Name: 患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ 患者由来の3次元腫瘍スフェロイド樹立法と薬物感受性評価法。一次がん細胞を用いたコスト効率の良いモデルにより、固形腫瘍の治療薬選択と個別化医療への応用を支援します。

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初代腫瘍細胞培養に使用されたヒト腫瘍サンプルの収集は、患者からの書面によるインフォームドコンセントを得て、ラビン医療センターで治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに従って実施されました。研究への参加対象となる患者には、非転移性乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん、神経内分泌がん、卵巣がん、膵臓がん、小児がん、または転移がんの男性および女性の成人および小児がん患者が含まれていました。唯一の除外基準は、インフォームドコンセントを提供する能力の欠如であった。
1. スフェロイドの生成と収集
注:原発腫瘍細胞の単離は、Kodakら8に記載されているように実行できます。重要なことに、スフェロイドを生成するために使用される原発性腫瘍細胞は、Moskovitsらによって記載されるように、生検、切除などによって得られた患者サンプルから直接、または患者由来の異種移植片(PDX)モデルからの腫瘍サンプルを使用して間接的に誘導され得る。
<ol><li>単一細胞付着初代細胞培養物を入れた小型フラスコ(T25)を採取し、細胞培養培地を除去し、PBSで洗浄した後、1 mLの1x Accutase(細胞剥離溶液)( 材料の表を参照)を37°Cで3分間添加することにより、75%〜100%コンフルエントの付着性初代腫瘍細胞培養の単一細胞懸濁液を調製します。</li>
	<li>5 mLの細胞培養培地(10%FBS、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%L-グルタミンを添加したRPMI-1640培養培地; 材料の表を参照)を加えて、アキュターゼ溶液を中和します。</li>
	<li>10 mLの血清学的ピペットで細胞を吸引し、15 mLのコニカルチューブに入れます。チューブを800 x g で室温で5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞培養培地を取り出し、細胞ペレットの上に新鮮な細胞培養培地5 mLを加え、穏やかに混合します。</li>
	<li>血球計算盤10で生細胞をカウントする。これを行うには、50 μLの細胞懸濁液のアリコートを取り、50 μLのトリパンブルーと混合します。生細胞(青色に対して陰性の細胞)を数え、懸濁液中の生細胞の総数を計算します。</li>
	<li>「3D培養培地」(5%基底膜マトリックスを添加した細胞培養培地; 材料表を参照)を準備します。 注:「3D培地」は室温で液体状です。37°Cでは、粘稠度はよりゲル状になります(細胞が一緒にとどまるように)が、ピペットでピペッティングすることはできます(基底膜マトリックスが5%しか含まれていないため)。</li>
	<li>アッセイに必要な細胞数と必要な総量を計算します。各ウェルには、200 μLの培地に2,000〜8,000個の細胞が含まれている必要があります。</li>
	<li>200 μLの「3D培養培地」に所望の細胞数(4,000細胞など)の細胞懸濁液を調製し、ピペットで穏やかに混合して均一な分布を確保します。</li>
	<li>懸濁液をピペッティングリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、超低接着96ウェルプレートの各ウェルに200 μLの細胞懸濁液を追加します( 材料の表を参照)。細胞の各収集の前に、懸濁液をよく混合する。</li>
	<li>プレートを室温で300 x g で10分間遠心分離して細胞のクラスタリングを強化し、それによって細胞凝集を改善し、5%CO2加湿インキュベーター内でプレートを37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>2〜3日ごとに、「3D培地」を更新します。プレートを室温で300 x g で10分間遠心分離し、培地の50%(100 μL)を静かに取り出して廃棄し、100 μLの新鮮な「3D培養培地」を加えて既存の溶液を置き換えます。ステップ1.11を繰り返し、プレートを37°C、5%CO2加湿インキュベーターに戻します。 注意: 培地の除去は、プレートを45°に保持したときに実行する必要があり、細胞が収集されないように、培地は上部からのみ収集する必要があります。真空吸引システムは使用しないでください。新鮮な培地は、すでに形成され始めているスフェロイドを破壊しないように、ゆっくりと穏やかに添加する必要があります。</li>
