出芽酵母における一倍体の交配効率の決定
December 2nd, 2022
この研究では、酵母 サッカロマイセス・セレビシエ の交配効率を定量化するための堅牢な方法が説明されています。この方法は、スペシエーション研究における前接合体障壁の定量化に特に有用です。
このプロトコルは、酵母の異なる株や種が互いに交配する効率を定量化する簡単な方法です。提案手法は,簡便,堅牢,効率的である.この方法は、酵母の任意の株に拡張することができる。
この研究に記載されている方法は、酵母で種分化がどのように起こるかを理解するために使用できます。さらに、我々が記載する菌株は、遺伝子流動を用いた実験を設計するのに特に有用であり得る。この方法の強みは、それが本当に単純であるということです。
使用する特定の菌株によっては、インキュベーション時間などのわずかな調整が必要になる場合があります。酵母エキスペプトンデキストロースまたはYPD寒天プレートに酵母接種材料をストリーキングすることにより、冷凍ストックから一倍体Aとアルファを復活させ始めます。単一のコロニーを得るために、摂氏30度で48時間成長させます。
インキュベーション後、YPDプレートと5ミリリットルのYPD培地から単一コロニーを接種し、摂氏30度で250RPMを振とうしながら48時間インキュベートします。細胞はこの潜伏期間の後、成長の定常期にある。新しいYPDプレートに、嵌合効率グリッドを1 x 1.5センチメートルの長方形として描き、それぞれ1 x 0.5センチメートルの寸法の3つのボックスに分割します。
左端と右端の長方形に2つの交配タイプのYPD培養液5マイクロリットルを接種します。この体積は、各切片における10〜5番目の一倍体細胞のおよそ5倍に相当する。プレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。
同数の酵母細胞を混合するには、滅菌つまようじを使用して外箱に発生した酵母増殖の約1/3を取り除き、除去した細胞を滅菌1.5ミリリットルのバイアル内の20マイクロリットルの水に再懸濁します。各一倍体についてこれに従ってください。次に、この懸濁液5マイクロリットルを2ミリリットルの水で希釈し、分光光度計を用いて600ナノメートルの光学密度を測定する。
光学密度値および1光学密度でのミリリットル当たりの細胞数に基づいて、両方の一倍体の必要量を新鮮で滅菌済みの1.5ミリリットルバイアルに加える。ピペットを使ってよく混ぜます。この懸濁液の最終容量は、一般に約6〜8マイクロリットルです。
次に、この懸濁液を中央のグリッドに接種します。プレートを摂氏30度で7時間インキュベートし、一倍体が交尾できるようにします。7時間のインキュベーション後、つまようじまたはピペットチップを使用して中央の長方形から細胞をこすり落とし、2ミリリットルの滅菌水で希釈します。
さらに希釈を行い、次いで細胞懸濁液をYPD寒天上に広げて、単一コロニーを得る。プレーティング後、YPDプレートを摂氏30度で36〜48時間インキュベートして、単一のコロニーを作成します。データの統計的有意性を確実にするために、スクリーニングのために各交配実験から数百の個々のコロニーが取得されていることを確認してください。
プレート上の二倍体コロニーを特定するには、株が栄養要求性であるアミノ酸を欠いている二重ドロップアウトプレート上に個別にストリーキングすることによって単一コロニーを移します。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートし、嵌合効率nuを計算します。プロトコルの堅牢性により、SK1AMとScAMの2つの系統間の交配効率を簡単に区別することができました。
SK1株は非常に高い効率で交配しましたが、ScAM株は比較的低い効率で交配しました。ScAM株の交配効率は、環境が一次炭素源としてグルコースを含まない場合、大幅に低下し、交配はエネルギー的に高価なプロセスであり、代替炭素源での成長は交配の効率を質的に低下させることを示しています。異なる期間交尾させた場合、最初の4〜5時間は交尾が観察されませんでした。
最初の二倍体は4〜5時間後にのみ出現し、これが与えられた環境で交配プロセスを完了するのに必要な時間であることを示しています。その後、嵌合効率は急速に向上しました。7時間を超えると、交配効率の計算は、有糸分裂の成長がプレート上で始まったという事実に影響されました。
同数両方の一倍体が混在していることを確認してください。これから逸脱すると、プロトコルの独立した繰り返しにばらつきが生じます。遺伝子流動が適応と種分化にどのように影響するかは未解決の問題です。
栄養要求性マーカーは、私たちの株のMAT遺伝子座の隣に挿入されているため、これはこの重要な問題に対処するのに役立ちます。
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概要
この研究は、出芽酵母の様々な株の交配効率を定量化するための堅牢で単純な方法を提示し、種分化研究に関連する接合前障壁に焦点を当てています。
研究の主要な構成要素
研究分野
- 酵母の交配効率
- 種分化研究
- 遺伝子流動実験
背景
- 交配効率は酵母の種分化を理解する上で重要です。
- このプロトコルは、異なる酵母株と条件での実験を可能にします。
- 交配成功率の変動は、進化プロセスへの洞察を提供します。
使用した方法
- 凍結した酵母株の復活とYPD培地での培養
- 制御された培養による単倍体交配効率の定量化
- 細胞濃度を評価するための光密度測定
主要な結果
- SK1AMとScAM株間で交配効率に大きな違いが見られました。
- グルコースの不在下では交配効率が低下し、代謝要求を強調しています。
- 時間依存的な交配効率パターンが文書化され、培養期間の重要性が強調されています。
結論
- このプロトコルは交配効率を測定するのに効果的で、遺伝子流動と適応に関する洞察を提供します。
- この発見は種分化と進化生物学に関する疑問に答えるのに役立つ可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of pre-zygotic reproductive barriers, supporting mechanistic de-risking in genetic and evolutionary studies. This robust protocol provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in yeast-based model systems. Reliable measurement of mating efficiency informs portfolio decisions in strain engineering and gene flow experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of reproductive isolation and gene flow between yeast strains.
- Supports functional validation of genetic modifications impacting mating pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pre-zygotic barriers in model systems.
- Provides reproducible data for hypothesis-driven strain selection and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs for mating efficiency across diverse yeast backgrounds.
- Supports assay reproducibility through controlled mixing, incubation, and colony quantification.
- Enables scalable screening of genetic or environmental variables affecting mating success.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic or phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by quantifying functional reproductive outcomes.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation in yeast models.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for further study.
- Provides predictive confidence for gene flow and adaptation studies relevant to evolutionary biology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling robust hypothesis testing and biological de-risking in yeast genetics workflows.
- Discovery Biology: Quantifies mating efficiency to test genetic or environmental hypotheses about reproductive barriers.
- Screening: Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative comparison of strain performance.
- Analytics: Employs optical density and colony counts for objective, statistical measurement of mating outcomes.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical model validation in yeast-based systems.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, strain-agnostic protocol for repeated use across genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of yeast mating assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in strain engineering pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of strains and experimental conditions for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and sterile technique for accurate execution.
- Needs access to standard microbiology instrumentation, including incubators and spectrophotometers.
- Demands cross-team standardization of incubation times, cell mixing, and colony quantification.
- Adaptable to various yeast strains with minor protocol adjustments for strain-specific growth rates.
- Dependent on auxotrophic marker availability for clear haploid/diploid distinction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Patching of Haploids in the Mating Efficiency Grids
1:55
Mixing of Haploids and Mating
2:55
Plating of Mixed Cells on YPD Agar and Screening for Diploids using Auxotrophic Markers
3:53
Results: Quantification and Dynamics of Mating Efficiency in Saccharomyces cerevisiae (Yeast)
5:03
Conclusion
