Name: 大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学ぶ大腸菌の抗生物質持続性の集団・単一細胞解析法。古典的微生物学アッセイと単一細胞ライブイメージングを組み合わせ、持続性表現型の分子・細胞的特性を解明する手法です。

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ヴァンメルダーレンラボでの作業は、ARCアクション2018-2023、国立科学研究センター財団(FNRS CDR J.0182.21F)によってサポートされています。T.O.はULBフェローシップによってサポートされています。T.S.はFRIAフェローシップ(FNRS)によってサポートされています。JCは、ポスドクフェローシップ「シャルジェデレシェルシュ」(FNRS)によってサポートされています。

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li>
<li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+mutagenesis%2C+gambler+cells%2C+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074(2022).</li>
<li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li>
<li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413(2018).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986(2020).</li>
<li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li>
<li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25(2013).</li>
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<li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li>
<li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li>
<li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286(2022).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis%3A+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state%5BTitle%5D)+AND+%22microLife%22%5BJournal%5D)">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+%C3%9F-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426(2019).</li>
<li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118(2021).</li>
<li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li>
<li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194(2021).</li>
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<li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation%3A+Stress%2C+metabolism%2C+the+host%2C+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14(2018).</li>
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<li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li>
<li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET%3A+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522(2014).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+A+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
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著者は競合する利益を宣言しません。

この論文で提示されたプロトコルは、集団および単一細胞レベルでの抗生物質治療に応答して観察された持続表現型の分析を可能にします。実験は、化学的に定義された培地(MOPSグリセロール0.4%)で増殖させた大腸菌MG1655株を用いて行った。タイムキルアッセイおよび顕微鏡実験は、指数相培養で実施した。フルオロキノロンであるOFXを5 μg・mL−1の濃度で使用し、持続性細胞を明らかにしました。ここで説明するアプローチは、他の殺菌性抗生物質、例えばβ−ラクタム、アミノグリコシド、または抗菌化合物に適用することができる31。したがって、他の細菌株、培地、または増殖条件を使用することができる。ここで説明したものと同様の設定で異なる蛍光融合をモニタリングすることは、抗生物質治療の前、最中、および後に、DNA複製32、DNA修復25、33、および細胞分裂34などの細胞プロセスを追跡するのに役立ちます。同様に、蛍光レポーターを利用して、細胞内pH35、ATP36、またはROS37レベルなどの細胞生理学の異なる側面を調べることができます。蛍光融合の代わりに、化学染料も適用できます。例えば、hupA-mCherry融合は、DNA38を染色する蛍光色素である4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)に置き換えることができます。ただし、このような蛍光色素と組み合わせてタイムラプス顕微鏡を行うことは、これらの染色技術がタイムラプス実験中の細胞周期のダイナミクスを乱す可能性があるため、避ける必要があります。あるいは、そのような実験は、関連する時点でのスナップショット画像の時間経過分析に置き換えることができる。
このような蛍光レポーターは役に立ちますが、位相差画像の解析で抽出できる情報量も無視してはなりません。ここでは、増殖、OFX処理、および回復段階を通じて細胞長の進化を監視しました。細胞幅、位相差強度、細菌細胞の曲率など、位相差画像に基づく他のパラメータも、MicrobeJ27などの適切なソフトウェアを使用して簡単に抽出できます。
要約すると、ここで説明する手順は、変化する環境またはストレッサーに対する細胞応答をモニターするために、他の条件および細菌種に適用することができる18、19。他の蛍光レポーター(転写および翻訳レポーター、化学色素)をフローサイトメトリー/FACSなどのポピュレーション解析と組み合わせて使用 することにより、興味深い質問にマルチスケールフレームワークで対処できます。

