Name: イメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶイメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化手法。CNNモデル構築と細胞画像解析により、DNA損傷評価の高精度・高スループットスクリーニングを実現します。

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<ol><li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project+initiative+and+review+of+validation%2C+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hygiene+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li>
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<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li>
<li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test%3A+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations%2C+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated%2C+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li>
<li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li>
<li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li>
<li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry%3A+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li>
<li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream%C2%AE+imaging+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+FlowSight%C2%AE+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li>
<li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li>
<li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Systems+Biology+and+Applications%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20(2021).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324(2019).</li>
<li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li>
</ol>

著者らは、ImageStreamイメージングフローサイトメーターと本研究で使用したAmnis AIソフトウェアのメーカーであるDiaSorin CompanyであるLuminex Corporationに雇用されています。

ここで紹介する研究では、MNアッセイのスコアリングを自動化するためのディープラーニングアルゴリズムの使用について説明しています。最近のいくつかの出版物は、直感的でインタラクティブなツールが、深い計算知識を必要とせずに画像データを分析するための深層学習モデルの作成を可能にすることを示しています18,19。ユーザーインターフェイス駆動型ソフトウェアパッケージを使用してこの作業で説明されているプロトコルは、非常に大きなデータファイルでうまく機能し、ディープラーニングモデルを簡単に作成できるように設計されています。AIソフトウェアパッケージでRFおよびCNNモデルを作成およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明し、アッセイのCyt-Bバージョンと非Cyt-Bバージョンの両方ですべての重要なイベントの高精度な識別と定量化を可能にします。最後に、これらのディープラーニングモデルを使用して追加データを分類し、化学的細胞毒性とMN頻度を評価する手順について説明します。
<p class="jove_conte...

小核(MN)アッセイは、ヒト用の化粧品、医薬品、および化学物質の開発におけるDNA損傷を評価するための遺伝毒物学の基本です1,2,3,4。小核は、分裂後に核に取り込まれず、核とは別の小さな円形体に凝縮する染色体全体または染色体断片から形成されます。したがって、MNは、遺伝毒性試験1におけるDNA損傷を定量するためのエンドポイントとして使用できます。
MNを定量するための好ましい方法は、サイトカラシン-B(Cyt-B)を用いて分裂をブロックすることによって一回分裂した二核細胞(BNC)内である。このバージョンのアッセイでは、細胞毒性は、単核(MONO)および多核(POLY)細胞のスコアリングによっても評価されます。このアッセイは、ブロックされていないMONO細胞におけるMNをスコアリングすることによっても実行することができ、これはより速く、より簡単にスコアリングすることができ、増殖を評価するために曝露前および曝露後の細胞カウントを使用して細胞毒性を評価する5,6。
アッセイの物理的スコアリングは、すべての重要なイベントを視覚的に確認できるため、歴史的に手動顕微鏡によって行われてきました。しかし、手動顕微鏡は困難で主観的です1。そのため、顕微鏡スライドスキャンやフローサイトメトリーなどの自動化技術が開発されていますが、それぞれに独自の利点と制限があります。スライドスキャン法では重要なイベントを視覚化できますが、スライドは最適なセル密度で作成する必要があり、達成が困難な場合があります。さらに、この手法は細胞質の可視化を欠いていることが多く、MONO細胞とPOLY細胞のスコアリングを損なう可能性があります7,8。フローサイトメトリーはハイスループットなデータキャプチャを提供しますが、細胞を溶解する必要があるため、Cyt-B型のアッセイを使用することはできません。さらに、非イメージング技術として、従来のフローサイトメトリーは重要な事象の視覚的検証を提供しない9、10。
そのため、MNアッセイを行うためにイメージングフローサイトメトリー(IFC)が検討されている。ImageStreamX Mk IIは、従来のフローサイトメトリーの速度と統計的堅牢性を、顕微鏡の高解像度イメージング機能を単一のシステムで組み合わせた11。IFCを使用することにより、すべての主要なイベントの高解像度画像をキャプチャし、特徴ベースの12,13または人工知能(AI)技術14,15を使用して自動的にスコアリングできることが示されています。IFCを使用してMNアッセイを行うことにより、顕微鏡検査と比較して、より短時間でより多くの細胞を自動的にスコアリングすることができます。
この作業は、前述の画像分析ワークフロー16 から逸脱し、Amnis AIソフトウェア(以下「AIソフトウェア」と呼ぶ)を使用してランダムフォレスト(RF)および/または畳み込みニューラルネットワーク(CNN)モデルを開発およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明します。AI支援タグ付けツールを使用したグラウンドトゥルースデータの入力、モデルトレーニング結果の解釈、追加データを分類するためのモデルの適用など、必要なすべてのステップが説明されており、遺伝毒性と細胞毒性の計算が可能になります15。

