ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

このプロトコルは、細胞変性効果に頼ることなくジカウイルスの同定と定量を可能にします。ウイルス成分の抗体認識に依存します。ウイルス特異的抗体の使用は、混合集団における異なるウイルス血清型の同定に役立ちます。

この方法は、従来のプラーク形成アッセイよりも優れています。高速な細胞カウントのための自動イメージングシステムで適用すると、より高速でハイスループットなアプリケーションが可能になります。提案されたプロトコルは適応性が高い。

適切な修飾により、提案されたプロトコルは、様々な細胞タイプおよびウイルス標的に適用することができる。まず、10%FBSと2ミリモルのL-グルタミンを添加した12ミリリットルのDMEMを含む75平方=センチメートルの細胞培養フラスコでVero細胞を増殖させます。フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞培養インキュベーターに入れます。

細胞単層に感染させるには、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、細胞培養フラスコから増殖培地を取り出します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、フラスコを3ミリリットルのDPBSで2回すすぎます。次に、2ミリリットルの無血清DMEMと20マイクロリットルのジカウイルス接種物を細胞培養フラスコに入れます。

フラスコを室温で1時間インキュベートし、穏やかに揺らしてウイルスの吸着を促進します。インキュベーションの最後に、5ミリリットルの血清ピペットを使用して、希釈したウイルス接種物を細胞培養フラスコから慎重に取り出し、廃棄します。細胞培養フラスコを3ミリリットルのDPBSで2回すすぎます。

次に、12ミリリットルの維持培地を細胞培養フラスコに添加して、感染細胞を維持します。感染したVero細胞を、摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞培養インキュベーターで3日間インキュベートします。3日間のインキュベーション後、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、ジカウイルスを含む細胞培養上清を50ミリリットルの遠心チューブに回収します。

ウイルスの定量には、Vero細胞を指定されたプレートに播種し、5%の二酸化炭素雰囲気で摂氏37度で一晩増殖させます。各プレートに 6 本の滅菌済み 1.5 mm 微量遠心チューブを調製し、ネガティブコントロール用の追加のチューブを含めて 10 倍連続希釈を行います。24ウェルプレートのセットアップでは、6本の微量遠心チューブすべてに450マイクロリットルの無血清DMEMを添加します。

96ウェルプレートのセットアップでは、135マイクロリットルの無血清DMEMを追加6本のチューブに分注します。24ウェルプレート実験で段階希釈を行うには、450マイクロリットルの無血清DMEMが入った10〜マイナス1本のチューブに50マイクロリットルのジカウイルスストックを加えます。96ウェルプレート実験では、135マイクロリットルの無血清DMEMを含む10〜マイナス1本のチューブに15マイクロリットルのジカウイルスストックを加えます。

各チューブをボルテックスしてウイルスと培地を完全に混合し、希釈液内のウイルス粒子が均一に分布するようにします。新しいピペットチップを使用して、10〜マイナス1本のチューブを再懸濁し、24ウェルプレートと96ウェルプレートの2回目の10倍希釈液として、50マイクロリットルと15マイクロリットルの希釈したジカウイルスを10〜マイナス2本のチューブに移します。適切なプレートの各ウェルのコンディション培地を取り外して廃棄します。

各ウェルをDPBSで2回すすぎ、残留物を取り除きます。最も希釈率の高いものから始めて、段階的に希釈したウイルス接種物をウェルに追加し、最も低い希釈率を目指します。1時間のインキュベーション後、ウイルス懸濁液をウェルから取り除き、低濃度から最高濃度まで廃棄します。

感染した細胞をDPBSで2回洗浄し、ウイルス懸濁液の痕跡を取り除きます。ウェルをDMEMと1.5%低粘度のカルボキシメチルセルロースでオーバーレイします。プレートを細胞培養インキュベーターで摂氏37度、5%の二酸化炭素でインキュベートします。

インキュベーション後、オーバーレイ培地を取り出して廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄します。96ウェルプレートの場合、マルチチャンネルピペットを使用してオーバーレイ培地を除去して廃棄し、ウェルあたり60マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。4%パラホルムアルデヒドを添加して細胞を固定し、プレートを室温で20分間インキュベートします。

20分後、パラホルムアルデヒドを廃棄し、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、3,3'ジアミノベンジジンペルオキシダーゼ基質を添加し、プレートを暗所で30分間インキュベートします。30分後、ウェルを水で洗浄して反応を停止します。

プレートを一晩風乾し、病巣計数に進みます。選択した希釈液の繰り返しごとに焦点をカウントし、それぞれの平均焦点数を計算します。感染したVero細胞は、感染後のさまざまな時点で固定されました。

2ウェルプレートでは、感染後48時間でウイルス病巣が最初に出現したが、病巣のサイズが小さすぎて正確に数えられなかった。感染後96時間後、細胞剥離の兆候はありませんでした。感染後60時間で、病巣のサイズはカウントに最適なレベルまで増加していました。

その後、時間が経つにつれて、病巣は大きくなり、強度が互いに融合または重なり始め、時間の経過とともに成長するクラスターを形成しました。したがって、感染から60時間後に形成された病巣を選択して、24ウェルプレートでジカウイルス力価を測定しました。96ウェルプレートの場合、細胞は感染後72時間後も無傷のままでした。

ウイルス病巣の出現は、感染後24時間で初めて観察されました。しかし、感染後36時間までは、病巣のサイズが小さすぎました。最適な病巣サイズは、感染後48時間で達成されました。

後者の時点では、重なり合った焦点または合流した焦点が観察され、重なり合った焦点の数は時間の経過とともに増加しました。感染から48時間後に形成された病巣は、ジカウイルス分離株のウイルス力価を決定するために選択されました。各ウェルの側面にDPBSを静かに添加し、プレートを前後に1〜3回揺らして、細胞の破片や余分な培地を取り除きます。

この手法は、ジカ熱研究の研究者に大きな利益をもたらすだけでなく、他の臨床的に重要なウイルスの定量化にも広く適用できるため、ウイルスの監視と診断のための貴重なツールになります。