monochromatic Light Effect
1:50
Autofluorescence Imaging
3:16
Parameters to Evaluate Chroothece’s Physiology
4:21
Results: Autofluorescence Imaging and Evaluation of Phycobiliprotein Changes in Red Algae Based on Spectral Analysis
5:08
Conclusion