このプロトコルは、単一細胞および集団レベルでの特定の抗生物質治療に応答した細菌持続表現型を分析することを目的としています。持続性とは、同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質(フルオロキノロン、アミノグリコシド、βラクタムなど)に耐える能力を表し、いわゆる持続性細胞の最小阻害濃度(MIC)は集団の大部分と同じです。抗生物質の存在下で細菌の生存を経時的に測定する場合、二相性殺傷動態は、非持続性細胞の最初の急速な根絶、続いて持続性細胞のはるかに遅い殺傷率を伴う、一過性の薬剤耐性細胞の存在を明らかにする。抗生物質を除去すると、これらの細胞は遺伝的に同一の集団を生じさせ、同じ抗生物質で処理した場合と同様の殺傷動態を示します1,2。持続性とは対照的に、抗生物質耐性は集団レベルで定義され、一般にde novo変異または耐性付与プラスミド3の水平遺伝子導入のいずれかの結果です。耐性の原因となる変異は、主に薬物の標的または薬物排出ポンプのプロモーター領域にありますが、ゲノムワイドおよび標的変異体解析アプローチによって特定された持続頻度を変化させる遺伝子は、多数かつ多様であることが証明されています2,3,4,5,6,7,8 .したがって、細菌細胞は複数の経路9,10,11を介して持続性状態に入る可能性があり、これらの持続性細胞の生理機能を特徴付けるには、単一細胞レベルで持続現象を調べるアプローチが必要です。
蛍光顕微鏡と組み合わせて使用されるマイクロ流体ツールの最近の開発は、持続性表現型の特性評価への道を開き、染色体複製12、DNA修復13、細胞分裂14などの重要な細胞プロセスの役割を強調しました。この論文では、高用量のオフロキサシンで処理された指数関数的に成長する大腸菌培養物で生成された持続性細胞を特徴付けるために、古典的な微生物学アッセイとシングルセルライブイメージングを組み合わせた統合アプローチについて説明します。ここで説明するプロトコルは、枯草菌などの他の細菌種における抗生物質持続現象を研究するために適用することができ15、または条件(例えば、βラクタム治療後の抗生物質持続性16)を研究することができ、表現型の不均一性を含む多くの現象を調査するために容易に変更することができる17、18、19.さらに、この論文に記載されているセットアップを他の蛍光レポーターと組み合わせて、単一細胞レベルでのpH20またはATP21の細胞内レベルなど、関心のある明確な細胞パラメーターを調べることができ、抗生物質の持続現象に関する新しい洞察を生み出す可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>倒立蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.02382.0250</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地</td></tr><tr><td>CellASIC ONIXマイクロ流体システム&nbsp;</td><td>メルク</td><td>CAX2-S0000&nbsp;</td><td>マイクロ流体システム</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>メルク</td><td>ONIX2 1.0.1&nbsp;</td><td>マイクロ流体ソフトウェア</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2マニホールドベーシック&nbsp;</td><td>メルク</td><td>CAX2-MBC20</td><td>マニホールドシステム</td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td>メルク</td><td>1.02539.0100</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地</td></tr><tr><td>用 CuSO.5H2O</td><td>メルク</td><td>1.02790.0250</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地D</td></tr><tr><td>-(+)-グルコース</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>用G7021-1KG</td><td>MOPSグルコース0.4%成長用炭素源</td></tr><tr><td>大腸菌 K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td><td></td><td>BE10</td><td>wt参照株、実験室株</td></tr><tr><td>大腸菌 K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td><td></td><td>BE16</td><td>HU-mCherry融合 天然遺伝子座でのP1形質導入を介して統合、 実験室株</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O&nbsp;</td><td>VWRケミカルズ</td><td>24244.232MOPS</td><td>グルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://fiji.sc/&nbsp;</td><td>画像ソフトウェア;Schindelin et al. If used in publication</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>56815</td><td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; マルチウェル培養プレート</td><td>Merck</td><td>M8812-100EA</td><td>24ウェル 透明平底 2ml 容量培養プレート 自動プレートリーダー用</td></tr><tr><td>H3BO3&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地用</td></tr><tr><td>浜松オルカフラッシュ4.0 