Name: 3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶ、微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御法。組織工学における再現性のある実験と創傷治癒への応用可能性を向上させるため、ハイドロゲル粒子の特性を最適化する手法を解説します。

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著者らは、国立衛生研究所、国立神経障害および脳卒中研究所(1R01NS112940、1R01NS079691、R01NS094599)、および国立アレルギー感染症研究所(1R01AI152568)に感謝の意を表したい。この作業の一部は、全米ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ(NNCI)の一部として国立科学財団(賞番号ECCS-2025064)によってサポートされているノースカロライナリサーチトライアングルナノテクノロジーネットワーク(RTNN)のメンバーであるデューク大学共有材料計装施設(SMIF)で実施されました。著者らは、細胞培養実験用の3Dプリントデバイスの生成を支援してくれたラボの元ポスドクであるルーカスシルマー博士とイーサンニックロウに感謝したいと思います。

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARAとTSは、この技術に関する仮特許を申請しています。

HA−NBミクロゲルのマイクロ流体生産は、エマルジョンバッチ生産よりも狭い範囲のサイズ分布を有するミクロゲルを生成することが示されている3、9。このプロトコルに記載されているミクロゲルは、材料分解をサポートするためにMMP切断可能な架橋剤(Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)を使用して処方されました。しかしながら、HA−NBミクロゲルは、非分解性であるジチオスレイトール(DTT)などの代替ジチオールリンカーを用いて架橋することもできる。同様に、イルガキュア2959 2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンなどの他の光開始剤を、チオール−エン架橋を促進するためにLAPの代わりにHA−NB前駆体中で使用することができる10。これらのミクロゲルは、3.5重量%の前駆体溶液の粘度がマイクロ流体プラットフォーム上の液滴に挟み込むのに適していることを実証した以前の研究に基...

微多孔性アニール粒子(MAP)足場は、ミクロゲル(μgel)ビルディングブロックが相互結合してバルクの多孔質足場を形成する粒状材料のサブクラスです。これらの顆粒状スキャフォールドのユニークなマイクロアーキテクチャにより、連結された球状ミクロゲル間の空隙空間によって生成される生来の多孔性は、加速された細胞浸潤と遊走をサポートします1。MAP足場のミクロゲルビルディングブロックは、化学修飾された合成ポリマーと天然ポリマーの両方から製造できます2。ここで説明する方法は、官能性ノルボルネン(NB)ハンドルで修飾されたヒアルロン酸(HA)骨格からなるミクロゲルの使用を特に強調している。HAポリマーのNB機能ハンドルは、ミクロゲルを形成し、それらを結合してMAP足場を生成するためのクリック化学反応をサポートします3,4。ミクロゲルを一緒に連結(すなわち、アニーリング)するために、酵素1、光ベースの5,6、および無添加クリックケミストリー3,7反応などの多数のスキームが採用されている。この研究では、HA-NBミクロゲルを相互結合するためのテトラジン-ノルボルネン逆電子要求ディールス-アルダー共役を使用して、無添加クリック化学について説明します。
MAPスキャフォールドを製造するために、ユーザーはまず、バッチシステムまたはマイクロ流体デバイス内で逆エマルジョンを使用し、電気流体力学的スプレー、リソグラフィー、または機械的フラグメンテーションを使用してミクロゲルビルディングブロックを生成します2。球状HA−NBミクロゲルの製造は、バッチエマルジョン2およびマイクロ流体液滴生成技術の両方を用いて十分に記載され、以前に報告されている8、9、10、11。この研究では、球状HA-NBミクロゲルを、前述のように、制御されたサイズおよび形状のためのフロー集束マイクロ流体プラットフォーム上に生成した8,9,10。精製後、ミクロゲルは水性懸濁液中に存在し、詰まった状態を誘発するために濃縮されなければならない。詰まると、ミクロゲルはせん断減粘特性を示し、注射可能な空間充填材料として機能することができます1。詰まった状態を誘発する1つの方法は、凍結乾燥、または凍結乾燥を介してミクロゲルを乾燥させ、続いて乾燥生成物を制御された容量12で再水和することである。あるいは、過剰な緩衝液は、ストレーナー上での遠心分離によって、または吸引または吸収材料を使用してミクロゲルペレットから緩衝液を手動で除去することによって、ミクロゲルスラリーから除去することができる。しかしながら、ミクロゲルを乾燥させるために遠心分離を使用すると、顆粒足場を作製するときに非常に可変な範囲の粒子画分および空隙画分を生成することができる12。ミクロゲルを凍結乾燥するための技術は、ポリエチレングリコール(PEG)ミクロゲル13のための70%IPA、ゼラチンメタクリロイル(GelMa)ミクロゲル14のためのフッ素化油、およびHAミクロゲル12のための70%エタノールを用いて記載されている。このプロトコルは、乾燥プロセス中に元のミクロゲルの特性を保持するために、標準的な実験室用試薬である70%エタノールを使用して球状HAミクロゲルを凍結乾燥する方法を強調しています。凍結乾燥HAミクロゲルは、MAP足場12における最終粒子画分を制御するために、ユーザー定義の重量百分率で秤量および再水和することができる。
MAP足場形成の最終ステップは、ミクロゲルをアニーリングしてバルクの多孔質足場1を作成することに依存しています。MAPスキャフォールドは、天然の細胞外マトリックス成分を利用し、バイオ直交アニーリングスキームを採用することにより、in vitro 細胞培養と in vivo 組織修復の両方のための生体適合性プラットフォームとして機能します3。これらのアプローチにより、MAP足場は、組織工学アプリケーションで使用するために、ユーザー定義の粒子画分を備えたHA-NBビルディングブロックから製造できます12。以下のプロトコルは、MAP足場における粒子画分を制御するための凍結乾燥および再水和に続くHA-NBミクロゲルのマイクロ流体製造について説明する。最後に、ミクロゲルをアニーリングするためのステップは、 in vitro 3D細胞培養実験のためのバイオ直交化学を使用して説明されています。

