Name: S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇を用いたS. cerevisiaeの減数分裂研究法。特定タンパク質の一時的な機能を明らかにし、染色体分配メカニズムを解明する。

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インディアナ大学の光学顕微鏡イメージングセンターに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(GM105755)からの助成金によってサポートされました。

<ol><li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC%2FC+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li>
<li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).</li>
<li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+entry+into+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDT80%2C+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li>
<li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19%28CCAN%29+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li>
<li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+kinetochore+protein%2C+Ctf19+in+meiosis+I%3A+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li>
<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
<li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor%2C+Csm3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).</li>
<li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipl1%2FAurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li>
<li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).</li>
<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

このプロトコルは、細胞を同期させるNDT80-inシステム、核からタンパク質を枯渇させるアンカーアウェイ技術、および減数分裂中の出芽酵母細胞を画像化する蛍光タイムラプス顕微鏡を組み合わせたものです。NDT80-inシステムは、前期Iの停止と放出を利用する減数分裂細胞周期同期のための方法です4,8。個々の細胞は、その後の減数分裂の各段階で費やされる時間量がわずかに異なりますが、ほとんどの細胞は減数分裂全体を通して高度な同期を維持します。
アンカーアウェイ技術は、有糸分裂および減数分裂研究に適応可能なツールです。ラパマイシン添加のアンカーアウェイ標的タンパク質および時間を変更することにより、この方法は、出芽酵母減数分裂の任意の段階における様々なタンパク質を研究するように適合させることができる。出芽酵母有糸分裂を研究するために条件付き変異体を作製するための一般的な方法は、減数分裂研究に必ずしも適していない。例えば、抑制可能なプロモーター...