<table><tbody><tr><td>15 mL遠心チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>クレンザー - コールタークレンツ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546931</td><td>容器に200mLのクレンザーを充填します。&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-86-8</td><td></td></tr><tr><td>コーニング ボトルトップ真空フィルター&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS430769</td><td>0.22 & マイクロ;m フィルター、500 mL ボトル</td></tr><tr><td>サイトカラシン B</td><td>ミリポアシグマ</td><td>14930-96-2</td><td>5 mg ボトル</td></tr><tr><td>デバプラー - 70% イソプロパノール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>1.3704</td><td>容器に 200 mL のデバプラーを充填します。&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水 1X</td><td>EMD ミリポア</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++MG++ 無料&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 10%、メタノールフリー Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>これが4%と1%のホルマリンに使用されているものです。注意:ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入および飲み込むと有毒です。&nbsp;目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。&nbsp;吸入や皮膚接触により感作性を引き起こす可能性があります。目に重大な損傷を与える恐れがあります。&nbsp;潜在的ながんの危険性があります。&nbsp;http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Guava Muse Cell Analyzer</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td>標準構成のGuava Muse Cell Analyzerを使用しました。</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>10 mg/mL solution</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>MilliporeSigma</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>Luminex, a DiaSorin company</td><td>100220</td><td>405 nm、488 nm、642 nm レーザーを搭載した 2 台のカメラ ImageStreamX Mark II を使用しました。</td></tr><tr><td>MIFC解析ソフトウェア - IDEAS</td><td>Luminex, a DiaSorin company</td><td>100220</td><td>"画像解析ソフトウェア" MIFC (ImageStreamX MKII)のコンパニオンソフトウェアMIFC</td></tr> <tr><td>software - INSPIRE</td><td>Luminex, a DiaSorin社</td><td>100220</td><td>"Image acquisition software" これは、MIFC(ImageStreamX MKII)を実行するソフトウェアです</td></tr><tr><td>Amnis AIソフトウェア</td><td>Luminex、DiaIsorinの会社</td><td>100221</td><td>「AIソフトウェア」 これは、データを分析するための人工知能モデルの作成を可能にするソフトウェアです</td></tr><tr><td>マイトマイシン C</td><td>ミリポアシグマ</td><td>50-07-7</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 混合物 100x</td><td>ロンザ バイオウィテカー</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>ペニクリン/ストレプトマイシン/グルタミン溶液 100X</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>リンス - 超純水または脱イオン水</td><td>NA</td><td></td><td>NA 超純水または脱イオン水を使用してください。&nbsp;容器に900mLのリンスを入れます。</td></tr><tr><td>RNase</td><td>MilliporeSigma</td><td>9001-99-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>シース - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>これはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 1x&nbsp;Ca++MG++無料&nbsp;容器に900mLのシースを入れます。</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>HyClone</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>滅菌器 - 0.4%&ndash;0.7% 次亜塩素酸</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>これは、クロロックス漂白剤を水で溶出させることによって作ることができる 10% クロロックス漂白剤です。&nbsp;容器に200mLの滅菌器を入れます。</td></tr><tr><td>T25フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TK6細胞</td><td>ミリポアシグマ</td><td>95111735</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

