Name: 個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学ぶマウス個々の骨格筋からの筋幹細胞と線維脂肪形成前駆細胞の分離法。蛍光活性化細胞分画と免疫蛍光染色を用いて、生細胞集団を高純度に精製し、再生医療研究に応用する。

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細胞選別は、デンマークのオーフス大学のFACSコア施設で実施されました。図は Biorender.com を使用して作成されました。ウサギ抗PDGFRa抗体を共有してくれたJ.ファラップ博士に感謝します。この作業は、E.P.へのAUFF開始助成金と、ノボノルディスクフォンデンからEP(0071113)およびA.D.M.(0071116)への開始パッケージ助成金によってサポートされました。

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
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<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>Fukada, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124(2007).</li>
<li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476(2011).</li>
<li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li>
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<li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li>
<li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li>
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<li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li>
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<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
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<li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li>
<li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li>
<li>de Morrée, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li>
</ol>

著者には、競合する金銭的利益や利益相反はありません。

良好な歩留まりを達成するために、このプロトコルの実行にはいくつかのステップが重要です。個々の筋肉は、バルク分離プロトコルで使用される筋肉の量と比較して小さな体積を有する。これにより、解剖中に筋肉が乾燥するリスクがあり、収量が低下します。これを防ぐためには、解剖直後に筋肉に培地を加えることが重要です。さらに、解剖に時間がかかる場合は、筋肉が空気にさらされる時間を短縮するために、一度に片方の手足から皮膚を取り除くことができます。容量が小さいと、過剰消化のリスクも高まります。これに対抗するために、本方法は、バルク筋肉プロトコルと比較して、より少ない量のコラゲナーゼII酵素および短縮された消化時間を必要とする9,16。酵素消化は酵素の純度にも依存し、純度が低いと収量に悪影響を与える可能性があります。さらに、機械的消化が重要です。切断が不十分な場合、表面積の減少は酵素消化を妨げ、幹細胞の収量を低下させます。切断しすぎると、表面積が増えると過剰消化が発生し、幹細胞の収量が低下します。振とう水浴は、消化された筋肉の沈殿を防ぎ、酵素の分...

