Name: マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学ぶマウス脳からのシナプス成分単離法。シナプトソームとシナプス小胞を高純度に分画し、タンパク質の局在と機能をコンパートメントレベルで解析できます。神経変性疾患の分子メカニズム解明に有用です。

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EM画像の準備をしてくれたP.コロシに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(R01 NS064963、SSC;R01 NS110354, SSC;R01 NS083846, SSC;R21 NS094971, SSC;T32 NS007224、SMT;T32 NS041228、SMT)、米国国防総省(W81XWH-17-1-0564、SSC;W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science Across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC), and the Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ).BioRender.com を使用してグラフィカルなイラストを作成しました。

著者は開示するものは何もありません。

彼らの独創的な研究において、Whittakerと同僚はシナプトソームを特定するために4つの形態学的基準を使用しました:(1)構造は密封された原形質膜を持っています。(2)構造には、神経終末および静脈瘤のサイズと数に類似したSVが含まれています。(3)前記構造体は、1つ以上の小さなミトコンドリアを有し、(4)シナプス前膜は、シナプス後成分11、12、13に頻繁に接着される。最初の2つの基準は一般的にすべての単離方法に適用されますが、この記事で説明されている最新のプロトコルでは、結果として生じるすべてのシナプトソームがミトコンドリアとシナプス後末端を結合するわけではありません。シナプトソームの約60%がミトコンドリアを有し、シナプス後終末を付着していると推定されるのは最大15%のみである37。シナプス後成分が特に興味深い場合、濃縮のための等張クレブス様ホモジナイゼーションバッファーと圧力ろ過の使用は、シナプス後末端を有する高濃度のシナプトソーム(シナプトニューロソームとも呼ばれる)を生成することが知られています22,38。
動物を犠牲にする方法は、シナプトソームおよびシナプス亜分画の質に影響を与える可能性がある。麻酔を必要としない安楽死法を使用して犠牲にされた成体動物は、最高の画分品質をもたらします。さらに、脳は凍結ではなく新たに解剖し、最も生存可能なシナプス画分に対して1:10の比率のホモジナイズバッファー(重量/体積)を使用してホモジナイズする必要があります22。脳には、それらが運ぶ神経伝達物質の種類によって区別できるシナプスの不均一な集団があります。シナプトソーム形成は、一般に、シナプス型または神経伝達物質含量の影響を受けない13。例外は小脳の苔状線維であり、これは脳の残りの部分からシナプトソームを得るための最適な条件で破壊されることが知られている39,40。したがって、この領域の除外が実験目標に影響を及ぼさない場合は、脳の均質化の前に小脳を除去することが推奨されます。特定の神経伝達物質特性のシナプトソームを単離することに関心がある場合、関心のある神経伝達物質を含むニューロンに富む脳の領域を最初に単離することができる。ただし、このアプローチでは、関心領域のサイズに応じて、最終的な分数収量に制限が課されます(したがって、動物の年齢も考慮されます)。神経伝達物質特異的シナプトソームの単離には免疫化学的方法がありますが、生存率と収量は著しく損なわれます22。シナプトソーム代謝生存率を評価することが重要である場合、神経伝達物質放出の測定41、42またはある種の酵素アッセイ43が採用され得る。
シナプトソーム調製物中の一般的な汚染物質には、ミクロソーム、遊離ミトコンドリア、SV、ならびにニューロンおよびグリア膜が含まれる。汚染は、P1およびP2画分22での洗浄回数を増やし、後続のステップでの赤いミトコンドリアペレットの再懸濁を回避することによって減らすことができます。代謝生存率と時間が重要な実験では、洗浄回数を減らし、スクロース勾配よりもFicollまたはPercoll勾配を使用することが役立ちます44,45,46。これらの方法はまた汚染を大幅に減らします。ウィテカーの元のプロトコルは、高品質のSVを生み出しました。この方法に含まれるNagyら23によるさらなる最適化は、歩留まりを大幅に損なうことなく、驚くべき均質性と純度を持つSVを生成します36。グルタミン酸作動性(VGLUT-1含有)またはGABA作動性(VGAT-1含有)SVなどの特定のSVサブタイプが対象である場合、特異的抗体を用いた免疫単離を行うことができる47,48。CCVをシナプトソームから単離するための代替方法も利用可能であり、シナプトソームは密度が異なるため、この方法20,49,50で得られたSVと同じ界面に存在しない可能性がある。
全体として、シナプス成分を単離するための本プロトコールは、ソース脳組織の質および量および実験目標に基づいて、改善された均質性および生存率を有する画分を得るためにさらに最適化され得る。トラブルシューティングの詳細については、Dunkley and Robinson22 および Ganzella et al.36 の書籍の章を参照してください。