小核(MN)アッセイは、化学物質の遺伝毒性を評価するために世界中の規制機関によって使用されています。アッセイは2つの方法で実施することができる:一度分裂した、細胞質分裂がブロックされた二核細胞または完全に分裂した単核細胞におけるMNをスコアリングすることによって。歴史的に、光学顕微鏡はアッセイをスコアリングするためのゴールドスタンダードの方法でしたが、それは面倒で主観的です。フローサイトメトリーは、近年、アッセイのスコアリングに使用されていますが、細胞画像の重要な側面を視覚的に確認できないため、制限されています。イメージングフローサイトメトリー(IFC)は、ハイスループット画像キャプチャと自動画像解析を組み合わせたもので、MNアッセイのすべての重要なイベントの画像を迅速に取得し、スコアリングするために成功裏に適用されています。最近、畳み込みニューラルネットワークに基づく人工知能(AI)手法を使用して、IFCが取得したMNアッセイデータをスコアリングできることが実証されました。このホワイトペーパーでは、AIソフトウェアを使用してディープラーニングモデルを作成し、すべての主要なイベントをスコアリングし、このモデルを適用して追加データを自動的にスコアリングするためのすべての手順について説明します。AIディープラーニングモデルの結果は、手動顕微鏡と比較して優れているため、IFCとAIを組み合わせることでMNアッセイの完全に自動化されたスコアリングが可能になります。

図1は、AIソフトウェアを使用してMNアッセイのモデルを作成するためのワークフローを示しています。ユーザーは、目的の.dafファイルをAIソフトウェアにロードし、AI支援クラスター(図2)と予測(図3)タグ付けアルゴリズムを使用して、オブジェクトをグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てます。すべてのグラウンドトゥルースモデルクラスに十分なオブジェクトが入力されたら、RFまたはCNNアルゴリズムを使用してモデルをトレーニングできます。トレーニング後、クラス分布ヒストグラム、精度統計、対話型の混同行列などのツールを使用してモデルのパフォーマンスを評価できます(図4)。AIソフトウェアの結果画面から、ユーザーはワークフローのトレーニング部分に戻ってグラウンドトゥルースデータを強化するか、十分な精度が達成された場合、ユーザーはモデルを使用して追加のデータを分類できます。
<p class="jov...

小核(MN)アッセイは、DNA損傷を定量化するための確立されたテストです。ただし、手動顕微鏡や特徴ベースの画像分析などの従来の手法を使用してアッセイをスコアリングすることは、面倒で困難です。この論文では、イメージングフローサイトメトリーデータを使用してMNアッセイをスコアリングするための人工知能モデルを開発する方法論について説明します。