	<li>1〜2日ごとに顕微鏡で細胞を検査して、スフェロイド形成を監視します。イメージングソフトウェアの「スケール」ツールを使用して形成されたスフェロイドの直径を測定します( 材料の表を参照)。 注:顕微鏡検査では、時間が経つにつれて回転楕円体の形状をとる不規則な円形から楕円形の物体が最初に明らかになります11,12。<ol><li>スフェロイド径が100〜200μmに達したら、薬効実験を行う。 注:薬効実験は、スフェロイドがこの直径に達したときに行われ、その時点で細胞の大部分が増殖しており、治療に対する反応を評価するのに役立ちます。より大きな直径のスフェロイドは、壊死コアおよび静止層11、12を含み、その結果、治療に応答する増殖細胞の割合が小さくなる。</li>
	</ol></li>
	<li>スフェロイド採取には、1,000 μLのピペットを使用して各ウェルからスフェロイドを回収し、15 mLのコニカルチューブに入れます。 注:スフェロイドは本質的に壊れやすく、穏やかな取り扱いが必要です。スフェロイドを含む培地を円錐形のチューブに移すときは、チューブを45°に保持し、チューブの壁にゆっくりとピペットで固定します。スフェロイドは目に見えます。</li>
	<li>コニカルチューブを室温で300 x g で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を注意深く吸引して廃棄します。</li>
	<li>0.5 mLの細胞培養培地を加え、ペレットを穏やかに再懸濁します。泡を作らないでください。</li>
	<li>以下の手順に従ってスフェロイドカウントを実行します。<ol><li>96ウェルプレートを使用し、ウェルの下側にプラス記号を描画して、ウェルを象限に分割します(カウントを追跡するのに役立ちます)。</li>
		<li>50 μLの懸濁液をウェルに加え、顕微鏡下で手動でスフェロイドを数えます(10倍の対物レンズを使用)。</li>
		<li>各象限の回転楕円体を数え、二重に数えないように注意し、ウェル内の回転楕円体の総数を計算します。 注:カウントの精度を高めるために、ウェル内の少なくとも50個のスフェロイドをカウントします。スフェロイドが50個未満の場合は、懸濁液を穏やかに混合して均一な分布を確保し、新しいウェルに添加した懸濁液の量を増やして再度カウントします。あるいは、ウェル内のスフェロイドが50個未満の場合は、スフェロイドを遠心分離し、<0.5 mLの容量で穏やかに再懸濁することができます。スフェロイドが100個を超える場合は、スフェロイド懸濁液に細胞培養培地を加え、穏やかに混合して再カウントします。</li>
		<li>スフェロイド濃度(スフェロイド数/計数体積[μL])を計算し、懸濁液中のスフェロイドの総数(スフェロイド濃度×総体積)を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.薬効アッセイ(MTTアッセイ)
注:詳細については、van Meerloo et al.13を参照してください。また、MTTアッセイでは、「3D培養培地」ではなく、細胞培養培地のみを使用する必要があります(基底膜マトリックスを追加する必要はなく、MTTアッセイに干渉する可能性があります)。
<ol><li>新しいチューブで、細胞培養培地200 μLあたり200スフェロイドの濃度でスフェロイド懸濁液を調製します(10%FBS、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%L-グルタミンを添加したRPMI-1640培養培地)。<ol><li>薬物治療ごとに、15 mLチューブにスフェロイドのストックを準備します。反復に必要なウェルの数で各薬物に必要な量を計算します:(5-8)×200μL。必要な最終濃度までチューブに薬を加えます。 注:本研究に使用された薬とその投与量については、代表的な結果のセクションを参照してください。また、薬の商業的詳細は 材料表に記載されています。</li>
	</ol></li>
	<li>200 μLのスフェロイド懸濁液を超低接着96ウェルプレートのウェルに移し、5%CO2加湿インキュベーター内でプレートを37°Cでインキュベートします。96ウェルプレートの外側の列は蒸発の増加を特徴とし、繰り返し実験間のばらつきが大きくなる可能性があるため、アッセイには使用しないでください。代わりに、これらのウェルにPBSを追加します。 注:培養物を96ウェルプレートに分注する前に、スフェロイドの培養が均一であることが重要です。また、すべての実験には、対照条件(未処理のスフェロイド)を含める必要があります。</li>
	<li>スフェロイドを治験薬と一緒に24〜72時間インキュベートした後、プレートを室温で300 x g で5分間遠心分離し、170 μLの細胞培養培地を静かに取り除き、30 μL(スフェロイドを含む)をウェルの底に残します。 注:170 μLの細胞培養培地の除去は、スフェロイドを除去しないように慎重に行う必要があります。プレートを45°に持ち、片方の手(コントラストのために暗い手袋を着用)をウェルの下に置き、回転楕円体が見えるようにします(白い点)。</li>
	<li>MTT溶液を調製します(フェノールフリーRPMI溶液0.714 mg / mL、 材料の表を参照)。</li>
