マイクロバブルを用いたヒト末梢血単核細胞サンプルからの浮遊選鉱ベースのT細胞の単離、活性化、および増殖(英語)
2022年12月23日
この研究の目的は、初代ヒトT細胞を単離、活性化、および増殖させるための浮遊選鉱ベースの分離の実現可能性を実証することです。
マイクロバブルの活性化および拡張プロトコルは、細胞治療の研究と製造における満たされていない主要なニーズに対応し、T細胞療法の持続性と有効性を向上させるため、重要です。Akadeumの浮力ベースのポジティブセレクション、活性化、および拡張技術は、活性化および拡張ワークフロー中の過剰刺激とその後のT細胞の消耗を制限します。まず、市販のPBMCを2.5ミリリットルの分離バッファー中で10〜8回3回インキュベートし、ビオチン化抗CD3抗体を使用します。
ピペッティングで成分を穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートします。製造元の指示に従って、剥ぎ取ったアビジンマイクロバブルを0.5対1の比率で細胞に追加します。そして、市販のエンドオーバーエンドローテーターを使用して、室温で20RPMで10〜15分間混合します。
室温で5分間400gで遠心分離します。遠心分離後、ポジティブに選択された細胞は、剥ぎ取られたアビジンマイクロバブルとともに懸濁液の上部にあり、残りの非選択細胞はチューブの下部にある細胞ペレット中にあります。9インチのガラスピペットを使用して、バブルセル層の下の先端をチューブの底に挿入します。
細胞ペレットと清液を電動ピペットで吸引し、新しいチューブに移します。元のチューブに残ったバブルセル層を1ミリリットルの完全なT細胞培地に再懸濁します。室温で400gで5分間遠心分離し、純度と回収率の間接測定に使用します。
亜清および未選択細胞の遠心分離後、上清を吸引し、カウントする前にペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁した。自動セルカウンターを使用して、明視野顕微鏡で下清中の細胞をカウントし、テキスト原稿に記載されているように、バブルセル層に捕捉された細胞の数を決定します。結合した抗CD28除去アビジンとマイクロバブルを作成するには、市販のマイクロバブルにビオチン化抗CD28抗体を加え、エンドオーバーエンド回転を使用して最低2時間混合します。
調製した気泡細胞懸濁液に抗CD28結合連鎖球菌アビジンマイクロバブルを1.5対1の比率で添加する。エンドオーバーエンド回転を使用して15分間コンポーネントを混合します。次に、得られた細胞数に応じて、完全なT細胞培地、または別の所望の培地を用いて、総体積をミリリットル当たり200万細胞に調整する。
1ミリリットルの活性化細胞を24ウェルプレートに分配し、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。24時間後、IL-2と可溶性抗CD3を加えて、0日目に播種した最初の細胞数を使用して計算したように、さらなる増殖を促します。細胞プレートを加湿した二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で一晩インキュベートします。
2日ごとに培地の半分を中清から取り除きます。それを新鮮で完全なT細胞培地と交換し、ミリリットルあたり50単位の濃度でIL-2を追加します。T細胞を週に2回カウントして、細胞密度を評価します。
細胞密度がミリリットルあたり10〜6セルの2倍、または10〜6セルの2.5倍を超える場合は、より大きな容器に移し、ミリリットルあたり5倍の10〜5セルに希釈します。上下にピペッティングして各ウェルの内容物を穏やかに混合します。マイクロバブルを含むウェルの内容物全体を取り除き、1.5ミリリットルのチューブに移します。
400マイクロリットルのカルシウムフリーおよびマグネシウムフリーのDPBSで各ウェルを洗浄し、溶液を1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを400gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを50マイクロリットルの分離バッファーに再懸濁した。
次に、活性化と枯渇のために50マイクロリットルの細胞懸濁液をそれぞれ25マイクロリットルに分割します。活性化および枯渇抗体染色カクテルで細胞を染色し、暗所で室温で10分間インキュベートします。1ミリリットルの分離バッファーを加え、穏やかに混合し、遠心分離機で余分な抗体を洗い流します。
上清を完全に吸引します。細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析用の適切な容器に移します。生存可能なT細胞数および導入遺伝子陽性T細胞の増加は、対照試料とマイクロバブル共刺激を受けた細胞との間に観察された。
エフェクター細胞集団の増加もマイクロバブルサンプルで観察されました。生存可能な活性化T細胞は、増加した早期活性化マーカーCD69、および中期から後期活性化マーカーCD25を発現する。枯渇マーカーPD1陽性細胞の総数と割合も、マイクロバブル共刺激を受けた細胞サンプルで有意に高かった。
マイクロバブルは攪拌せずに急速に表面に浮遊するため、正確な投与を確保するためには、マイクロバブルの適切な混合と分注が不可欠です。他の方法で頻繁に見られるより消耗したT細胞よりも高い活性を持つT細胞の大規模な集団の急速な成長を可能にすることによって、それがそうすることを完全に期待しています。
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概要
この研究は、浮遊分離法を用いて一次ヒトT細胞を分離、活性化、増殖させる技術の実現可能性を示しています。この方法はT細胞療法における重要な課題に対処し、細胞の持続性と有効性を高めます。
主要な研究構成
科学の分野
- 細胞療法
- 免疫学
- 細胞活性化
背景
- 細胞療法研究はT細胞の活性化と増殖に課題を抱えています。
- 過度の刺激はT細胞の疲労につながる可能性があります。
- T細胞の持続性を改善することは効果的な治療のために重要です。
- 浮遊分離法はこれらの問題に対する新しいアプローチを提供します。
研究の目的
- 一次ヒトT細胞を効果的に分離すること。
- 過度の刺激を最小限に抑えながらT細胞を活性化すること。
- 治療目的でT細胞を増殖させること。
使用した方法
- PBMCsをビオチン化された抗CD3抗体でインキュベートする。
- 細胞分離のためにアビジンを除去したマイクロバブルを使用。
- 室温で軽く混合し、インキュベーションする。
- 最適な混合のために商用エンドオーバーエンドローテーターを適用。
主な結果
- 浮遊分離法はT細胞を効果的に分離しました。
- 活性化プロトコルはT細胞の持続性を改善しました。
- プロセス中のT細胞疲労のリスクを最小限に抑えました。
- 細胞療法における将来の応用の実現可能性を示しました。
結論
- 浮遊分離法はT細胞療法のための有望な方法です。
- T細胞の活性化と増殖における重要な課題に対処します。