シナプスは、ニューロンが通信し、多様で絶妙に複雑な機能を発揮するための脳の基本的な計算単位です。したがって、シナプスは脳の健康の基本です1;シナプス機能障害は、多くの障害の原因または結果として関係しています2。シナプスは、シナプス前およびシナプス後終末、シナプス接着分子が横断するシナプス間隙によって密接に関連および分離された2つの異なるニューロンの拡張によって構成される。情報は、シナプス前からシナプス後のコンパートメントから、神経伝達物質1と呼ばれる化学伝達物質の形で流れます。神経伝達に関与する分子プロセスは、研究の活発な分野です3,4,5。シナプス終末内の病原性プロセスと、他のニューロンサブコンパートメントの病理に対するシナプスの応答を理解することは、脳の障害に対処するための重要なステップです1,2。主にマウスモデルに適用されるいくつかの方法論の進歩は、この追求を進めました6。差動遠心分離によるシナプス画分の単離は、健康と疾患におけるシナプスプロセスの詳細な評価を可能にしたパラダイムシフト法の1つです。
成人の人間の脳は、80〜900億個のニューロンで構成されています7,8。マウス種の中で、ラットの脳には約~2億個のニューロンが含まれていますが、マウスには~7000万個のニューロンがあります9,10。各ニューロンは、グリア細胞と密な血管系と混ざり合った高度に分極されたニューロンのネットワークと何千もの特定のシナプス接続を形成します。このような複雑で不均一な組織では、シナプスを独立したシステムとして分離して研究することはかつて考えられませんでした。1960年代に、Victor Whittaker、Catherine Hebbらは、細胞内分画を用いて無傷のシナプス終末を単離することによってこれを可能にしました11,12,13,14。シナプス小胞(SV)を単離するために、彼らは等浸透圧(0.32 M)スクロース中の液体せん断力とそれに続く超遠心分離によって脳を均質化した。彼らは、挟み込まれた原形質膜に囲まれた無傷の神経終末または静脈瘤を取得し、それを神経終末粒子(NEP)と呼んだ11,13。シナプスの構造的および機能的特徴がこれらの構造に保存されているため、NEPは後に他の細胞内オルガネラとの合同のために「シナプトソーム」と呼ばれました13,15。「シナプス小胞」という用語を作り出したEduardo de Robertisらの研究は、Whittakerらの研究と重複し、「シナプトソーム」の単離と特性評価の検証に貢献したことは注目に値します16,17,18。
シナプトソームは、神経伝達物質の貯蔵、放出、および再取り込みに必要なすべての細胞および分子特性を含む生理活性構造である13,18。in vitroでの主要なシナプス特性の保存および非シナプス成分からの解放もまた、この単離方法の有用性に寄与する。シナプトソームは、神経伝達の化学的および生理学的特性の理解に大きく貢献しており、現在、シナプス分子プロセスおよび疾患におけるそれらの変化の研究に使用されています19,20,21,22,23。シナプトソームは、SV、クラスリン被覆小胞(CCV)、シナプス細胞質ゾル、シナプス原形質膜、シナプスミトコンドリア、シナプス接着分子、およびその他の関心のある成分などのシナプス成分を単離するための最初の供給源でもあり、シナプス機能の分子メカニズムの理解を容易にすることができます18,19,20,24,25,26、27,28。これらのサブシナプス成分は、シナプトソームの浸透圧溶解およびスクロース密度勾配超遠心15、29によって得ることができる。Whittakerの研究グループによる元の細胞内分画法は、高品質のシナプトソームとSVを単離するのに効率的であることが知られていますが13,30、最近の最適化により、細胞内画分の純度が向上しています22,23,31,32。この記事では、シナプトソーム、SV、およびその他のシナプス下コンポーネントを分離するためのマウス脳組織の細胞内分画のための従来のプロトコルの非常に詳細でアクセスしやすいバージョンを提供します。