骨格筋は、筋幹細胞(MuSC)の存在により、再生能力が高い。MuSCは筋線維上、基底膜の下に位置し、長期にわたる可逆的な細胞周期出口1,2,3,4の静止状態で存在します。損傷を受けると、MuSCは活性化して細胞周期に入り、分化して融合して新しい筋線維を形成することができる増幅前駆細胞を生じさせます2,5。以前の研究では、MuSCが筋肉の再生に絶対に不可欠であることが示されています6,7,8。さらに、単一のMuSCは、新しい幹細胞と新しい筋線維の両方を生着させて生成することができます9。骨格筋はまた、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)と呼ばれる間葉系間質細胞の集団を有しており、筋肉再生中のMuSC機能をサポートする上で重要な役割を果たします6,10,11,12。
筋肉の再生を調整する可能性があるため、MuSCとFAPがどのように機能するかを理解することに大きな関心が寄せられています。静止性MuSCは転写因子Pax7およびSprouty1の発現、ならびに細胞表面タンパク質カルシトニン受容体によって示され、静止性FAPは細胞表面タンパク質血小板由来成長因子受容体α(PDGFRa)によって示されます10,12,13,14,15。.以前の研究では、細胞表面マーカーと蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して骨格筋からMuSCとFAPを精製できることが示されています9、15、16、17、18、19、20、21。これらのプロトコルはMuSCとFAPを研究する能力を大幅に向上させましたが、1つの欠点は、これらのプロトコルのほとんどがさまざまな筋肉組織のプールからMuSCを分離する必要があることです。私たちや他の人々からの最近の研究は、異なる組織から単離されたMuSC間の細胞表現型と遺伝子発現レベルの違いを明らかにしました22,23。横隔膜、上腕三頭筋、およびグラシリスからのMuSCは、下肢筋からのMuSCよりも速い活性化を示します22、一方、外眼筋からのMuSCは、横隔膜および下肢筋肉からのMuSCよりも速い分化を示します23。
このプロトコルでは、個々の骨格筋からのMuSCとFAPの分離について説明します(図1)。これには、横隔膜、上腕三頭筋、グラシリス、前脛骨筋(TA)、ヒラメ筋、長指伸筋(EDL)、腓腹筋(GA)、および咬筋の解剖が含まれます。解剖された筋肉は、続いてコラゲナーゼII(コラーゲンのPro-X-Gly-Proアミノ酸配列を特異的に標的とし、結合組織の分解と組織の解離を可能にするプロテアーゼ24)およびディスパーゼ(フィブロネクチンとコラーゲンIVを切断し、さらなる細胞解離を可能にするプロテアーゼ)を使用した酵素消化によって解離されます25).MuSCおよびFAPは、FACSによってシングルセル懸濁液から単離されます。細胞分析のためのダウンストリームアッセイの例として、幹細胞の活性化は5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)取り込みをアッセイすることによって決定され、細胞純度は細胞タイプ特異的マーカーPax7およびPDGFRaの免疫蛍光染色によって決定される。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLチューブ(PCR性能試験済み、PP、30,000 xg、DNA/DNase-/RNaseフリー、低DNA結合、滅菌済み)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>72.706.700</td><td>1.5 mLチューブ</td></tr><tr><td>15 mLチューブ(PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.554.502</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>チューブ5 mLポリスチレン丸底チューブ</td><td>Falcon、Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352054</td><td>FACSチューブ ストレーナーキャップなし</td></tr><tr><td>ポリスチレン 5mL セルストレーナーキャップ付き丸底チューブ</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>352235</td><td>FACSチューブ、ストレーナーキャップ付き</td></tr><tr><td>5 mLチューブ(PP、非滅菌オートクレーブ可能)</td><td>VWR collection</td><td>525.0946</td><td>5 mL</td></tr>チューブ <tr><td>50 mLチューブ(PP/HD-PE、20,000 xg、IVD/CE、ADR、DNA/DNase-/RNase-フリー、非細胞毒性、パイロジェンフリー、滅菌)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>50 mLチューブ</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td><td></td></tr><tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, コア施設 Aarhus University</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td><td>Cell Proliferation Kit</td></tr><tr><td>Collagen from calf-skin&nbsp;</td><td>バイオ試薬、Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>出典:SLCK6209(Cat#C8919)</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Worthington、Fisher Scientific&nbsp;</td><td>ロット:40H20248(cat#L5004177</td>)<td>コラゲナーゼ</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>Gibco、フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>ロット:2309415(cat#17105-041)</td><td>Dispase</td></tr><tr><td>Donkey血清(非滅菌)</td><td>Sigma Aldrich、Merck</td><td>ロット:2826455(Cat#S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5、110 mm</td><td>Dumont、Hounisen Laboratorieudstyr A / S</td><td>1606.327</td>細い<td>先端のストレート鉗子</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7、115 mm</td><td>Dumont、Hounisen Laboratorieudstyr A / S</td><td>1606.335</td><td>湾曲した鉗子</td></tr><tr><td>F-10 栄養混合物 (ハム) (1x)、+L-グルタミン</td><td>Gibco、Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-mouse CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp;&nbsp;</td><td>K44104563 9Cat #1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドオーバーヘッドミニチューブローテーター&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>15534080(型番88861052)</td><td>ヘッドオーバーヘッドミニチューブローテーター</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>ギブコ、フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>ロット2482639(cat#10368902)</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand、Fisher Scientific</td><td>15325887</td><td>振とうウォーターバス</td></tr><tr><td>MS2ミニシェーカー&nbsp;</td><td>イカ&nbsp;</td><td></td><td>ボルテックスユニット</td></tr><tr><td>ニードル 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td><td>BD microlance, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>304827</td><td>20G針&nbsp;</td></tr><tr><td>中性ホルマリン緩衝液10%</td><td>CellPath、Hounisen Laboratorieudstyr A /</td><td>S Lot:03822014(Cat#HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>非発熱性細胞ストレーナー(40 & micro;M)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>セルストレーナー&nbsp;</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7 (Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 一次抗体</td><td>DSHB</td><td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x 粉末濃縮物</td><td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>ロット 163589 (cat# 11548876 )</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ p10</td><td>アートチップ、セルフシーリングバリア、Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>低保持、滅菌済み、フィルターチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ p1000</td><td>アートチップ、セルフシーリングバリア、Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>低保持、滅菌済み、フィルターチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ p20</td><td>アートチップ、セルフシーリングバリア、Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>低保持、滅菌済み、フィルターチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ p200</td><td>アートチップ、セルフシーリングバリア、Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>低保持、滅菌済み、フィルターチップ</td></tr><tr><td>保護アンダーパッド</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp;60 x 40cm、8層</td></tr><tr><td>レイニン、ピペットライトXLS</td><td>メトラー・トレド、サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>2140-05、2149P-05、2279-05、2069-05</td>ピ<td>ペット(P10、P20、P200、P1000)</td></tr><tr><td>組換え抗PDGFR-α</td><td>RabMAb、アブカム</td><td>AB134123</td><td></td></tr><tr><td>メス(シャフト番号3)</td><td>Hounisen、Hounisen Laboratorieudstyr A / S</td><td>1902.502</td><td></td></tr>メスメス<tr><td>ブレード番号11</td><td>ハインツヘレンツ、フニセンラボラトリーユーズティアA / S</td><td>1902.0911</td><td></td></tr>メス<tr><td>Scanlaf mars</td><td>Labogene</td><td>クラス2キャビネット:マース</td><td>フローベンチ</td></tr><tr><td>ScanR</td><td>オリンパス</td><td></td><td>顕微鏡、コア施設 オーフス大学</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>シリーズ 8000 DH</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>3540-MAR</td><td>インキュベーター</td></tr><tr><td>血清ピペット 10 mL</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>滅菌、非発熱性</td></tr><tr><td>血清ピペット 5 mL</td><td>VWR、アバンターVWR</td><td>612-3702</td><td>滅菌済み、非発熱性</td></tr><tr><td>シリンジ 5 mL、ルアーチップ (6%)、滅菌済み&nbsp;</td><td>BDエメラルド、フィッシャーサイエンティフィック</td><td>307731</td><td>シリンジ</td></tr><tr><td>TCディッシュ100、標準</td><td>Sarstedt AG&Co. KG、Hounisen Laboratorieudstyr A / S</td><td>83.3902</td><td>ペトリ皿&nbsp;</td></tr><tr><td>組織培養(TC)処理された表面、黒色ポリスチレン、平底、滅菌、蓋、20個入りパック</td><td>コーニング、シグマ アルドリッチ</td><td>3764</td><td>96ウェルハーフボトムプレート</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ、メルク</td><td>出典:SLCJ6163(カタログ番号#T8787)</td><td></td></tr></tbody></table>