	<li>70 μLのMTT溶液を各ウェルに添加し、ウェルあたり100 μLの最終容量にします(ウェル内の最終MTT濃度は100 μLあたり0.05 mgになります)。さらに、細胞を含まないMTT溶液で「ブランク」ウェルを調製します。 注意: MTTは光に敏感です。したがって、フード内のライトをオフにし、MTTソリューションを含むチューブをアルミホイルで覆う必要があります。</li>
	<li>プレートを5%CO2加湿インキュベーター中で37°Cで3〜4時間インキュベートし、ウェル内の溶液の色の変化が観察されるまで(紫色は生細胞を表す)。</li>
	<li>変化が見られたら、100 μLの停止液(イソプロパノール溶液0.1N HCl)を各ウェルに加え、気泡を作らずにウェルの内容物を穏やかに混合します。</li>
	<li>蛍光光度計-ELISAリーダー( 材料表を参照)で、波長570 nm、背景波長630〜690 nMでのプレートの吸光度を読み取ります。 注意: 利用可能な蛍光光度計-ELISAリーダーが超低アタッチメント96ウェルプレートを読み取ることができない場合は、各ウェルの内容物を対応する平底96ウェルプレートに移します。</li>
	<li>以下の手順に従って細胞生存率を計算します。<ol><li>各ウェルについて、「特異的シグナル」(「特異的シグナル」=570 nmのシグナル - 630-690 nmのシグナル)を計算します。次に、「ブランク」ウェルの平均値を計算し、各ウェルからこの値を差し引きます。</li>
		<li>治験薬(「AV-SS-unt」)で処理されなかった細胞を含む対照ウェルにおける「特異的シグナル」の平均を計算する。</li>
		<li>未処理細胞を含むウェルに対する各ウェル内の細胞の生存率(パーセンテージ)を計算します。 注:生存率=(各ウェルの特定のシグナル/"AV-SS-unt")×100</li>
	</ol></li>
</ol>3. スフェロイドの形態変化のモニタリングと解析
注:MTTアッセイに関しては、この評価では「3D培養培地」ではなく、細胞培養培地のみを使用する必要があります(基底膜マトリックスを追加する必要はなく、分析に干渉する可能性があります)。
<ol><li>スフェロイドをカウントした後、細胞培養培地(10%FBS、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%L-グルタミンを添加したRPMI-1640培養培地)で懸濁液を20 μLあたり約1〜2スフェロイドに希釈します。</li>
	<li>80 μLの細胞培養培地を超低接着96ウェルプレートのウェルに入れ、20 μLのスフェロイド懸濁液をウェルに加えます。 注:したがって、ウェルには100μLの容量で1〜2個のスフェロイドが含まれます。</li>
	<li>顕微鏡下でウェルを注意深くチェックし、この分析に使用される1つのスフェロイドを含むウェルに印を付けます。</li>
	<li>目的の濃度の2倍の濃度で治験薬を準備します。100 μLの薬液を関連するウェルに追加します(ウェル内の総濃度は1倍になります)。</li>
	<li>0日目(治験薬を追加する前)に各ウェルの画像をキャプチャし、イメージングソフトウェアの「スケール」ツール( 材料の表を参照)を使用して、スフェロイドの直径を決定します。</li>
	<li>プレートを5%CO2加湿インキュベーター内で37°Cでインキュベートし、薬物効果が観察される時期に応じて、形態を調べ、「スケール」ツールを使用して3〜7日間毎日スフェロイドの直径を測定します(例:細胞播種、侵襲性ポッド、構造破壊など)。</li>
	<li>実験の最後に、時間の経過に伴う回転楕円体の直径の変化(0日目に対する)をプロットします。 注: 変化 (パーセンテージ) = (特定の日における回転楕円体の直径/0日目におけるその回転楕円体の直径) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
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<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+What+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
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<li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+goes+three-dimensional%3A+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li>
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<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