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

イメージングフローサイトメトリーを使用して小核アッセイを実行すると、スループットの低さ、スコアのばらつき、イベントの目視による確認の欠如など、従来の方法の多くの制限を克服できます。この手法の主な利点は、すべての重要なイベントをイメージングフローサイトメトリーを使用して取得し、人工知能を使用して分析できることです。この方法は、化学物質やその他の化合物の大規模なスクリーニングに使用され、現在利用可能なよりも高いスループットで毒性を試験できる可能性があります。新しいAIモデルを構築する場合、小核を持つ細胞の十分な画像を取得することが主な課題であるため、画像タグ付けアルゴリズムを使用することが重要です。まず、人工知能またはAIソフトウェアを起動します。[実験の種類] で、[トレーニング] の横にあるラジオ ボタンをクリックして、畳み込みニューラル ネットワークまたは CNN モデルを構築するためのトレーニング実験を開始し、[次へ] をクリックします。[クラス名] で、[追加] をクリックします。ポップアップウィンドウで、単核クラスと入力し、[OK]をクリックして単核クラスをクラス名のリストに追加します。このプロセスを繰り返して、MNで単核、二核、MNで二核、多核、不規則な形態などの他のクラス名を追加します。[ファイルの選択]で、[ファイルの追加]をクリックし、AIソフトウェアに追加する目的のファイルを参照して、グラウンドトゥルースデータを構築します。次に、[ベースポピュレーションの選択] 画面で、ポピュレーション階層から非アポトーシスポピュレーションを見つけます。次に、非アポトーシス集団を右クリックし、[一致するすべての集団を選択]を選択して、[次へ]をクリックします。小核を持つ単核細胞のタグ付き真理値集団を割り当てるには、左側のモデルクラスで単核細胞とMNクラスをクリックし、右側で適切なタグ付けされた真理値母集団をクリックします。すべての適切な真理値母集団が割り当てられたら、次へをクリックします。[チャネルの選択] 画面で、実験に適したチャネルが選択されていることを確認します。ここでは、チャネル1として明視野またはBFを選択し、チャネル7としてDNAの群れを選択し、[次へ]をクリックします。最後に、[確認] 画面で [実験の作成] をクリックします。[タグ付け]をクリックして、タグ付けツールのインターフェイスを起動します。次に、ズームツールをクリックして、見やすくするために画像をトリミングします。そして、スライダーバーをクリックして画像サイズを調整し、ギャラリーに表示する画像の数を決定します。[表示設定]オプションをクリックし、すべての主要なイベントを識別するのに最適なコントラスト画像を提供するmin-maxを選択します。次に、[ギャラリーディスプレイのセットアップ]をクリックして、DNA画像の色を黄色または白に変更し、小さなオブジェクトの視覚化を改善します。[クラスター] をクリックしてアルゴリズムを実行し、類似した形態を持つ画像をグループ化します。クラスタリングが完了したら、個々のクラスタをクリックして、適切なモデルクラスへの画像の割り当てを開始します。各モデル クラスに少なくとも 25 個のオブジェクトが割り当てられると、予測アルゴリズムが使用可能になります。[予測] をクリックします。予測アルゴリズムの実行が完了したら、予測クラスから適切なモデル クラスにオブジェクトを追加します。各モデル クラスに最低 100 個のオブジェクトが割り当てられたら、画面上部の [トレーニング] タブをクリックし、[トレーニング] ボタンをクリックします。モデルのトレーニングが完了したら、[結果の表示] をクリックしてモデルの精度を評価します。モデルのトレーニングが完了したら、メニュー ボタンをクリックして新しい実験を定義します。[実験の種類] で、[分類] の横にあるラジオ ボタンをクリックして分類実験を開始し、[次へ] をクリックします。分類に使用するモデルをクリックし、[次へ] をクリックします。[ファイルの選択]画面で、[ファイルの追加]をクリックします。CNN モデルで分類するファイルを参照し、[次へ] をクリックします。次に、[ベースポピュレーションの選択]画面で、ロードされたファイルの1つで[非アポトーシスポピュレーション]の横にあるチェックボックスをクリックします。非アポトーシス集団を右クリックし、[一致するすべての集団を選択]をクリックして、ロードされたすべてのファイルからこの母集団を選択し、[次へ]をクリックします。チャンネルの選択画面で、明視野にチャンネル1が選択され、DNA染色にチャンネル7が選択されていることを確認し、次へをクリックします。最後に、確認画面で [実験の作成] をクリックします。AIソフトウェアは、選択したデータファイルから選択したモデルとすべての画像をロードします。ロード後、[完了]をクリックします。次に、[分類]をクリックして分類画面を起動します。また、チェックボックスを使用して、ランダムフォレストまたはRF、およびCNNの使用を選択します。次に、[分類]ボタンをクリックします。これにより、RF モデルと CNN モデルを使用して追加データを分類し、指定したモデル クラスに属するすべてのオブジェクトを識別するプロセスが開始されます。分類が完了したら、[結果の表示] をクリックします。[DAFの更新]ボタンをクリックして[分類結果を含むDAFの更新]ウィンドウを表示し、[OK]をクリックしてDAFファイルを更新します。レポートを生成するには、結果画面で [レポートの生成] をクリックします。入力 DAF ごとに個別のレポートが必要な場合は、[入力 DAF ごとにレポートを作成] の横にあるチェックボックスをオンにします。それ以外の場合は、[OK]をクリックしてレポートを取得します。AI支援クラスターアルゴリズムは、未分類のオブジェクトとグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てられたオブジェクトの両方の形態に従って、セグメント内の類似したオブジェクトをグループ化します。単核細胞を含むクラスターはオブジェクト マップの片側にあり、多核細胞は反対側にあります。二核細胞クラスターは、単核細胞クラスターと多核細胞クラスターの間にあります。最後に、不規則な形態を持つクラスターは、オブジェクトマップのさまざまな領域に分類されます。予測アルゴリズムは、画像内の微妙な形態を識別する上で、クラスターアルゴリズムよりも堅牢です。例えば、MNを含む単核細胞とMNを含まない単核細胞。モデルのパフォーマンスは、クラス分布ヒストグラム、精度統計、対話型混同行列などのツールを使用して評価できます。クラス分布ヒストグラムでは、真理値と予測母集団の間のパーセンテージ値に近いほど、モデルの精度が高くなります。精度統計では、これらのメトリックが 100% に近いほど、モデルはモデル クラス内のイベントをより正確に識別できます。最後に、対話型の混同行列は、モデルがイベントを誤って分類する場所を示します。遺伝毒性は、サイトカラシンB法と非サイトカラシンB法の両方を使用して、マンニトール、エトポシド、マイトマイシンCについて、顕微鏡による小核の割合(明確なバーで示され、AIは点線のバーで示され、3時間の曝露と24時間の回復後)で測定されました。トレーニング実験を作成するときは、読み込んだデータにポジティブ コントロール サンプルとネガティブ コントロール サンプルの画像が含まれていることを確認します。小核はまれであり、正確なAIモデルを構築するには十分な画像が必要です。この手順により、放射線生物線量測定などのあらゆる研究分野でイメージングフロー小核データを分析するためのAIモデルを作成できます。小核を特定するための迅速かつ堅牢なAIベースの方法は、癌発生のリスクを予測する可能性のある小核の定量化など、他のアプリケーションに拡張される可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

