新生仔マウスの肩甲間脂肪組織の間質血管画分からの褐色脂肪細胞の分化とイメージング
February 3rd, 2023
新生仔マウスの肩甲間褐色脂肪組織の間質血管分画から前駆脂肪細胞を単離し、脂肪滴を蓄積する細胞に分化し、分子マーカーを発現し、成熟した褐色脂肪細胞のミトコンドリア形態を示します。これらの細胞は、免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡法によってさらに分析されます。
このプロトコルは、主要な脂肪形成転写因子、成熟脂肪細胞マーカーを発現し、成熟褐色脂肪細胞の熱発生可能性と形態学的表現型を有する褐色脂肪細胞の効率的かつ再現性のある分化を可能にします。これは、新生仔マウスの肩甲骨間褐色脂肪組織から成熟褐色脂肪細胞の特徴を持つ細胞を得るための、単純で複製可能な二相分化法です。このプロトコルは、肥満を治療するための標的としての褐色脂肪組織の活性化メカニズムを研究することを可能にします。
これは、脂肪異栄養症の病態生理学に関与するメカニズムを決定するためのモデルとなっています。この手法を初めて行うのは大変な作業です。成功するためには、詳細なプロトコルを用意し、重要なポイントを強調することが不可欠です。
まず、安楽死させたマウスを腹臥位に置き、鋭利なハサミを使用して動物の背中の中央に1センチメートルの長さの皮膚切開を行います。皮膚を慎重に取り除き、小さなハサミを使用して死体からiBATを外科的に取り外します。カーブチッププライヤーを使用して両方のiBATローブを収穫し、ローブを個別に除去します。
2つのローブを、室温で1.5ミリリットルの滅菌PBSを入れたプラスチックチューブに入れます。iBAT組織をコラゲナーゼ2型消化バッファーで摂氏37度、45分間インキュベートし、800 RPMで穏やかに振とうを続けてインキュベートします。コラゲナーゼ2型消化バッファー中の組織懸濁液を機械的に破壊するには、P1000マイクロピペットとフィルターチップを使用してピペッティングします。
サンプルごとに新しいチップを使用します。分離された組織を個々の100マイクロメートルのセルストレーナーに通し、新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。ろ過した組織サンプルに500マイクロリットルのACKバッファーを加えます。
チューブを4〜5回反転させ、室温で4分間インキュベートします。次に、懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーに通し、P1000マイクロピペットとフィルターチップを使用して新しい1.5ミリリットルチューブに入れます。Centrifusionは、テキスト原稿に記載されているようにペレットを再懸濁します。
次に、各ウェルに1ミリリットルの懸濁液を添加することにより、各サンプルを24ウェル培養プレートの6つのウェルに播種します。未分化の前駆脂肪細胞は、ppar-γ、C/ebp-α、ペリリピン1、CD36のレベルが非常に低いか検出不能であった。対照的に、これらのマーカーは分化の7日目に有意に高かった。
褐色前駆脂肪細胞における複数の脂肪滴の蓄積は、以前に発表された結果と一致していました。分化7日目には、ミトコンドリア質量マーカーTOM 20および酸化的リン酸化複合体タンパク質レベルで有意な増加が観察されました。この細胞型の真正なマーカーであるUCP1は、未分化の前駆細胞では検出されませんでしたが、分化の7日目に成熟した褐色脂肪細胞で実質的に発現していました。
ミトコンドリアは、0日目の細長い管状から、7日目の丸みを帯びた、または豆のような形に進化しました。ミトコンドリアの内部構造も脂肪形成によって修飾され、平行に詰まったクリステの密度が高くなりました。重要なことに、ミトコンドリアは分化した褐色脂肪細胞の脂肪滴と密接に関連していたため、高分解能透過型電子顕微鏡でも、ミトコンドリアの外膜と脂肪滴の表面との間の識別可能な距離を検出できませんでした。
肩甲骨間脂肪組織の外科的切除は重要です。組織の非効率的な量は、分化される細胞の利用可能性を制限します。このイメージング技術は、in vitroで分化した褐色脂肪細胞の形態を特徴付けるのに役立ちます。
ミトコンドリア機能、ベータアンドロゲン活性化、およびオートファジー阻害のアッセイを行うことが可能です。
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概要
この研究は、新生子マウスから採取した背肩間褐色脂肪組織を使用して、前脂肪細胞を成熟した褐色脂肪細胞へ分化するための詳細なプロトコルを提供します。分化した細胞は、特徴的な脂質蓄積を示し、主要な脂肪形成マーカーを発現し、熱生成機能を示すミトコンドリアの適応を示します。
主要な研究要素
研究分野
- 脂肪細胞生物学
- 肥満研究
- 熱生成のメカニズム
背景
- エネルギー代謝における褐色脂肪組織の役割の調査
- 肥満および脂肪異栄養症に関連する条件のモデリング
- 脂肪形成を研究するための前脂肪細胞の分化の重要性
使用された方法
- 免疫蛍光および透過電子顕微鏡
- 新生子マウスの背肩間褐色脂肪組織
- ミトコンドリア特性の細胞分化プロトコルとアッセイ
主な結果
- 脂質滴累積によって特徴づけられる前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への成功した分化
- 分化7日目に脂肪形成転写因子および熱生成マーカーの発現増強
- 脂肪形成に関連するミトコンドリア形態変化の特徴づけ
結論
- このプロトコルは、褐色脂肪細胞の分化と機能の再現可能な研究を可能にします。
- 肥満と潜在的な治療標的の理解に関連性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient differentiation and imaging of brown adipocytes from newborn mouse interscapular adipose tissue enables robust in vitro modeling of thermogenic fat biology. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for metabolic disease portfolios, particularly in obesity and lipodystrophy research. The protocol's reproducibility and preservation of key BAT features facilitate predictive confidence in downstream functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of brown adipocyte activation mechanisms relevant to metabolic disease targets.
- Supports biological de-risking by confirming expression of thermogenic and adipogenic markers.
- Facilitates functional target validation through quantifiable mitochondrial and lipid phenotypes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized system for preparing mature brown adipocytes for compound screening.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of differentiation markers and mitochondrial function.
- Enables imaging-based readouts for evaluating compound effects on adipocyte morphology and function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro adipocyte phenotypes with disease-relevant BAT biology for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of metabolic disease programs by modeling BAT activation and dysfunction.
- Facilitates biomarker alignment through quantification of UCP1 and mitochondrial adaptations.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a validated system for hypothesis testing, screening, and mechanistic studies of brown adipocyte biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on BAT activation and adipogenic differentiation pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in mature brown adipocytes.
- Analytics: Enables measurement of transcription factor expression, mitochondrial mass, and lipid droplet association.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo BAT function and metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing metabolic and obesity research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BAT-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes differentiation and imaging workflows for cross-team reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for metabolic disease targets by enabling robust functional assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of BAT-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cell culture, and advanced imaging techniques.
- Demands access to confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy infrastructure.
- Necessitates protocol standardization for reproducibility across research teams.
- May require adaptation for different mouse strains or developmental stages.
- Cell yield and differentiation efficiency depend on precise tissue handling and processing.
![[18F]FDGマイクロPET/MRイメージングを用いたマウスの褐色およびベージュ色の脂肪組織の可視化と定量化](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A25%253A48.878Z&w=384&q=75)