本プロトコルは、ヒト腫瘍サンプルに由来する3D初代細胞培養物(スフェロイド)を生成するための簡単な方法を記載する。これらのスフェロイドは、潜在的な薬剤候補や薬剤の組み合わせの評価、潜在的なバイオマーカーや治療標的の特定、応答と耐性のメカニズムの調査など、さまざまな分析に使用できます。このプロトコルでは、患者サンプルから直接得られた初代腫瘍細胞、またはPDXモデル由来の腫瘍細胞のいずれかを使用し、患者サンプルを使用して確立することができます。後者のアプローチは、同じ原発腫瘍を用いて インビトロ および インビボ 実験を行うことを可能にする。PDXモデルとこれらのモデル9に由来する3D培養との間の薬物感受性実験の結果では一貫性が以前に示されており、したがって、このin vitro/in vivo アプローチの関連性を裏付けています。
現在のプロトコルの主な利点には、ほとんどの固形腫瘍への幅広い適用性と、癌研究/細胞生物学ラボの典型的な機能/機器との互換性に起因する費用...

インビトロおよびインビボ研究は、がん治療法を開発するための補完的なアプローチを表しています。in vitroモデルは、ほとんどの実験変数の制御を可能にし、定量分析を容易にします。多くの場合、低コストのスクリーニングプラットフォームとして機能し、機構研究にも使用できます1。ただし、そのようなモデルは腫瘍微小環境を部分的にしか反映していないため、それらの生物学的関連性は本質的に制限されています1。対照的に、患者由来の異種移植片(PDX)などのin vivoモデルは、腫瘍微小環境の複雑さを捉えており、トランスレーショナルスタディや患者の個別化治療(つまり、個々の患者に由来するモデルで薬物に対する反応を調査する)に適しています1。しかし、in vivoモデルは、実験パラメータをin vitroモデルほど厳密に制御できず、その開発に時間がかかり、労働集約的で、コストがかかるため、薬物スクリーニングのためのハイスループットアプローチを助長しません1,2。
in vitroモデルは100年以上前から利用可能であり、細胞株は70年以上前から利用可能です3。しかし、過去数十年の間に、固形腫瘍の利用可能なin vitroモデルの複雑さは劇的に増加しました。この複雑さは、腫瘍由来の確立された細胞株または初代細胞株のいずれかである2次元(2D)培養モデル(単層構造)から、3次元(3D)モデルを含む最近のアプローチまで多岐にわたります1。2Dモデル内では、確立された細胞株と初代細胞株が重要な違いがあります4。確立された細胞株は不死化されています。したがって、同じ細胞株を長年にわたってグローバルに使用することができ、歴史的な観点から、コラボレーション、データの蓄積、および多くの治療戦略の開発が容易になります。しかし、これらの細胞株の遺伝的異常は継代ごとに蓄積するため、生物学的関連性が損なわれます。さらに、利用可能な細胞株の数が限られていることは、患者4,5における腫瘍の不均一性を反映していない。原発がん細胞株は、生検、胸水、または切除によって得られた切除された腫瘍サンプルから直接得られます。したがって、原発がん細胞株は、腫瘍微小環境の要素や、細胞間挙動(健康な細胞とがん細胞の間のクロストークなど)やがん細胞の幹細胞様表現型などの腫瘍特性を保存するため、生物学的により関連性があります。しかし、初代細胞株の複製能力は限られているため、培養時間が短くなり、分析に使用できる腫瘍細胞の数が制限されます4,5。
3D培養を使用するモデルは、in vivo条件が保持されるため、2D培養モデルよりも生物学的に関連性があります。したがって、3D培養モデルは、自然な細胞の形状と成長を維持し、低酸素、壊死、細胞接着などの腫瘍環境の要素を複製します。がん研究で最も一般的に使用される3Dモデルには、多細胞スフェロイド、足場ベースの構造、およびマトリックス埋め込み培養が含まれます4、6、7。
本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデル(多細胞スフェロイド)を生成し、細胞生存率アッセイ(MTT)と顕微鏡検査の2つの補完的なアプローチを使用して薬物に対する感受性を評価します。ここに提示される代表的な結果は、乳がんおよび結腸がんからのものです。ただし、このプロトコルは、他の固形腫瘍タイプ(胆管がん、胃がん、肺がん、膵臓がんなど)にも広く適用でき、特殊な機器に依存せずに一般的ながん研究/細胞生物学ラボで完全に実行できるため、費用対効果も高くなります。このアプローチを使用して生成された多細胞スフェロイドは、潜在的な薬剤候補の評価、潜在的なバイオマーカーまたは治療標的の特定、および応答と耐性のメカニズムの調査に使用できます。
このプロトコルは3つのセクションに分かれています:(1)薬効をテストするためのモデルとして使用するためのスフェロイドの生成、収集、およびカウント。(2)スフェロイドに対する薬効を評価するためのMTTアッセイ;(3)薬物有効性を評価するための別のアプローチとしてのスフェロイドの薬物による治療後の形態学的変化の顕微鏡的評価(図1)。