<table><tbody><tr><td>1 mL TB シリンジ</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL エッペンドルフ</td><td>チューブ USA サイエンティフィック</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>14 mL、オープントップ シンウォール ウルトラクリア チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344060</td><td>SW 40 Ti</td></tr><tr><td>23 ゲージ プレシジョン グライド ハイドーミック ニードル</td><td>BD</td><td></td> 305145 <td></td></tr><tr><td>26.3 mL、キャップ アセンブリ付きポリカーボネート ボトル</td><td>ベックマン コールター</td><td>355618</td><td>Ti70</td></tr><tr><td>3.5 mL、オープントップ厚肉ポリプロピレンチューブ</td>に対応 <td>ベックマン・コールター</td><td>349623</td><td>TLA-100.3</td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td>に対応 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15 遠心フィルターユニット&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A6279</td><td>1 mg/mL in diH2O</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B22984</td><td><26,000 rpm</td></tr><tr><td>卓上型 HDPE デュワーフラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>5028U19</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>The Jackson Labs</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td><14,000 rpm</td></tr><tr><td>完了、ミニ、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td>溶液50mLあたり1錠を追加</td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>ファイン手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>8r</td><td></td></tr><tr><td>グラスコールコール組織均質化システム</td><td>コールパーマー</td><td>UX-04369-15</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>高速ポリカーボネート丸底遠心分離チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3117-0500</td><td>JA20</td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>に対応 ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>JA-20 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>アメリカンバイオ</td><td>AB01108</td><td>1 mg/mL in diH2O</td></tr><tr><td>N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸](HEPES)</td><td>American Bio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-80 XP超遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td><100,000 rpm</td></tr><tr><td>オプティマ TLX 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td><120,000 rpm</td></tr><tr><td>ペプスタチン A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>1 mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>American Bio</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23335</td><td>タンパク質濃度の測定用</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>外科用はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Tiスイングバケットローター</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>テフロンコーティングされた乳棒と乳鉢ティッシュグラインダー</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>3431D94Ti70</td><td></td></tr><tr><td>ローター</td><td>ベックマンコールター</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3ローター</td>ベ<td>ックマンコール</td><td>ター349490</td><td></td></tr><tr><td>チューブリボルバー</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>DTR-02VS</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

シナプス終末は、ニューロンコミュニケーションの主要な部位です。シナプス機能障害は、多くの神経精神障害および神経障害の特徴です。したがって、生化学的分離によるシナプスサブコンパートメントの特性評価は、健康と疾患の両方におけるシナプスプロセスの分子基盤を解明するための強力な方法です。このプロトコルは、細胞内分画によるマウス脳からのシナプス終末およびシナプスサブコンパートメントの単離を記載する。まず、シナプトソームとして知られる密封されたシナプス末端構造は、脳組織の均質化に続いて単離されます。シナプトソームは、挟み込まれた密封された膜を有するニューロンのシナプス前およびシナプス後のコンパートメントである。これらの構造は代謝的に活性な状態を保持しており、シナプスの構造と機能を研究するために価値があります。次に、シナプトソームを低張溶解および超遠心分離にかけ、シナプス小胞、シナプス細胞質ゾル、およびシナプス原形質膜に富むシナプスサブコンパートメントを取得します。画分の純度は、サブシナプスコンパートメントに特異的なタンパク質の電子顕微鏡および生化学的濃縮分析によって確認されます。提示された方法は、シナプスの構造的および機能的特徴ならびに様々な脳障害の分子病因を研究するための簡単で貴重なツールである。