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-Lokシリンジ滅菌済み、単回使用、ポリカーボネート</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lokシリンジ滅菌済み、単回使用、ポリカーボネート</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>蛍光標識テトラジンの合成用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>細胞培養サンプルの染色用</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>プランジャー付き生検パンチ、1.0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr>生<tr><td>検パンチ、4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>鈍針、23 G 0.5 インチ、非滅菌、キャップ付き</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップ真空フィルター、0.22 &mu;m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>マイクロゲル洗浄バッファー用</td></tr><tr><td>容積式ピペット用キャピラリーピストンアセンブリ、1000 &mu;L 最大容量</td><td>レイニン</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>容積式ピペット用キャピラリーピストンアセンブリ、25 &mu;L 最大容量</td><td>レイニン</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>容積式ピペット用キャピラリーピストンアッセンブリー, 250 &mu;L 最大容量</td><td>レイニン</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess セルカウンティングチャンバースライド</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube, 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, ACS grade, ガラス瓶</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>蛍光標識テトラジンの合成</td></tr><tr><td>用 コロナプラズマガン、BD-10A 高周波発生器</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>クライオチューブバイアル、ポリプロピレン、スクリューキャップ付きめねじ</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>D1マウス間葉系細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>MAPゲルでの培養のための細胞株の例</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>でSigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>細胞培養サンプルの染色用</td></tr><tr><td>酸化重水素、99.9 atom% D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td>NMR分光法用</td></tr><tr><td>透析チューブ、再生セルロース膜、12-14 kDa分子量カットオフ</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td><td>HA-NBおよびHA-Tet</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>の精製用 VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>蛍光標識テトラジンの合成用</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>蛍光標識テトラジン</td></tr><tr><td>4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド(DMTMM)の合成用&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>HA</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td>を修飾するため<td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>非分解性ジチオールリンカー(MMP切断ペプチドの代替品)</td></tr><tr><td>ダルベッコの修飾イーグルス培地(DMEM)、高グルコース、w / 4500 mg / Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および重炭酸ナトリウム、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適しています</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>D1用細胞培養</td></tr><tr><td>EMS パラホルムアルデヒド、顆粒</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>4% PFA</td></tr><tr><td>エタノール絶対 (200 プルーフ)</td> <td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>D1 細胞培養用</td></tr><tr><td>加熱プレート</td><td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤 カバーガラス付き</td><td>ダイガーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸(HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr>ヒ<tr><td>アルロン酸ナトリウム、平均分子量79 kDa、細菌Streptococcus zooepidemicus、医薬品グレード、微生物汚染で産生 <100 CFU/g、細菌性エンドトキシン <HA-Tet合成には、0.050 IU/mg</td><td>Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDaの平均分子量を使用しましたが、これらの方法は他の分子量にも適用できます。</td></tr><tr><td>IMARIS Essentials ソフトウェアパッケージ</td><td>オックスフォード・インスツルメンツ</td><td>N/A</td><td>顕微鏡画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>輸液ポンプ、デュアルシリンジ</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>サポートラボ用スタンド ラボ用クランプ</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>エアガス</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>リチウムフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィン酸</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Labconco</td><td>N / A</td><td>Labconco FreeZone 6 plusは製造中止になりましたが、このプロトコルには他のラボグレードのコンソール凍結乾燥機を使用することができます。</td></tr><tr><td>メチルテトラジン-PEG4-マレイミド</td><td>ケラファスト</td><td>FCC210</td><td>蛍光標識テトラジン</td></tr><tr><td>2-(4-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES)</td> の合成用フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP300-100</td><td>HA</td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス、24 x 60 mm No. 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体デバイス SU8 マスターウェーハ</td><td>FlowJem</td><td></td><td>カスタムデザイン 社内でクリーンルームまたはアウトソーシング</td></tr><tr><td>鉱物油、重い</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP切断可能なジチオール架橋剤ペプチド (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norbornene-2-methylamine</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>HA-NB synthesis</td></tr><tr><td>パッキングテープ</td><td>スコッチ</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(チオール)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>蛍光標識テトラジン</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシンの合成用、10,000 units/mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>D1細胞培養用</td></tr><tr><td>ペトリ皿、ポリスチレン、使い捨て、直径 x H=150 x 15 mm</td><td>コーニング</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>HMPの洗浄用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RainX 撥水ガラス処理</td><td>グレインジャー</td><td>465D20</td><td>マイクロ流体デバイス治療用合成疎水性処理溶液</td></tr><tr><td>RGDペプチド (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ゴムバンド</td><td>ステープルズ</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>透析用</td></tr><tr><td>Span 80 合成用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコーンエラストマー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>4019862</td><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマー マイクロ流体デバイスおよび組織培養デバイスを作るための</td></tr><tr><td>シリンジフィルター, Whatman Uniflo, 0.2 &mu;m PES、直径13 mm</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Tetraview LCDデジタル顕微鏡</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>テトラジンアミンHCl塩</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>HA-Tet合成用</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>蛍光標識テトラジンの合成用</td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー 溶液、0.4%</td> <td>サーモ フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA (0.25%)、フェノール レッド</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>25-200-056</td><td>接着細胞を MAP ゲルのシードに持ち上げ</td></tr>るため <tr><td>タイゴン ND-100-80 非 DEHP 医療用チューブ、ニードル ゲージ = 23、壁の厚さ = 0.020 インチ、内径 = 0.020、外側直径= 0.060 Thomas</td><td>Scientific</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>UV硬化システムコントローラー、LX500 LED&nbsp;</td><td>オムニキュア</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>UV硬化ヘッド、LEDスポットUV</td><td>オムニキュア</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>紫外線露出計、トレーサブル</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z シリーズ 精密ユーティリティナイフ</td><td>エルマーズXZ3601W</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