デジカメ</td><td>浜松</td><td>C13440-20CU</td><td>デジタル画像取得</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>メルク</td><td>1.05099.1000</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地</td></tr><tr><td>用 KOH</td><td>メルク</td><td>1.05029.1000</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長媒体</td></tr><tr><td>K2SO4&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.05153.0500</td><td>MOPS グルコース 0.4% および MOPS グリセロール 0.4% 増殖培地</td></tr><tr><td>Luria-Broth 寒天培地</td><td>Invitrogen</td><td>22700041</td><td>プレーティングアッセイ用増殖培地</td></tr><tr><td>Luria-Broth 培地</td><td>Invitrogen</td><td>12780029</td><td>MIC 測定用増殖培地</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.05832.1000</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%増殖培地</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>メルク</td><td>7487-88-9</td><td>10mM Microbeで使用される細菌生存アッセイ用の希釈溶液</td></tr><tr><td>J&nbsp;</td><td>Imagej / Fijiプラグイン</td><td>https://www.microbej.com/</td> <td>顕微鏡画像分析プラグイン。Ducret et al.for 出版中;検出設定:細菌の場合:エリア(&mu;m2):0,1-最大;長さ (&mu;m):0,5-最大;幅 (&mu;m):0,6-最大;範囲 (&mu;m):0,5-最大;角度(rad):0-0,3;0-max(他のすべてのパラメータの場合)。&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロ流体プレート CellASIC ONIX</td><td>Merck</td><td>B04A-03-5PK&nbsp;</td><td>マイクロ流体システム用プレート</td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Merck</td><td>1.05927.0100</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地</td></tr><tr><td>MOPSの場合、遊離酸ULTROL&reg;グレード</td><td>メルク</td><td>475898-500GM</td><td>MOPS グルコース 0.4% および MOPS グリセロール 0.4% 成長培地</td></tr>用 <tr><td>NaCl</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>MOPS グルコース 0.4% および MOPS グリセロール 0.4% 成長培地</td></tr> <tr><td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td><td>メルク</td><td>1.01180.0250</td><td>MOPS グルコース 0.4% および MOPS グリセロール 0.4% 成長培地</td></tr><tr><td>NH4Cl&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.01145.0500</td><td>MOPS グルコース 0.4% および MOPS グリセロール 0.4% 増殖培地用</td></tr><tr><td>オフロキサシン</td><td>メルク</td><td>82419-36-1</td><td>細菌細胞の治療に使用されるフルオロキノロン系抗生物質</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4, 1x</td><td>メルク</td><td>P3813</td><td>希釈緩衝液</td></tr><tr><td>GENESYS 10S 紫外可視分光光度計</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;840-208200</td><td>紫外可視分光光度計、シングル/6セルホルダー、プリンター付き光学密度の測定 OD600nm</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>マイクロプレートリーダーソフトウェア</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroxym&eacute;thyl)-m&eacute;thyl]-グリシン</td><td>メルク</td><td>1.08602.0250</td><td>MOPSグルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地</td></tr><tr><td>Zeiss&reg; 浸漬油 518F</td><td>Zeiss</td><td></td><td>顕微鏡の分解能を向上させるための浸漬油</td></tr><tr><td>Zen3.2 Pro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>顕微鏡画像取得および処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.08883.0500MOPS</td><td>グルコース0.4%およびMOPSグリセロール0.4%成長培地用</td></tr></tbody></table>