提示された方法は、さらなる精製および様々な形態の下流分析に供することができる11の脳内細胞画分をもたらす35、36。シナプトソーム、SV23、およびその他の成分の品質を評価するためのゴールドスタンダードの方法は、電子顕微鏡(EM)です(図7)。特定の細胞内画分に存在するタンパク質の定量的イムノブロッティングも、画分純度のマーカーを評価するために実施できます(図8)。例えば、画分のイムノブロット分析では、シナプス原形質膜画分(SPM)中のN-カドヘリン(CDH2、UniProt名)、シナプス細胞質ゾル(LS2)中のα-シヌクレイン(SYUA)、シナプス小胞画分(LP2)中のシナプトフィジン(SYPH)、およびミエリン画分(MF)中のミエリン塩基性タンパク質(MBP)の富化が、初期の全脳ホモジネート(Total)のタンパク質レベルと比較すると明らかになりました(図8).画分の純度が確立されたら(例えば、LS2画分にCDH2が存在しないこと、またはLP2画分にSYPHが何倍にも増加することに注目)、定量的イムノブロッティングを使用して、目的のタンパク質の局在を決定したり、遺伝子型または処理間のタンパク質分布の違いを調べたりすることができます。シナプスタンパク質の細胞内局在を理解することで、これまで記載されていなかったタンパク質機能の解剖が可能になります。さらに、この方法は、特に機能アッセイと組み合わせた場合に、疾患状態における人身売買欠陥またはシナプス機能障害を解明し得る。たとえば、私たちのチームはこの方法を使用して、シナプス細胞質ゾル19に富む酵素的に活性なパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ1のプールを特定しました。
<img alt="細胞の超微細構造分析;細胞小器官電子顕微鏡写真、細胞生物学研究、構造研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 図7:シナプトソームの電子顕微鏡(EM )。 (A)シナプス小胞を含むシナプトソームの代表的なEM像(矢印)。(B)シナプス前(矢印)とシナプス後の両方を含むシナプトソームの代表的なEM画像(二重矢印)。(C)シナプス小胞とミトコンドリアを含むシナプトソームの代表的なEM像(矢印)(スケールバー=100nm)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="タンパク質の分別;CDH2、MBP分析;ゲルブロットと棒グラフ。マーカーの濃縮;データ比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 図8:細胞内画分のイムノブロット分析。 (A)細胞内画分純度のマーカー(UniProt命名法で示される)は、全脳ホモジネート(総量)と比較して適切に局在している:シナプス原形質膜画分(SPM)中のN-カドヘリン(CDH2)、シナプス小胞濃縮画分(LP2)中のシナプトフィジン1(SYPH)およびシナプトジャニン1(SYNJ1)、シナプス細胞質ゾル(LS2)中のα-シヌクレイン(SYUA)、 ミエリン画分(MF)中のミエリン塩基性タンパク質(MBP)。(B)イムノブロット定量分析により、画分純度マーカーの濃縮(合計からの倍率変化)が明らかになります。データは、log10スケールの平均値±標準偏差として表されます。点線は1.5倍の変化(y = 0.176)を示す(n = 8匹の野生型マウスを用いた3回の反復実験;齢= 2ヶ月;SYPH、SYUA、MBPについてはn = 4-5ブロット、n = 3プロット値はGorenbergらによって以前に発表された19;n = 5はSYNJ1;n = 1はCDH2)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、マウスの脳から高純度のシナプトソーム、シナプス小胞、およびその他のシナプス画分を取得するための堅牢で詳細な方法を提供します。この方法は、タンパク質の局在と機能の生化学的分析を含むシナプスプロセスのコンパートメント分解能での評価を可能にします。