ミクロゲルは、微多孔性アニール粒子(MAP)足場の構成要素であり、in vitro 細胞培養と in vivo 組織修復の両方のプラットフォームとして機能します。これらの顆粒状足場では、ミクロゲル間の空隙空間によって生成される生来の多孔性により、細胞の浸潤と遊走が可能になります。空隙率は細胞の生理活性の手がかりであるため、空隙率と粒子画分を制御することはMAP足場の設計にとって重要です。球状ミクロゲルは、制御されたサイズおよび形状のためにマイクロ流体デバイス上で生成し、続いてポリマーネットワークの破砕を防止する方法を用いて凍結乾燥することができる。再水和すると、凍結乾燥されたミクロゲルはMAP足場に制御された粒子画分をもたらす。ミクロゲル凍結乾燥のためのこれらの方法の実施は、高分子拡散および細胞拡散に対する粒子画分の効果を示す再現性のある研究につながった。次のプロトコルは、MAP足場内の粒子画分を制御するためのミクロゲルの製造、凍結乾燥、および再水和、およびin vitroでの3D細胞培養のためのバイオ直交架橋によるミクロゲルのアニーリングをカバーします。

このプロトコルの目的は、生体直交架橋スキームを使用した微多孔性アニーリング粒子(MAP)スキャフォールドの調製と、3D細胞培養用の制御された粒子画分を実証することです。まず、HAをノルボルネンペンダント基で修飾し、ミクロゲル形成とインターリンクの両方を使用してMAP足場を形成しました。これらの方法を使用して、HAリピートユニットの約31%がノルボルネン官能的ハンドルで首尾よく修飾されました(図1A)。フローフォーカシング領域(図1B)を持つマイクロ流体デバイスは、直径~50 μmまたは~100 μmのHA-NBμgelを生成することが示されました(図1C、D)。この作業の残りの部分で使用されたμgelの平均直径は92 μm(Q1 = 79 μm、Q3 = 103 μm)でした(図1E)。
粒子画分を制御するために...

粒状足場内の粒子画分のばらつきを最小限に抑えることで、再現性のある実験が容易になります。この研究では、 in vitro 組織工学アプリケーション向けに、制御された粒子画分を使用して粒状足場を生成する方法について説明します。