<table><tbody><tr><td>5 フルオロウラシル</td><td>TEVA イスラエル</td><td>ロット 16c22NA</td><td>フルオロウラシル、Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase 細胞解離</td></tr><tr><td>シスプラチン</td><td>TEVA イスラエル</td><td>20B06LA</td><td>アビプラチン、&nbsp;</td></tr><tr><td>カルトレックス&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>基底膜マトリックス、3型</td></tr><tr><td>DMSO (ジメチルスルホキシド)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>フラロメーター&nbsp;ELISAリーダーBiotek</td><td></td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>塩酸(HCl)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>for stop solution</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>&nbsp;バージョン1.52a</td><td>オープンソースソフトウェアImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>for stop solution</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>パルボチクリブ&nbsp;&nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS #571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)*カルシウムとマグネシウム</td></tr><tr><td>ペニシリンなし&ndash;ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-free RPMI 1640</td><td>Biological industries, Israel</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>ピッペッティングリザーバー</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培地&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>トラスツズマブ</td><td>F. ホフマン - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.5% solution</td><td>Biological industries, Israel</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>超低アタッチメント 96 ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>ビノレルビン</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>へそ</td></tr></tbody></table>

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

腫瘍生物学の理解は目覚ましい進歩を遂げているにもかかわらず、臨床試験に入る腫瘍薬候補の大多数は、多くの場合、臨床効果の欠如が原因で失敗します。この高い失敗率は、主に腫瘍の不均一性と腫瘍の微小環境を反映する上での不十分なために、現在の前臨床モデルが臨床効果を予測できないことを明らかにしています。これらの制限は、個々の患者に由来するヒト腫瘍サンプルから確立された3次元(3D)培養モデル(スフェロイド)で対処できます。これらの3D培養は、腫瘍の不均一性を反映しない確立された細胞株よりも現実世界の生物学をよりよく表しています。さらに、3D培養は、低酸素、壊死、細胞接着などの腫瘍環境の要素を複製し、自然な細胞の形状と成長を維持するため、2次元(2D)培養モデル(単層構造)よりも優れています。本研究では、多細胞スフェロイドで増殖する個々の患者からの癌細胞の初代培養を調製する方法を開発しました。細胞は、患者腫瘍または患者由来の異種移植片から直接誘導することができる。この方法は、固形腫瘍(結腸、乳房、肺など)に広く適用可能であり、特殊な機器に頼らずに典型的な癌研究/細胞生物学ラボで完全に実行できるため、費用対効果も高くなります。ここでは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデル(多細胞スフェロイド)を生成し、細胞生存率アッセイ(MTT)と顕微鏡検査の2つの補完的なアプローチを使用して薬物に対する感受性を評価するためのプロトコルを提示します。これらの多細胞スフェロイドは、潜在的な薬剤候補の評価、潜在的なバイオマーカーまたは治療標的の特定、および応答と耐性のメカニズムの調査に使用できます。

このプロトコルは、原発腫瘍細胞からスフェロイドの均質な培養を生成し、スフェロイド培養に対する薬効を定量的に評価し(MTTアッセイ)、およびスフェロイド形態に対する治験薬の効果を決定するための手順を提示します。結腸および乳癌細胞培養から生成されたスフェロイドにおける代表的な実験からのデータが提示される。同様の実験を、胆管癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌を含む他の腫瘍タイプを用いて実施した(データは示さず)。本明細書に提示する全ての実験は、三連で行われた。
図2 は、初代大腸癌細胞培養物から作製したスフェロイドを示す。 図2に見られるように、生成されるスフェロイドの数は、各ウェルに最初に播種された細胞の数に依存する。スフェロイドの直径100μm以上への成長には10〜14日かかりました。腫瘍細胞の起源(例えば、異なる患者および異なる起源)が増殖速度を決定した。ウェルにより多くの細胞を播種しても、スフェロイドの生成に必要な時間は短縮されず、形成されるスフェロイドの数が増加しま...