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

シナプスは脳の基本的な計算単位です。提示された方法は、シナプスとその分子プロセスを研究し、さまざまな脳障害でそれらがどのように変化するかを理解するためのシンプルで貴重なツールです。この技術は、脳から単離されたシナプトソーム構造の分画を含む。これにより、研究者はシナプスで区画化される可能性のある効果を捉えることができます。特定のタンパク質の分布レベルと活性もシナプス下分解能で分析できます。この手順は、すべてが順調に進んだ場合、個々の研究者が完了するのに約11時間かかります。このテクニックを実行したことがない人は、手順に慣れていない人にとっては自然に少し時間がかかるため、この手順の長さに苦労する可能性があります。この実験日は長いため、サンプルが必要以上に氷上にセットされないように、迅速な組織収集を容易にするのに役立つパートナーと一緒に解剖を行うことを強くお勧めします。また、この実験を実行する前日にバッファーとベンチトップ材料を準備して、必要なときにすべてが簡単に手の届くところにあるようにすることをお勧めします。これは特に収集チューブに当てはまります。合計11の細胞内画分の複数のアリコートが、この手順の終わりまでに収集されます。したがって、これらのチューブに事前に明確にラベルを付けておくと、一日がはるかに簡単になります。まず、断頭切開部で皮膚の下に細かいハサミを頭蓋周囲の深さまで挿入し、鼻腔内縫合糸まで矢状中切開を行い、頭皮を頭蓋骨から引っ込めます。後頭部から各側頭側面に向かって作業し、筋膜と筋肉をトリミングして、各外部聴道を超えて頭蓋骨の外面を露出させます。利き手ではない手で頭蓋骨の頭皮と吻側の側面を固定し、もう一方の手で、脊髄が出ているのが見える大孔の尾側に2ミリメートルの細かいはさみを挿入します。はさみが頭頂内骨の内面に到達するまで正中線を切開します。はさみの角度を変更して、ブレードが頭蓋骨の背側表面と平行になるようにします。矢状縫合糸と前頭間縫合糸をガイドとして使用して、頭頂骨と前頭骨を通して中矢状切開を吻側に進め続け、鼻間縫合糸のすぐ向こうで切開を終了します。次に、鼻上顎前縫合糸に各刃を配置して頭蓋骨に垂直にハサミを配置し、1つを均等に切断することにより、鼻骨に垂直に3ミリメートル、鼻間縫合糸に対して吻側を切開します。吻側を固定しながら、テクスチャー加工された鉗子の片側を使用して、頭蓋骨を脳からそっと持ち上げてから、横方向と腹側に持ち上げます。必要に応じて正中線に沿って繰り返し、次に脳表面全体が露出するまでもう一方の半球についても繰り返します。湾曲した鉗子または細かいへらを使用して、脳の吻側をそっと持ち上げます。視神経と脳神経を切断して、頭蓋骨からの切除を完了します。500rpmで12回のアップダウンパスで氷浴上に置かれたガラスダウンホモジナイザーを使用して脳を均質化する。各ダウンストロークで短時間一時停止して、組織の完全な均質化を確実にします。全脳ホモジネートを14ミリリットルの高速丸底遠心管に移し、摂氏4度で800Gで10分間回転させて、S1と呼ばれる上清を得ます。ビシンコニン酸アッセイ用にS1の5マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にS1の100マイクロリットルアリコートを2つ取ります。S1を摂氏4度で9,000Gで15分間スピンして、シナプスソーム上清またはS2、および粗シナプトソームペレットまたはP2を得た。ビシンコニン酸アッセイ用にS2の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にS2の500マイクロリットルアリコートを2つ取ります。アリコートを得た後、上清を捨てる。摂氏4度で15分間9, 000Gで遠心分離した後、上清S2 ́を得てシナプトソームを洗浄し、P2'上清を廃棄し、P2'を3ミリリットルのバッファーに再懸濁しますA.主にミトコンドリアを含むペレットの底にある暗赤色部分を再懸濁することは避けてください。ビシンコニン酸アッセイ用に20マイクロリットルのP2'を2つ、ウェスタンブロットにP2'の100マイクロリットルアリコートを2つ取ります。洗浄したシナプトソームの低張溶解のために、9容量のチルドバッファーBを加えてP2'を再懸濁し、グラスダウンホモジナイザーでシナプトソームをホモジナイズします。サンプルを50ミリリットルのキャップ付きコニカル遠心分離機チューブに移し、摂氏4度の冷蔵室でチューブリボルバー上で15分間回転させます。溶解したP2'を摂氏4度で25, 000Gで20分間遠心分離し、溶解上清またはLS1、およびシナプトソーム膜またはLP1を含む溶解ペレットを得る。ビシンコニン酸アッセイ用にLS1の50マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にLS1の400マイクロリットルアリコートを2つ取ります。LS1をキャップ付き遠沈管に移し、超遠心分離を行います。LS1を固定角超遠心ローターで100, 000 G、摂氏4度で60分間遠心分離し、シナプス細胞質ゾル上清(LS2)とシナプス小胞ペレット(LP2)を得ます。LP2を500マイクロリットルのバッファーAに再懸濁し、23ゲージの針と1ミリリットルのシリンジを使用してLP2を穏やかな粉砕で行います。ビシンコニン酸アッセイ用にLP2の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にLP2の250マイクロリットルアリコートを2つ取ります。約30ミリリットルのLS2を10ミリダルトンカットオフの遠心フィルターユニットに移し、摂氏4度で最大1時間5, 000 Gで回転させてLS2を約0.5ミリリットルに濃縮します。ビシンコニンアッセイ用に濃縮LS2の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用に濃縮LS2の250マイクロリットルアリコートを2つ取ります。