3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

MAP足場などの粒状材料は、連結されたマイクロサイズのヒドロゲル粒子から作られた多孔質の注射可能な材料です。粒子分率の制御は、材料特性と細胞応答にとって重要です。MAPスキャフォールド内の可変粒子画分は、さまざまな足場特性と細胞応答をもたらしますが、この手法により、ユーザーは作成したMAPスキャフォールドの最終的な粒子画分を定義できます。MAP足場は、複雑な創傷の修復および再生を促進するため、ならびに薬物を送達するために使用することができる。粒子画分は、例えば、細胞浸潤および再生の速度および程度に影響を及ぼす。この方法は、すべてのクラスの粒状ヒドロゲルに適用できます。ユーザーが制御した粒子画分でMAPスキャフォールドを作成できるようになったので、これらの材料の生物活性を再現性よく研究し、閉じ込めなどのユニークな細胞応答を調べることができます。マイクロ流体ミクロゲルの生成を設定するには、技術を学ぶための時間と忍耐が必要です。セットアップで問題が発生した場合に備えて、複数のデバイスを準備して準備しておくことをお勧めします。ヒアルロン酸(HA)とノルボルネン(NB)ミクロゲルのマイクロ流体生産から始めます。ミクロゲルを乾燥させる前に、クライオセーフスクリューキャップチューブの重量を量ります。次に、滅菌フード内で、洗浄および精製したミクロゲルを、容積式ピペットを使用して低温安全スクリューキャップチューブに移します。精製したミクロゲルに70%エタノールを加え、よく混ぜます。チューブを5, 000 gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、70%エタノールを加える。よく混ぜて摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、短時間遠心分離して、ミクロゲルがチューブの底にあることを確認します。極低温容器に液体窒素を加え、ミクロゲルのチューブを置いて瞬間凍結します。5〜10分後、鉗子でミクロゲルのチューブを取り外します。キャップをすばやく取り外し、ラボグレードのティッシュでチューブを覆います。ティッシュを輪ゴムで固定し、凍結乾燥容器またはチャンバーに移します。製造元の指示に従ってサンプルを凍結乾燥機にロードし、0.066 Torrおよびマイナス63°Cで凍結乾燥します。凍結乾燥されたミクロゲルを室温で保存する前に、チューブから重量を量ります。ポリジメチルシロキサン、又はPDMSエラストマー基剤と硬化剤を1質量比で10対1の割合で混合する。PDMS混合物を大きなプラスチック製のペトリ皿に注ぎ、デシケーターで30分間、またはすべての気泡が消えるまで脱気します。すべての気泡が消えたら、3Dプリントされた金型をPDMSに慎重に配置して、新しい気泡の形成を最小限に抑えます。PDMSを硬化させるために、摂氏60度のオーブンに2時間入れます。硬化後は、ナイフやカミソリの刃で培養装置の周囲をやさしくなぞり、慎重に型を取り出します。4ミリメートルの生検パンチを使用して、ウェルの底からPDMSを取り除きます。ガラスカバースリップに収まるようにデバイスをカットします。テープを使用して、培養装置の底面からほこりを取り除きます。清潔なガラスカバースリップと培養装置を135°Cのホットプレートに15分間置き、水分を取り除きます。ヒュームフードで、ガラスカバースリップとデバイスの底面の高い位置にコロナプラズマガンを30秒間使用します。次に、処理された表面をすばやく接着します。培養装置とガラスカバースリップの間の良好なシールを確保するために、静かに圧力をかけます。デバイスを摂氏60度のオーブンに一晩置き、ボンドを固定します。