タイムラプス蛍光顕微鏡は、出芽酵母における減数分裂染色体分配のダイナミクスを研究するための貴重なツールです1,2。出芽酵母細胞は、重要な栄養素の飢餓を通じて減数分裂を起こすように誘導することができます3。減数分裂の間、細胞は1ラウンドの染色体分配を受け、続いて2つの分裂を経て、胞子にパッケージ化された4つの減数分裂産物を作成します(図1)。個々の細胞は減数分裂の各段階で視覚化でき、固定細胞イメージングでは簡単に見逃すことができる空間的および時間的データを生成します。このプロトコルは、タイムラプス蛍光顕微鏡法と、以前に確立された2つの方法、誘導性NDT80システム(NDT80-in)およびアンカーアウェイ技術を組み合わせて、異なる減数分裂段階における特定のタンパク質の機能を研究する方法を示しています。
NDT80-inシステムは、中減数分裂転写因子NDT80 4,5の誘導発現に依存する減数分裂細胞周期同期のための強力なツールです。NDT80発現は、前期I出口6,7に必要である。NDT80-inシステムでは、NDT80は、エストロゲン受容体(Gal4-ER)に融合したGal4転写因子を発現する細胞において、GAL1-10プロモーターの制御下にあります4,5。Gal4-ERはβ-エストラジオールに結合した場合にのみ核に入るため、NDT80-in細胞はβ-エストラジオールの非存在下で前期Iで停止し、前期Iの細胞の同期を可能にします(図1)。β-エストラジオールの付加は、Gal4-ER転写因子の核への転座を促進し、そこでGAL1-10に結合してNDT80の発現を促進し、減数分裂への同期的な侵入をもたらします。タイムラプス顕微鏡は同期なしで実行できますが、同期を使用する利点は、細胞が減数分裂の特定の段階にある間に阻害剤または薬物を追加できることです。
アンカーアウェイ技術は、ラパマイシン8を添加することでタンパク質を核から枯渇させることができる誘導可能なシステムである。この技術は、酵母細胞が核膜が破壊されない閉鎖有糸分裂および減数分裂を経験するため、出芽酵母の細胞分裂中の核タンパク質の研究に理想的です。さらに、この技術は、減数分裂全体を通して複数の機能を有するタンパク質にとって非常に有用である。欠失、変異対立遺伝子、減数分裂ヌル対立遺伝子とは異なり、特定の段階で核から標的タンパク質を除去しても、初期段階での標的タンパク質活性が損なわれないため、結果をより正確に解釈できます。アンカーアウェイシステムは、リボソームの成熟時に発生する核と細胞質の間のリボソームサブユニットの往復を利用します8。核から標的タンパク質を枯渇させるために、リボソームサブユニットRpl13AがFKBP12でタグ付けされている株において、標的タンパク質はFKBP12-ラパマイシン結合ドメイン(FRB)でタグ付けされる。ラパマイシンがなければ、FRBとFKBP12は相互作用せず、FRBタグ付きタンパク質は核内に残る。ラパマイシンを加えると、ラパマイシンはFKBP12およびFRBと安定な複合体を形成し、複合体はRpl13Aとの相互作用により核からシャトルされます(図1)。ラパマイシン添加時の細胞死を防ぐために、細胞はTOR1遺伝子のtor1-1変異を保持している。さらに、これらの細胞には、S. cerevisiae FKBP12タンパク質のヌル対立遺伝子であるfpr1Δが含まれており、内因性Fpr1がFRBとラパマイシンの結合に関してRpl13A-FKBP12を凌駕するのを防ぎます。アンカーアウェイバックグラウンド変異であるtor1-1およびfpr1Δは、減数分裂のタイミングや染色体分配に影響を与えません2。
この技術の有用性を実証するために、動原体タンパク質Ctf19は減数分裂を通して異なる時点で枯渇した。Ctf19は、有糸分裂には欠かせませんが、減数分裂における適切な染色体分配に必要な動原体の成分です9、10、11、12、13。減数分裂では、動原体は前期Iで脱落し、Ctf19は動原体再組み立てに重要です9,14。このプロトコルでは、NDT80-inシステムと細胞を同期させ、アンカーアウェイ技術を使用して、前期Iからの放出の前後で、および減数分裂後のI染色体分配後に標的タンパク質Ctf19を核から枯渇させました(図1)。このプロトコルは、減数分裂および有糸分裂の任意の段階で目的の他のタンパク質を枯渇させるように適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Millipore Σ</td><td>E8875</td><td>95% EtOH</td></tr><tr><td>0.22 uM Threaded Bottle-top Filter Millipore</td><td>Sigma</td><td>S2GPT02REΣ 100</td><td></td></tr><tr><td>% EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td> ConA 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 VWR<td>の溶剤として使用するために1:10を希釈</td></tr><tr><td></td><td>します。北米</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 75 mm 顕微鏡スライド</td><td>VWR 北米</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>アデニン半硫酸塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9126</td><td>SC、SCA、および1% Kac</td></tr><tr><td>Bacto 寒天培</td>地 <td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>コンカナビアリン A</td><td>ムリポア シグマ</td><td>C2010</td> 1X PBS CoolSNAP HQ2 CCD <td>カメラで 1mg/mL として製造</td></tr><tr><td></td><td></td><td>セクション4.3</td>で使用される<td>測光</td></tr><tr><td>D-グル</td><td>コース フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>ディフコ酵母 窒素塩基 アミノ酸なし</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>エクリプス Ti2 倒立対物レンズ マイクロスコープ</td><td>ニコン</td><td></td><td>セクション4.4で使用</td></tr><tr><td>フィジー</td><td>NIH</td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GEパーソナルデルタビジョン顕微鏡</td>からダウンロード セクション<td>4.3</td>で使用される<td>応用精度</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T0254</td><td>SC、SCA、および1%Kac</td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td><td>クレヨラ</td>を補完する<td>&nbsp;2302880000</td><td>スライドホルダーにカバースリップを固定するには</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 イメージングソフトウェア</td> ニ<td>コン</td><td></td><td>セクション4.4で使用</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BTカメラ</td><td>浜松</td><td>C15440-20UP</td><td>セクション4で使用</td></tr><tr><td>プラスチックピペットチップホルダー</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>LTS1000-HR</td><td>本製品のラック部分の4角×4角を切り取ります。&nbsp;</td></tr><tr><td>Pottassium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP29631</td> DMSO シリコーン シーラント Aqueon 100165001 水族館の接着剤としても知られている <td>1mg/mL のストックを作成します</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>。</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp;セクション</td><td>4.3で使用された</td><td>精密</td><td></td>を適用したイメージングソフトウェア</tr><tr><td>合成完全混合物(カイザー)&nbsp;</td><td>フォーミディアム</td><td>DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>タイプN浸漬油&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

s. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

タイムラプス蛍光顕微鏡は、固定細胞のイメージングでは見られない時間的および空間的データを提供することにより、減数分裂細胞周期イベントの理解に革命をもたらしました。出芽酵母は、多くの減数分裂遺伝子が高度に保存されているため、減数分裂染色体分配を研究するための重要なモデル生物であることが証明されています。出芽酵母の減数分裂のタイムラプス顕微鏡検査により、さまざまな減数分裂変異体をモニタリングして、突然変異が減数分裂プロセスをどのように破壊するかを示すことができます。しかし、多くのタンパク質は減数分裂の複数の点で機能します。したがって、機能喪失または減数分裂ヌル変異体の使用は、初期のプロセスを混乱させ、後のプロセスをブロックまたは妨害し、個々の役割に関連する表現型を決定することを困難にする可能性があります。この課題を回避するために、このプロトコルでは、タイムラプス顕微鏡を使用して減数分裂イベントを監視しながら、減数分裂の特定の段階でタンパク質を核から条件付きで枯渇させる方法について説明します。具体的には、このプロトコルでは、細胞が前期Iでどのように同期されるか、アンカーアウェイ技術を使用して特定の減数分裂段階で核からタンパク質を枯渇させる方法、およびタイムラプスイメージングを使用して減数分裂染色体分配を監視する方法について説明します。この技術の有用性の例として、減数分裂中の異なる時点で動原体タンパク質Ctf19が核から枯渇し、減数分裂IIの終わりにクロマチン質量の数が分析されました。全体として、このプロトコルは、減数分裂を監視しながら、核から異なる核タンパク質を枯渇させるように適合させることができる。

クロマチン分離をモニターするために、ヒストンタンパク質Htb2をmCherryでタグ付けした。前期Iでは、クロマチンは単一のHtb2塊として現れる。相同染色体が最初の減数分裂で分離した後、クロマチンは2つの異なる塊として現れます(図3A)。姉妹染色分体が分離した後、クロマチンは4つの塊として現れる。一部の染色体が紡錘体微小管に付着しない場合、減数分裂Iまたは減数分裂IIの後に追加の腫瘤が見られます。
上記の方法は、出芽酵母減数分裂における適切な染色体分配を確実にする上での動原体成分Ctf19の役割を研究するために使用された。FRBでタグ付けされたCtf19を発現するアンカーアウェイ酵母株を、NDT80-inシステム(tor1-1;fpr1Δ;RPL13A-FKBP12;CTF19-FRB;GAL1-10はNDT80をプロモートしました。GAL4-ER)。対照として、アンカーアウェイ株をバックグラウンドでFRBタグ付きタンパク質を含まないNDT8...