このプロトコールは、超高速マイクロ流体流における単一細胞イメージングのための非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡検査システムの実施およびイメージングフローサイトメトリーにおけるその応用を記載する。...

非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー

インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

このプロトコルは、細胞の生存率を効率的に決定するための、高速で高スループット、信頼性、安価、および公平なアッセイを記述します。このアッセイは、細胞のミトコンドリアが損傷し、他のアッセイに干渉する場合に特に有用である。このアッセイは、Hoechst...

マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

画像を分析する人工知能(Ai)の使用は、一般的に使用される方法と比較して、強力でバイアスが少なく、迅速なアプローチとして浮上しています。ここでは、細胞小器官、一次繊毛を認識し、厳密かつ再現可能な方法で長さや染色強度などの特性を分析するためにAiを訓練しました。...

一次繊毛の評価に対する人工知能のアプローチ

マルチウェルマイクロプレートを用いた自動アッセイは、単一の実験で多数の条件の評価を可能にすることによって経路調節因子を同定するための有利なアプローチである。ここでは、十分に確立されたマクロピノソームイメージングおよび定量プロトコルを96ウェルマイクロプレート形式に適合させ、マルチモードプレートリーダーを使用した自動化の包括的な概要を提供します。...

蛍光標識マクロピノソームの定量のための自動イメージングおよび分析

我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。...

マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。...

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

この記事では、さまざまな細胞密度で検証されたオープンソースの実行可能プログラムを使用して、画像ベースの核定量を自動化する方法を段階的に説明します。このプログラムは、コスト、技術的なスキルセットが限られているユーザーのアクセシビリティ、および既存のテクノロジーの有用性を制限する可能性のあるアプリケーション固有の検証に関連する障壁に対処する代替手段を提供します。...

コンピュータビジョンライブラリを使用して核の定量を効率化

学ぶイメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化手法。CNNモデル構築と細胞画像解析により、DNA損傷評価の高精度・高スループットスクリーニングを実現します。

イメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化

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