翌日、装置をオートクレーブし、インビトロでの使用前に滅菌する。次に、MAPスキャフォールドにおける細胞培養用の所望の粒子画分に基づいて、微多孔性アニール粒子またはMAPスキャフォールド成分を調製する。凍結乾燥ミクロゲルを秤量して、ミクロゲルの質量を決定する。次いで、選択された重量パーセントMAPに基づいて細胞培地の最終MAP体積の84%でミクロゲルを再構成する。ミクロゲルを20分間膨潤させる。ヒアルロン酸、またはHA-テトラジン、および細胞培地を最終MAP体積の16%に溶解します。細胞が目的のコンフルエントに達したら、細胞を持ち上げてカウントします。マイクロリットルMAPあたり10, 000セルを新しいチューブに移します。細胞を遠心分離し、細胞を吸引せずにペレットから上清を吸引する。置換ピペットを使用して、ミクロゲルと架橋剤をペレットに追加します。よく混ぜ、ウェルあたり10マイクロリットルを播種します。円運動でピペットして、混合物をウェル内に均等に分配する。ミクロゲルを摂氏37度で25分間アニールしてから、細胞培地を加えてウェルを満たします。3D 培養を摂氏 37 度に維持し、必要に応じて培地を交換します。足場の吸引を避けるために、上部ウェルの尾根に沿ってピペットチップを安定させます。目的の時点で、培地をウェルあたり50マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドと室温で30分間交換してサンプルを修正します。サンプルを50マイクロリットルのPBS、または好ましいバッファーで3回洗浄し、作業量としてウェルあたり50マイクロリットルを使用して免疫蛍光または蛍光染色に進みます。フローフォーカシング領域を有するマイクロ流体デバイスは、直径50または100ミクロンのHA-NBミクロゲルを生成することが示された。ミクロゲルを凍結乾燥するための培地は、70%エタノールを使用することによってクリオゲル形成を最小限に抑えるように最適化されました。ただし、イソプロピルアルコール、水、アセトニトリルなどの他の媒体を同じ意味で使用できるため、クライオゲルの形成を促進することができます。HA-NBミクロゲルの生体直交インターリンクを促進するために、直鎖状HA-テトラジン架橋剤を合成した。プロトンNMR分光法は、テトラジンペンダント基を有するHAリピートユニットの11%の修飾に成功したことを示しています。乾燥した凍結乾燥ミクロゲル生成物を特別な容量で再水和し、アニールして、MAP足場中のミクロゲルの異なる重量パーセント製剤を達成した。MAP足場におけるミクロゲルのこれらの重量百分率は、固有の粒子画分に対応していた。MAPスキャフォールドでの細胞培養をここに示します。MAPスキャフォールドの3D培養中の細胞を5日目に固定し、染色し、共焦点顕微鏡で画像化しました。単一のZスライスは、異なる重量パーセントMAPを含む細胞増殖および足場の違いを示す。凍結乾燥媒体は、クライオゲルが必要かどうかに応じて適切に選択してください。ミクロゲルが培地中で膨潤するのに十分な時間を確保するために、インキュベーションステップをスキップしないでください。顕微鏡、フローサイトメトリー、RNAシーケンシングなどの標準的な技術を使用して、定義された多孔性を有するこれらの顆粒状材料内の細胞応答を評価することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、三次元細胞培養用多孔性ポリマーチップの微細加工のための2つのプロセスを提示する。最初のものは、溶剤蒸気の溶接プロセスと組み合わせて熱エンボス加工です。もう一つは製造の大幅な簡素化につながるイオン飛跡技術と組み合わせた最近開発microthermoformingプロセスを使用しています。...