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

骨格筋には、組織の恒常性と修復に寄与する成体幹細胞の明確な集団があります。骨格筋幹細胞(MuSC)は新しい筋肉を作る能力を持っていますが、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は間質支持組織に寄与し、線維芽細胞や脂肪細胞を作る能力を持っています。MuSCとFAPはどちらも、静止と呼ばれる長期の可逆的な細胞周期の出口の状態で存在します。静止状態は、それらの機能の鍵です。静止幹細胞は、通常、単一のサンプルに一緒にプールされた複数の筋肉組織から精製されます。しかし、最近の研究では、異なる筋肉から単離されたMuSCの分子プロファイルと静止深度に明確な違いがあることが明らかになりました。本プロトコルは、個々の骨格筋からのMuSCおよびFAPの単離および研究について説明し、幹細胞活性化の分子分析を実行するための戦略を提示します。横隔膜、上腕三頭筋、グラシリス、前脛骨筋(TA)、腓腹筋(GA)、ヒラメ筋、長指伸筋(EDL)、咬筋など、さまざまな発達起源、厚さ、機能の筋肉を分離して消化する方法について詳しく説明します。MuSCおよびFAPは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって精製され、免疫蛍光染色および5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)取り込みアッセイによって分析されます。

個々の骨格筋の分離に関するプロトコル(図2)に従って、地元の繁殖プログラムから中止された3匹のスイスのオスの近交系マウスから、グラシリス、TA、EDL、GA、ヒラメ筋、上腕三頭筋、マッサージ師、および横隔膜筋を分離しました(図2)。組織解離および抗体染色に続いて、個々の筋肉由来のMuSCおよびFAPをFACSによって精製した(図3)。最初のゲーティングは、細胞を同定し、一重項をダブレットから分離するために、染色されていないサンプルで得られました(図3A)。その後のゲートは、染色閾値を特定するためにFMOコントロールを使用して設定されました(図3B)。次いで、染色したサンプルをCD31/CD45-FITCおよびSca1-PacBlueについてゲーティングした。SCA1+/CD31-/CD45-集団(FAPs)は別の収集チュ...