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

抗生物質の持続性とは、少量の細菌亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を指します。.殺菌性抗生物質処理により、細菌集団の大部分は急速に殺されます。この最初の急速な殺傷段階に続いて、持続性細胞が生存し続けるにつれて、殺傷率が大幅に低下します。古典的には、持続性は、高用量の抗生物質で、定義された曝露時間に対して実行される時間/キルアッセイによって集団レベルで決定されます。この方法は、持続性細胞のレベルと殺傷動態に関する情報を提供しますが、持続性現象の根底にある固有の細胞間の不均一性を反映していません。ここで説明するプロトコルは、従来のTime/Killアッセイとリアルタイム蛍光顕微鏡を使用したシングルセル分析を組み合わせたものです。適切な蛍光レポーターを使用することにより、生細胞の顕微鏡イメージングは、染色体の複製と分配、細胞伸長、細胞分裂などの細胞プロセスに対する抗生物質の影響に関する情報を提供できます。集団解析とシングルセル解析を組み合わせることで、持続性表現型の分子的および細胞的特性評価が可能になります。

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌 を致死量のオフロキサシンに曝露した後の分子および細胞レベルで抗生物質持続表現型を特徴付けるためのアプローチを組み合わせたものです。

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

ここで説明するプロトコルは、高オフロキサシン処理後の大腸菌持続細胞を特徴付けるために、古典的な微生物学アッセイとシングルセルライブイメージングを組み合わせた統合方法を提供します。この手法の主な利点は、集団および単一細胞レベルで持続現象を解析できることです。集団解析とシングルセル解析を組み合わせることで、持続性表現型の分子的および細胞的特性評価が可能になります。まず、LB寒天プレート上の凍結グリセロールストックから目的の細菌株をストリークし、摂氏37度で一晩15〜19時間インキュベートして、単一のコロニーを取得します。単離したコロニーを、0.4%グルコースを添加した5ミリリットルのMOPS増殖培地を含むガラス管に接種し、必要に応じて選択的抗生物質を培地に加えます。チューブを摂氏37度、180rpmで一晩振とうインキュベーターに入れます。翌日、培養液1ミリリットルを2,300gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを同容量のPBSで穏やかに再懸濁した。600ナノメートルでODを測定し、2ミリリットルの最終体積で0.01の初期OD600に必要な体積を計算します。次に、透明底24ウェルプレートのウェルに2ミリリットルのMOPSグリセロール0.4%培地を加え、計算した一晩培養量を接種します。24ウェルプレートを自動マイクロプレートリーダーに入れて、OD600を24時間監視します。マイクロプレートリーダーを、摂氏37度の温度と140rpmの高い軌道回転で15分ごとにOD600を測定するように設定します。100ミリリットルのLB寒天を溶かし、固化を避けるために摂氏55度でフラスコをストックします。6つの小さなガラスフラスコを準備し、滅菌ピペットを使用して5ミリリットルの液体LB寒天培地を各フラスコにピペットで入れます。5ミリグラム/ミリリットルのロキサシン原液を10マイクロリットル取り、90マイクロリットルの超純水で希釈する。LB寒天培地を含む6つのガラスフラスコのそれぞれに希釈オフロキサシンの量を増やして、オフロキサシン1ミリリットルあたり0〜0.1マイクログラムの最終濃度を得る。フラスコを数回回転させて溶液を混合し、抗生物質を添加したLB寒天培地を6ウェル培養プレートに注ぎます。寒天が固まるまで冷まし、プレートを乾かしてからご使用ください。一晩の細菌培養物をPBSで1ミリリットルあたり10〜7分の1のCFUの最終細胞密度に希釈します。乾燥した6ウェルプレートのすべてのウェルに2マイクロリットルの希釈培養物を見つけます。プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩入れる前に、スポットを乾かします。翌日、どのオフロキサシン濃度で細菌コロニーの増殖が阻害されているかを確認します。準備したLB寒天約25ミリリットルをペトリ皿に注ぎます。次に、5〜8個の滅菌ガラスビーズを各固化および乾燥プレートに追加します。プレートを反転してラベルを付けます。次に、900マイクロリットルの0.01モル硫酸マグネシウム溶液を含む10倍段階希釈ガラス管を調製する。ガラス管で、新鮮な温度調整培地で一晩培養を最終OD600約0000に希釈し、培養液をインキュベーターで一晩増殖させます。翌日、OD600が0.3に達したら、スポットアッセイデータに従って希釈用の培養液100マイクロリットルを移す。細菌培養物の10倍連続希釈を行う。次に、調製したLB寒天プレート上に100マイクロリットルの希釈培養液をプレート化する。所望の濃度のオフロキサシンを細菌培養物に加え、振とうしながら摂氏37度でインキュベートを続けます。関連する時点で、100マイクロリットルの培養液を回収し、スポットアッセイデータに応じて培養液を希釈します。希釈培養液を100マイクロリットルのLB寒天プレート上にプレート化する。翌日、一晩インキュベートしたプレートのコロニーを、コロニーを検出できる2つの最も高い希釈率でカウントします。T0でのミリリットルあたりのCFUで各時点でのミリリットルあたりのCFUを正規化して生存率を計算し、時間の関数として正規化された対数ベース10の値をプロットします。マイクロ流体プレートのすべてのウェルから保存液を取り出し、新鮮な培地と交換します。マニホールドシステムでマイクロ流体プレートをシールするには、シールボタンをクリックするか、マイクロ流体ソフトウェアを使用します。次に、マイクロ流体ソフトウェアインターフェースで、[液体プライミングシーケンスの実行]をクリックして最初のプライミングシーケンスを実行します。顕微鏡イメージングを開始する前に、顕微鏡の恒温槽内で摂氏37度で最低2時間インキュベートします。次に、実験を開始する前に、2回目の液体プライミングシーケンスの実行を開始します。