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

私たちのプロトコルは、初代がん細胞からの3D腫瘍培養モデルの生成を記述し、このモデルは細胞株よりも実際の腫瘍生物学をよりよく表しているため、重要です。このアプローチは、さまざまな固形腫瘍に適用できます。また、典型的な細胞生物学ラボで最初から最後まで実行できるため、費用対効果も高くなります。このアプローチを使用して生成された3D腫瘍モデルは、抗がん療法または治療法の組み合わせに対する腫瘍の感受性と耐性に関する研究をサポートします。このアプローチでは、初代がん細胞から3Dモデルを生成します。したがって、どの治療法が特定の患者に効果的である可能性が高いかを特定し、彼または彼女の治療をパーソナライズするのに役立ちます。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるエラ・イツァキです。まず、シングルセル接着初代細胞培養液を入れた小さなT25フラスコを取り、細胞培養培地を取り除きます。細胞をPBSで洗浄し、1ミリリットルの1xアキュターゼを摂氏37度で3分間添加して、75〜100%コンフルエンスの付着性初代腫瘍細胞培養物の単一細胞懸濁液を調製します。5ミリリットルの細胞培養培地を加えてアキュターゼ溶液を中和します。細胞を10ミリリットルの血清学的ピペットで吸引し、15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。チューブを800gで室温で5分間遠心分離します。細胞培養培地を取り出し、細胞ペレットの上に8ミリリットルの新鮮な細胞培養培地を加え、穏やかに混合します。血球計算盤で生細胞をカウントするには、50マイクロリットルの細胞懸濁液のアリコートを取り、それを50マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。次いで生細胞をカウントし、懸濁液中の生細胞の総数を計算する。次に、3D培地を調製します。そしてアッセイに必要な細胞数と必要な総量を計算した後、200マイクロリットルの3D培養液に所望の細胞数で細胞懸濁液を調製します。ピペットで穏やかに混合して、均一な分布を確保します。懸濁液をピペッティングリザーバーに移し、マルチチャンネルピペットを備えた超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。プレートを室温で300gで10分間遠心分離して細胞のクラスター化を強化し、それによって細胞凝集を改善し、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内でプレートを摂氏37度でインキュベートします。室温で300gで10分間再度遠心分離した後、50%の培地を静かに取り出して廃棄し、100マイクロリットルの新鮮な3D培養培地を加えて既存の溶液を置き換えます。この手順を繰り返し、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%加湿インキュベーターに戻します。顕微鏡で細胞を1〜2日ごとに検査して、スフェロイド形成を監視します。イメージングソフトウェアのスケールツールを使用して形成されたスフェロイドの直径を測定します。そして、スフェロイドの直径が100〜200マイクロメートルに達したら、薬効実験を行います。スフェロイド採取の場合は、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して各ウェルからスフェロイドを収集し、それらを15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。コニカルチューブを室温で300gで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を注意深く吸引して廃棄します。0.5ミリリットルの細胞培養培地を加え、ペレットをよく、しかし穏やかに再懸濁します。回転楕円体カウントを実行するには、96ウェルプレートを使用し、ウェルの下側にプラス記号を描画して、ウェルを象限に分割します。50マイクロリットルの懸濁液をウェルに加える。また、10倍の対物レンズを使用して、顕微鏡下で手動でスフェロイドを数えます。各象限のスフェロイドを数え、ウェル内のスフェロイドの総数を計算します。次に、体積をカウントしてスフェロイド数を2倍にしてスフェロイド濃度を計算し、懸濁液中のスフェロイドの総数を計算します。新しいチューブで、細胞培養培地200マイクロリットルあたり200スフェロイドの濃度でスフェロイド懸濁液を調製します。薬物治療ごとに、異なるチューブにスフェロイドのストックを準備します。リピートに必要なウェルの数で各薬剤に必要な総量を計算し、必要な最終濃度まで薬剤をチューブに追加します。200マイクロリットルのスフェロイド懸濁液を超低付着96ウェルプレートのウェルに移し、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内でプレートを摂氏37度でインキュベートします。スフェロイドを治験薬と一緒に24〜72時間インキュベートした後、プレートを300gで室温で5分間遠心分離し、170マイクロリットルの細胞培養培地を静かに取り除き、ウェルの底に30マイクロリットルを残します。