LP1を1ミリリットルのバッファーBに再懸濁し、ビシンコニン酸アッセイ用にLP1の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にLP1の50マイクロリットルアリコートを2つ取ります。残りのLP1を最終容量7.5ミリリットル、最終スクロース濃度1.1モルに調整し、バッファーBとバッファーCで次に、再懸濁したLP17.5ミリリットルを14ミリリットルの超遠心チューブに移します。LP1を3.75ミリリットルのバッファーDで慎重に覆い、溶液の上部にペンで印を付けます。次に、約1.25ミリリットルのバッファーAをオーバーレイし、同様に溶液の上部にペンで印を付けます。超遠心分離用のチューブを容量ではなく重量でバランスを取り、バッファーAを10ミリグラム以内に滴下します。スイングバケット超遠心機ローターで摂氏 4 度で 2.5 時間、48 、 000 G で遠心分離し、無傷の勾配の画像を取得して、各スクロース界面の明瞭さと分画の成功を文書化します。320ミリモルスクロースの表面層を注意深く除去し、800マイクロリットルの容量で320ミリモル、855ミリモルスクロース界面のミエリン画分を回収します。チューブの壁から円形にピペットで持ち上げて、完全な画分を確実に収集します。次に、1000マイクロリットルの容量で855ミリモル、1.1ミリモルのスクロース界面でSPM画分を回収します。残りのスクロースを注意深く吸引し、200マイクロリットルのバッファーBに再懸濁してミトコンドリアペレットを回収し、SPM画分を2倍量のバッファーBで希釈し、3.5ミリリットルの遠心チューブ内の固定角度ローターで遠心分離します。上清を廃棄し、SPMペレットをバッファーAに再懸濁して、最終容量250マイクロリットルにします。ビシンコニン酸アッセイ用にSPMを2、5マイクロリットルのアリコートに取り、残りのSPMをウェスタンブロット用に半分に分割します。シナプトソームの電子顕微鏡像をこの図に示します。シナプス前後のシナプス小胞とミトコンドリアのシナプス小胞を含むシナプトソームをここに示します。細胞内画分のイムノブロット分析は、画分純度のマーカーを評価するために行った。初期の全脳ホモジネートと比較すると、シナプス原形質膜画分にn-カドヘリン、シナプス細胞質ゾルにαシヌクレイン、シナプス小胞画分にシナプトフィジン、ミエリン画分にミエリン塩基性タンパク質が濃縮されていることが明らかになりました。画分の純度が確立されたら、定量的イムノブロッティングを使用して、目的のタンパク質の局在を決定したり、遺伝子型や治療間のタンパク質分布の違いを調べたりすることができます。この手順を試みるときは、無傷のシナプトソームを収集できるように、必ず洗剤を含まないガラス製品を使用してください。また、スクロース勾配を準備する際には、明確な界面が得られるように注意してください。これにより、シナプス原形質膜画分を正常に分離することができます。電子顕微鏡、イムノブロッティング、プロテオミクス、その他の分子法などのシナプス画分の品質を支援するために、さまざまな構造および機能解析を実行できます。シナプトソームの代謝生存率を補助するために、神経伝達物質の放出または酵素アッセイも実施することができる。シナプトソーム構造の単離は、シナプスの機能と組成を分析するためのパラダイムシフト技術でした。神経変性における初期のシナプス機能障害が見られるように、シナプスレベルでの分子変化の注意深い解剖は、これらの障害の分子メカニズムの探求に役立ちます。

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Neuroscience

神経科学

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不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

シナプスの可塑性と記憶を制御する分子と経路の同定は、神経科学における依然として大きな課題です。ここでは、聴覚学習パラダイムにおける学習および記憶の固定化中にシナプスの分子再編成に関与すると思われるシナプスタンパク質の相対定量化に対処するワークフローについて説明します。...

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。...

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病に対する電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS はグローバル、シナプス形成、シナプス可塑性につながる海馬の活動を刺激します。ここでは、ラットの ECS 誘導、シナプス蛋白質のてんかん発作による変化を調べることになったの細胞レベル下の分別の方法について述べる.

電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。...

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

この神経細胞解離プロトコルは、出発物質の量が少ないサンプルを対象としており、オプションの固定および染色ステップで、下流分析用の生存率の高い単一細胞懸濁液を生成します。...

マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

学ぶマウス脳からのシナプス成分単離法。シナプトソームとシナプス小胞を高純度に分画し、タンパク質の局在と機能をコンパートメントレベルで解析できます。神経変性疾患の分子メカニズム解明に有用です。

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

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