- このアプローチはT細胞療法の効果を高める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient T cell isolation, activation, and expansion are critical inflection points in cell therapy R&D, directly impacting the quality and persistence of therapeutic cell products. The flotation-based microbubble protocol addresses the challenge of T cell exhaustion by enabling controlled activation and scalable expansion, supporting predictive confidence in downstream applications. This workflow is highly relevant for biopharma teams advancing cell-based immunotherapies and translational research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of T cell activation pathways using ex vivo human samples.
- Supports biological de-risking by minimizing overstimulation and exhaustion during expansion.
- Facilitates robust target validation through quantitative assessment of activation and exhaustion markers.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, activated T cell populations for downstream screening and functional assays.
- Standardizes activation protocols to improve reproducibility and quantitative output consistency.
- Enables scalable expansion suitable for high-throughput or platform-based screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of activation (CD69, CD25) and exhaustion (PD-1) markers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing physiologically relevant T cell populations.
- Reduces risk of late-stage failure due to functional exhaustion in cell therapy candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This flotation-based protocol integrates from early discovery through preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational workflows for cell therapy programs.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and mechanistic de-risking of T cell activation strategies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing activation and exhaustion across conditions.
- Analytics: Enables flow cytometric measurement of activation and exhaustion markers to inform go/no-go decisions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and functional assessment relevant to clinical translation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across multiple cell therapy and immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T cell function and persistence for therapeutic applications.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of T cell expansion workflows.
- Strategic Value: Enables better portfolio triage and risk-adjusted advancement of cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk by minimizing T cell exhaustion during manufacturing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, flow cytometry, and immunophenotyping.
- Needs access to microbubble reagents, automated cell counters, and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible activation and expansion.
- Adaptable to various human PBMC sources and compatible with multiple downstream assays.
- Proper microbubble handling and mixing are essential to ensure accurate dosing and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:29
Isolation of T Cells with Microbubbles Using Positive Selection
1:51
Co-Stimulation (Activation) of the Positively Selected T Cells
2:52
Expansion of the Co-Stimulated Cells in Cell Culture Medium
3:28
Expansion of the T Cells (With or Without Prior Transduction)
4:02
Harvesting the T Cells and Flow Cytometry
5:16
Results: Assessment of Viable and Successfully Transduced Cells
5:58
Conclusion