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。...

3次元細胞培養のための自己申告足場

この記事では、既知の播種密度と比較して最初に付着する細胞の数を最大化し定量化するために、標準的な培養ウェルプレートの基部を覆わない材料、この場合はエレクトロスパンヤーンにヒト間葉系幹細胞を播種するためのさまざまな設定について説明します。...

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

生体材料技術の進歩により、3次元のマルチセルタイプのコンストラクトの開発が可能になりました。私たちは、気道の主要な構造細胞を培養するための3つの個別の足場を作製するエレクトロスピニングプロトコルを開発しました...

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

反復可能なパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するための手順を紹介します。組織パターン形成のための多方向の画像を達成するために 2...

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御

相補的な反応性基を有するミクロゲルロッドは、水溶液中で相互連結する能力を有するマイクロフルイディクスを介して製造される。異方性ミクロゲルは、球形ベースのシステムと比較して、より大きな細孔を有する安定した構築物に詰まりそして相互連結する。GRGDS-PCで修飾されたミクロゲルは、細胞培養に使用できるマクロポーラス3Dコンストラクトを形成します。...

ミクロゲルロッドからの連結マクロポーラス3D足場

このプロトコルは、様々な再生医療用途に使用することができる微多孔性アニール粒子足場のためのミクロゲルビルディングブロックを合成するための一連の方法を記載している。...

微多孔性アニール粒子足場用ミクロゲルビルディングブロックのマイクロ流体合成

この作品の詳細3Dフィブリンの調製は、培養およびplutipotent幹細胞を区別するための足場。このような足場は、同様の薬物送達システムを含むように修正された幹細胞の挙動に及ぼす種々の生物学的化合物の作用をスクリーニングするために使用することができます。...

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

マイクロ粒子画像流速（μPIV）が正確な速度プロファイルを与えるクロス相関である血流に播種したマイクロ粒子のペアのイメージを視覚化するために使用されます。臨床用途を有する各々が剪断速度、最大速度、速度プロファイルの形状、流量は、これらの測定値から導出することができる。...

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

学ぶ、微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御法。組織工学における再現性のある実験と創傷治癒への応用可能性を向上させるため、ハイドロゲル粒子の特性を最適化する手法を解説します。

3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

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