MTT溶液を調製し、各ウェルに70マイクロリットルの溶液をウェル当たり100マイクロリットルの最終容量まで添加する。ウェル内の最終的なMTT濃度は、100マイクロリットルあたり0.05ミリグラムになります。さらに、細胞を含まないMTT溶液でブランクウェルを調製します。ウェル内の溶液の色の変化が観察されるまで、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内でプレートを摂氏37度で3〜4時間インキュベートします。変化が観察されたら、各ウェルに100マイクロリットルのStop溶液を加え、気泡を発生させずにウェルの内容物を穏やかに混合します。パラメータELISAリーダーで、波長570ナノメートルおよび背景波長630〜690ナノメートルでのプレートの吸光度を読み取ります。細胞生存率を計算するには、各ウェルの特異的シグナルを計算します。次に、ブランクウェルの平均値を計算し、各ウェルからこの値を差し引きます。治験薬で処理されなかった細胞を含むコントロールウェルの特異的シグナルの平均を計算します。最後に、未処理の細胞を含むウェルに対する各ウェルの細胞の生存率を計算します。ここでは、初代結腸癌細胞培養物からのスフェロイドの形成を、最初に播種した細胞の数によって経時的に示します。この図から、生成されるスフェロイドの数は、各ウェルに最初に播種された細胞の数に依存することがわかる。1ウェル当たり2, 000の初期細胞播種による培養10日後の初代結腸癌細胞からのスフェロイドをここに示す。結腸癌スフェロイドを長期間培養すると、それらは互いに付着し始め、スフェロイドとブドウ様構造のクラスターを形成し、均質な培養を妨げ、MTTアッセイでのスフェロイドの使用を禁止しました。結腸がんおよび乳がんを含む原発性腫瘍細胞由来のスフェロイドに対するパルボシクリブ、スニチニブ、およびそれらの組み合わせの効果をここに示します。MTTアッセイは、結腸および乳癌細胞に由来するスフェロイドに対して実施されました。MTTシグナルをDMSO処理細胞からの値に正規化した。値は、4回から8回の反復の平均を表します。細胞増殖に対する様々な処理の効果も、結腸癌および乳癌細胞に由来するスフェロイドの0日目および3日間の治療後に顕微鏡で評価された。乳がん由来のスフェロイドに対するトラスツズマブとビノレルビンの併用および5つのフルオロウラシルとシスプラチンの経時的な効果をこの図に示します。治療期間によるゼロ日目に対するスフェロイドの直径の変化をここに示す。各治療群には、各ウェルに1つのスフェロイドを有する4〜6つのウェルが含まれていた。ここでは、平均的な変化を示します。スフェロイドは、抗がん治療への反応を超えた多くの研究にとって重要なツールです。これらの研究は、例えば、薬物送達や、細胞間相互作用などの基本的な生物学の問題にも取り組んでいます。単一細胞懸濁液でスフェロイド生成プロセスを開始することが重要です。また、5%の基本的な膜メトリックを含む培地で超低接着プレートを使用することも重要です。

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Cancer Research

がん研究

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

療法の評価を目指して私たち頭頸部扁平上皮癌細胞株に対する実験的治療レジメンの現在の規格をテストすることができる回転楕円体に基づく、三次元の in...

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース...

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

光コヒーレンストモグラフィ...

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。...

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。...

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。...

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

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腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

ここでは、3次元(3D)神経膠腫スフェロイドと細胞外フラックス分析によるイメージングベースの正規化を統合した代謝プロファイリングプラットフォームを確立します。このアプローチにより、薬物治療に対する腫瘍代謝反応をより正確に評価できるようになり、耐性の潜在的なメカニズムについての洞察が得られます。...

薬物スクリーニングのための三次元脳腫瘍スフェロイドの代謝プロファイリングの進歩

学ぶ 患者由来の3次元腫瘍スフェロイド樹立法と薬物感受性評価法。一次がん細胞を用いたコスト効率の良いモデルにより、固形腫瘍の治療薬選択と個別化医療への応用を支援します。

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

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