マイクロ流体ソフトウェアインターフェースのプレートのシール解除をクリックして、マイクロ流体プレートをシールします。ウェル内の培地を、200マイクロリットルの新鮮な培地、抗生物質を含む新鮮な培地、および新鮮な培地中の0.01 OD希釈培養サンプルと交換します。前述のようにマイクロ流体プレートを密封した後、顕微鏡キャビネット内の顕微鏡対物レンズにプレートを置きます。マイクロ流体ソフトウェアで、細胞ローディングシーケンスの実行をクリックして、細胞をマイクロ流体プレートにロードできるようにします。透過光モードを使用して最適な焦点を設定し、フィールドあたり最大300セルの適切なセル数を観察できるいくつかの関心領域を選択します。マイクロ流体ソフトウェアで、カスタムシーケンスの実行を編集して、ウェル1と2に6.9キロパスカルの新鮮な培地を6時間注入し、続いて抗生物質を含む培地を6.9キロパスカルまたは6時間でウェル3に注入し、最後に新鮮な培地を6.9キロパスカルでウェル4と5に24時間注入します。透過光と蛍光レポーターの励起光源を用いて、15分毎に1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを行い、マイクロ流体プログラムを開始します。コンピューターでImageJまたはFijiソフトウェアを開き、ハイパースタックタイムラプス顕微鏡画像をフィジーのローディングバーにドラッグします。[イメージ]、[カラー]、[合成の作成] の順に使用して、ハイパースタックのさまざまなチャネルを融合します。「画像」、「カラー」を使用し、チャンネルが目的の色に対応していない場合は「チャンネルを配置」を使用します。MicrobeJプラグインを開き、手動編集インターフェイスを使用して細菌細胞を検出します。自動的に検出されたセルを削除し、目的の永続セルの輪郭をフレームごとに手動で作成します。検出後、MicrobeJ 手動編集インターフェイスの結果アイコンを使用して、ResultJ テーブルを生成します。ResultJ 表を使用して、単一セル解析の対象となるさまざまなパラメータに関する洞察を得て、ResultJ ファイルを保存します。両株のオフロキサシンのMICは0.06マイクログラム/ミリリットルと決定され、hupA-mCherry融合は同質遺伝子野生株と比較してオフロキサシンの感受性に影響を及ぼさないことが示された。スポットアッセイは、時間経過に伴う適切な希釈、例えば時間ゼロにおける10〜負の第5希釈で単離されたクローンを示した。タイムキルアッセイでは、最初の傾きが非持続性集団の急速な殺傷を反映する典型的な二相性曲線が観察されました。第2段階では殺傷速度が遅くなり、薬剤耐性持続細胞の存在が明らかになりました。特に、タイムキル曲線は、hupA-mCherry融合タンパク質がタイムキル動態に影響を及ぼさないことを示しています。マイクロ流体実験では、最初の増殖期は、細胞がオフロキサシン処理前に生存し、分裂していたことを示しています。この最初の成長段階の後、抗生物質が細胞に到達するとすぐに細胞分裂がブロックされました。オフロキサシン処理後、新鮮な培地で灌流すると、大多数の細胞は増殖を再開することができなかった。対照的に、小さな亜集団は伸長し、持続性細胞として定義される糸状細胞を生成する可能性があります。分裂持続性フィラメントは複数の娘細胞を生成し、そのほとんどは未処理の細胞と同様に成長し、分裂し始めました。細胞長の増加は、総mCherry蛍光強度の増加と相関しており、これは複製の再開と核様体存在量の増加を反映しています。細胞内レポーターを含む株を使用して持続性を研究する場合、レポーターの存在が野生株と比較して成長、MIC、および殺傷を妨げないことは帝国です。ここで説明する手順は、変化する環境またはストレスに対する細胞応答をモニターするために、他の条件および細菌種に適用することができる。同じ設定で他の蛍光レポーターを使用することにより、持続性細胞の生理機能に関する新しい洞察を調べることができます。

population-single-cell-analysis-antibiotic-persistence-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Oms、T.、 et al。大 腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析 J. Vis.

細菌における抗生物質の持続性を研究するためのマイクロ流体タイムラプス顕微鏡

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

ScanLagは、成長の遅延、つまり遅延時間、および数千の細胞の並行成長速度を測定するためのハイスループットな方法です。ScanLagを使用したスクリーニングにより、単一のバリアントのレベルで長い遅延時間と成長の鈍化を区別できます。...

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本方法論文では、細菌の持続性に大きな影響を与える浸透性物質などの化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング戦略を紹介する。...

細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

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この原稿では、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌の抗生物質の生存を評価するための包括的なプロトコルを提供し、プラスミドを 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌...

緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

大 腸菌 細胞侵入の定量および可視化のためのアミカシン保護アッセイ

学ぶ大腸菌の抗生物質持続性の集団・単一細胞解析法。古典的微生物学アッセイと単一細胞ライブイメージングを組み合わせ、持続性表現型の分子・細胞的特性を解明する手法です。

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

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