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

このプロトコルは、さまざまな骨格筋にわたる幹細胞機能の研究を可能にし、それらが恒常性、再生、および疾患の進行にどのように寄与するかについての理解を深めるのに役立つため、重要です。このプロトコルを使用して、特定の筋肉から生きた幹細胞の2つの集団を分離し、それらがどのように機能するかを研究することができます。筋肉の分離を開始するには、安楽死させたマウスにエタノールをスプレーし、腹部を上に向けて置きます。はさみを使用して、腹部の皮膚に0.5センチメートルの長さの水平切開を行います。両手を使って皮膚を引っ張り、胴体と下肢を後肢まで露出させます。グラシリスまたは太ももの内側の筋肉を見つけ、湾曲した鉗子のペアを使用してそれをつかみ、筋肉をわずかに持ち上げます。ハサミを使用して、0.5センチメートルの切開を行い、グラシリスの筋肉を切り取ります。もう一方の脚で手順を繰り返します。メスを使用して、脛骨の外側に沿って0.5センチメートルの切開を行うことによって筋膜を切断します。次に、湾曲した鉗子を使用して筋膜をつかみ、引っ張って取り外し、後肢の遠位端にある腱を露出させます。次に、TAの遠位腱とEDL筋の間に超微細な先端を持つ一対のまっすぐな鉗子を挿入します。鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて、筋肉を分離します。鉗子を遠位端に戻し、遠位腱を切断します。湾曲した鉗子でTAの遠位腱をそっとつかみ、筋肉をその近位アタッチメントの上に持ち上げます。近位腱を慎重に切断するには、もう一方の端をそのアタッチメントにできるだけ近いところで切断し、TAをペトリ皿に移します。次に、超微細な先端を持つまっすぐな鉗子を使用してEDLの遠位腱の下に入り、鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて、筋肉を互いに分離します。鉗子を遠位端に戻し、筋肉を傷つけずに遠位腱を切断します。湾曲した鉗子でEDLの遠位腱をそっとつかむことにより、筋肉を持ち上げて近位の付着部の上に持ち上げ、近位腱をできるだけ付着に近づけます。もう一方の端を切り取り、EDL筋肉をペトリ皿に移します。もう一方の後肢についても手順を繰り返します。先端が極細のまっすぐな鉗子を使用して、アキレス腱と下肢の骨の間に届きます。鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて、筋肉を骨から分離します。鉗子を遠位端に戻し、遠位腱を切断します。腓腹筋またはGA筋を腓骨の上に引き上げます。近位ヒラメ筋腱の位置を特定する。まっすぐな鉗子をヒラメ筋とGA筋肉の間に挿入し、鉗子を筋肉の遠位端に向かって動かして、ヒラメ筋をGAから分離します。次に、近位ヒラメ筋腱を切断します。湾曲した鉗子でそれをつかみ、慎重にスーを持ち上げて遠位腱にアクセスします。遠位腱を切断してヒラメ筋をGAから分離し、洗浄媒体を含むペトリ皿にヒラメ筋を入れます。次に、GAを切り取り、ペトリ皿に入れます。上腕三頭筋を隔離するには、上腕三頭筋と上腕骨の間に届くように先端が超微細なまっすぐな鉗子を使用し、鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて筋肉を骨から分離します。次に、上腕三頭筋の遠位端を切断し、湾曲した鉗子を使用してそれを肘の上に引き上げて近位腱にアクセスします。上腕三頭筋の近位腱を切断し、筋肉をペトリ皿に移します。他の4本の手足についても手順を繰り返します。顎から毛皮と皮膚を取り除くには、はさみを使用して目の下を0.5センチメートルの切開を行い、尾方向に切ります。次に、両手の親指と人差し指を使用して、切開の両側をつまみ、上下に引っ張って皮膚を取り除きます。目の下の尾側に咬筋の主要な腱を見つけ、骨と筋肉の間に平らなメスの刃を挿入して腱を切断します。湾曲した鉗子で大咬筋腱をつかみ、メスの刃やハサミで吻側に切り、咬筋を顎骨から分離します。分離した咬筋をペトリ皿に入れ、2番目の咬筋に対して手順を繰り返します。はさみを使用して胸骨の真ん中に開胸を行い、胸骨を切り裂きます。胸郭を通して360度切断してダイヤフラムを露出させます。次に、上半身を腹部から分離するために、ハサミを使用して気管、食道、大静脈、および腹部大動脈を切り裂きます。次に、ハサミを使用して、胸骨の1センチ下に開腹術を行い、約360度に切り込みを入れます。閉じたはさみを胸郭と腹部臓器の間に置き、押し下げます。胸郭をそっと引っ張って腹部の臓器から分離します。横隔膜を胸郭から分離するには、横隔膜を2本の指でゆるく持ち、ハサミで胸郭を切ります。ダイヤフラムをリブのできるだけ近くで360度カットし、隔離されたダイヤフラムをペトリ皿に入れます。孤立した筋肉を約1ミリメートルの断片に切断して1つずつ細かく刻みます。ミンチした筋肉を5リットルの解離バッファーを含む15リットルの円錐管に移し、毎分60回転の速度で振とう水浴中で37°Cで35分間チューブをインキュベートします。ミンチ筋肉を酵素消化した後、懸濁液を15ミリリットルチューブから50ミリリットルチューブに移します。20ゲージの針を取り付けた10ミリリットルのシリンジを使用して、針を通してサンプルを上下に5回引っ張って再懸濁します。細胞懸濁液をシリンジに引き込み、上部に細胞ストレーナーを取り付けた新しい50ミリリットルの円錐管にサンプルを濾します。すべての単核細胞を回収するには、空の円錐管を20ミリリットルの洗浄媒体で洗浄し、それをストレーナーに注ぎ、濾したサンプルと結合させます。P1000ピペットでセルストレーナーの下の残りの容量を取り出します。組織解離および抗体染色に続いて、個々の筋肉由来の骨格筋幹細胞またはMuSCsおよび線維脂肪生成前駆細胞またはFAPを、蛍光活性化細胞選別によって精製した。細胞を同定し、一重項をダブレットから分離するための最初のゲーティングの後、染色閾値を特定するためにFMOコントロールを使用して後続のゲートを設定しました。染色サンプルをゲートし、FAPに対応するSCA1陽性CD31陰性およびCD45陰性集団を別の収集チューブに分類した。二重陰性集団は、MuSCに対応するVCA陽性集団をソートするためにさらにゲートされた。横隔膜および上腕三頭筋の単一細胞懸濁液は、他のものとは異なり、FAPよりもMuSCの相対的な存在量が多かった。EDU染色は堅牢ではあるが、2つの幹細胞タイプおよび異なる筋肉間でEDU陽性細胞の画分に違いがあることを示した。しかし、すべての組織について、EDU陽性MuSCの平均割合はEDU陽性FAPの平均割合よりも高かった。EDLおよびGAから分離されたMuSCは、TA、横隔膜、グラシリスまたは上腕三頭筋からのものと比較して、有意に低いEDU取り込みを示しました。同様に、EDU取り込みの有意な変動は、異なる筋肉から分離されたFAPでも観察されました。最後に、免疫蛍光染色で細胞純度を確認し、幹細胞分離プロトコルの特異性を示した。最も重要なステップは、組織の機械的消化です。組織を切断しすぎると、生存率が低下します。組織の切断が少なすぎると、ウナギは低下します。このプロトコルは、移植後の生着などの細胞の挙動を測定するアッセイと組み合わせて、in vivoでの幹細胞機能をよりよく理解することができます。この技術は、個々の筋肉内の幹細胞の挙動の違いが、病気の表現型や影響を受けた筋肉の独特のパターンを特徴とする疾患に寄与する可能性があるかどうかに答える可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。...

ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。...

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。...

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex...

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶマウス個々の骨格筋からの筋幹細胞と線維脂肪形成前駆細胞の分離法。蛍光活性化細胞分画と免疫蛍光染色を用いて、生細胞集団を高純度に精製し、再生医療研究に応用する。

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

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