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

前期1の細胞を同期させ、特定の段階で標的タンパク質を枯渇させることで、特定のタンパク質の一時的に異なる機能を特定することができます。筋症の特定の段階で条件付きでタンパク質を枯渇させることは、伝統的な筋変異体が後の段階で持つ可能性のある残留効果を防ぎます。この方法は、出芽酵母有糸分裂および核膜破壊を受けない他の生物を研究するために使用することができる。さらに、この方法は、核膜破壊前の細胞周期事象を研究するために他の生物で使用することができる。はじめに、イメージング用の細胞の単層を作成するために使用される寒天パッドを作成します。1.5ミリリットルの微小遠心管のキャップと底部の3分の1を切り取って廃棄し、寒天パッドの型となるシリンダーを作成します。カットしたマイクロ遠心チューブシリンダーを、チューブの上部を逆さまにしてスライドの上に座って、きれいなガラススライドに置きます。50ミリリットルのビーカーに6ミリリットルの5%寒天溶液を作ります。ピペットの先端を切り取って開口部を大きくし、約500マイクロリットルの溶かした寒天をマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。寒天が固まるまで室温で放置します。酵母細胞を調製するには、200マイクロリットルの胞子形成培養物を800 Gで1ミリリットルの微量遠心チューブで2分間スピンダウンします。180マイクロリットルの上清を捨てる。チューブを旋回させてフリックすることにより、残りの上清にペレットを再懸濁します。濃縮された細胞6マイクロリットルをConAでその場でチャンバーの中央にあるカバースリップにピペットで入れます。シリンダーを寒天パッドで持ち、スライドガラスから慎重にスライドさせます。寒天の底部が完全に平らであることを確認し、ピペットチップの底部を使用して、寒天パッドがチューブの境界よりわずかに上に押し出されるように、マイクロ遠心機型にわずかな圧力を加えます。次に、寒天パッドがチャンバーに向かって下を向くように金型を反転させます。鉗子を使用して寒天パッドを細胞の上にそっと置き、ピペットチップを使用して寒天パッドをチャンバーの周りに10〜20回静かにスライドさせて、カバースリップ上に細胞の単層を作成します。寒天パッドをチャンバー内に12〜15分間保持します。次に、2ミリリットルの胞子形成培養物を2つの微量遠心チューブに移し、15, 700 Gで2分間回転させます。上清をきれいな微量遠心チューブに移した後、同じ条件で再度回転させ、上清を回収して微量遠心チューブを洗浄します。2ミリリットルの上清を寒天パッドを含むチャンバーに滴下する。液体がチャンバーの上部に到達すると、寒天パッドはおそらく浮遊します。寒天パッドを鉗子でそっと取り外し、廃棄します。イメージング中の蒸発を防ぐために、チャンバーの上部に24 x 50ミリメートルのカバースリップを置きます。顕微鏡で動画を設定するには、スライドホルダー内にカバースリップをはめ込みます。成形粘土をカバースリップの側面に接着して、スライドホルダーにしっかりと固定します。画像取得ソフトウェアを開きます。粗い調整ノブと微調整ノブを使用して、DICまたは明視野を使用してセルに焦点を合わせます。画像取得ソフトウェアのメインメニューで、[ファイル]をクリックし、[取得]を選択すると、4つのウィンドウがポップアップ表示されます。[3Dを解決]という名前のウィンドウで、三角フラスコアイコンをクリックします。これにより、[実験の実行] というタイトルのウィンドウが開き、タイムラプス ムービーを設定するための実験を設定するためのコントロールが含まれています。[デザイン]タブで、[セクショニング]というラベルの付いたタブに移動します。Z断面の横のボックスを選択し、光学セクションの間隔を1マイクロメートルに、光学セクションの数を5に設定します。次に、[チャネル]タブでプラスアイコンをクリックして、適切なチャネルを選択します。次に、[参照画像] の横にあるボックスを選択し、ドロップダウン メニューから Z 位置をサンプルの中央に設定します。ドロップダウンメニューから透過率と露光時間の値を選択します。[タイムラプス]タブで、[タイムラプス]の横にあるボックスを選択し、分と時間の値を入力して、画像取得の時間間隔を指定します。「究極のフォーカスでフォーカスを維持」の横にあるボックスを選択して、ムービー中のステージドリフトを防ぎます。[ポイント]タブで、[ポイントリストを訪問]の横にあるボックスを選択します。メインメニューで、[表示]をクリックし、[ポイントリスト]を選択します。細胞の単層を示すチャンバーの領域にステージを移動します。[ポイント リスト]ウィンドウで[ポイントをマーク]をクリックします。ステージを移動して、重なり合うことなく 25 から 30 のポイントを選択し、セルの露出オーバーを防ぎ、各タイム コース中に各フィールドを画像化します。[ポイント リスト]ウィンドウで、[すべてキャリブレーション]を選択して、各ポイントの最終的なフォーカスを設定します。[ファイル名を指定して実行] タブで、コンピューター上の適切な保存先にファイルを保存します。[実験の実行] ウィンドウで、[再生] ボタンを選択してムービーを開始します。フィジーソフトウェアを開きます。DIC チャンネルと mCherry チャンネルを開きます。[画像]、[スタック]、および[Z Project]の順にクリックして、mCherryチャネルの単一の最大強度投影を取得し、ドロップダウンメニューから[最大強度]を選択します。DICチャンネルとmCherryチャンネルを1つの画像にマージするには、[画像]、[カラー]をクリックし、[チャンネルのマージ]を選択します。減数分裂を通して単一の細胞をたどります。減数分裂IIの完了後、DNA質量の数を記録します。アンカーアウェイの背景を持つ野生型細胞では、減数分裂IIの終わりに通常4つのDNA塊があり、減数分裂の4つの産物を表しています。減数分裂II期にCtf19-FRBが固定されている場合、減数分裂の完了時に約47%の細胞が4つ以上のDNA塊を示し、動原体と微小管の付着に欠陥があることが示唆されています。Ctf19-FRBを固定すると、動原体集合後、減数分裂Iの前、または減数分裂IIの後に、約16%の細胞が追加のDNA量を示します。このプロトコルの最も重要な部分の1つは、単層が破壊されないように、上清をチャンバーに滴下することです。さらに、イメージングの準備に必要な時間をメモして、分析で考慮します。蛍光パックされたタンパク質を変更することにより、この手順を使用して、細胞周期の持続時間、染色体分配、タンパク質の存在量、およびタンパク質の局在に関する質問に答えることができます。

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