Name: 遺伝子改変マウスモデルにおける同所性ATC腫瘍の解析のための高解像度超音波検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 41 s
Description: 学ぶ高解像度超音波検査法を用いて、遺伝子改変マウスモデルにおける同所性ATC腫瘍の成長をリアルタイムで可視化・モニタリングする方法です。非侵襲的ながん研究ツールとして有用です。

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この研究は、公的、商業的、または非営利の資金提供機関から特定の助成金を受け取っていません。

本研究は、四川大学の動物管理および使用委員会の承認を得て実施されました。 TPO-cre/ERT2;ブラフCA/重量;Trp53 Δex2-10/Δex2-10 トランスジェニックマウス10 を本研究に用いた( 資料表参照)。プロトコルステップは、必要に応じて異なる動物種に合わせて変更することができる。ここでは、平均年齢93日の6匹の雌と6頭の雄を含む12匹のマウスを使用しました。
1. 実験準備
<ol><li>超音波検査システムの電源を入れ( 材料の表を参照)、画像をキャプチャしてデータを収集するための新しいフォルダーを作成します。40 MHzラインプローブを選択し、表在 組織パターンをクリックして、表在 組織トランスデューサをアクティブにします。甲状腺イメージングには「Bモード」を使用します(図1A)。 注意: Bモードは基本的な超音波イメージングモードです。超音波画像の出現は、音と体内の組織との物理的相互作用に依存しています。Bモード画像は、グレー画像11、12として生成される。</li>
	<li>マウスを特定のケージに入れて、餌と水を自由に利用できるようにします。温度調節を確実にするために、ケージを補助加熱装置( 材料表を参照)に置きます。</li>
	<li>気化器内の十分なイソフルランとタンク内のO2 を確保してください。供給が不十分な場合は、タンクを新しいものと交換してください。</li>
	<li>動物イメージングプラットフォームを滅菌生理食塩水で洗浄し、加熱ボタンをオンにします。動物をプラットフォームに置く前に、温度が38〜40°Cであることを確認してください(図1C)。</li>
</ol>2.イメージングのための動物の準備
<ol><li>イソフルラン気化器のスイッチを入れます。マウスをケージから麻酔ボックスに移します。</li>
	<li>気化器からの1%〜2%のイソフルランと0.8 L / minで流れる酸素の混合物を使用して動物を麻酔します。.</li>
	<li>胸から首に脱毛クリームを塗り、30秒待ってから、クリームと毛皮を完全に拭き取ります。その領域と周囲の毛皮を温かい滅菌生理食塩水で十分にすすいでください。</li>
	<li>麻酔をかけた動物を加熱されたプラットフォームに置きます。麻酔出口に接続されたノーズコーンで鼻を覆います(図2A、B)。 注意: マウスは1〜2分以内に完全に鎮静する必要があります。動物がまだ活動している場合は、動物がペダル離脱反射を示さなくなるまで、長時間のイソフルラン誘導を実行します。.動物が安定して呼吸していることを確認してください。</li>
	<li>イメージング中は、加熱されたプラットフォームを介してマウスの心拍数を監視します。 注意: 超音波画像システムには心拍数モニターが装備されています。</li>
	<li>粘着テープを使用して、動物を仰臥位にして、マウスの手足を加熱されたプラットフォームに固定します。ノーズコーンが一定の麻酔ガス流量(1.5 L / min)で安定して配置されていることを確認します。</li>
	<li>眼科用軟膏を塗って目を保護します。</li>
</ol>3.腫瘍イメージング
<ol><li>イメージングシステムを調整して解像度を最適化します。次のパラメータを設定します:2次元ゲイン、25〜30 dB。画像の深さ、10 mm;焦点ゾーンの数、3;そして中心、3-6 mm。 注:本研究では、40MHzプローブを使用しました。データ取得用にBモードが指定されました。</li>
	<li>素肌の領域に超音波ジェル( 材料の表を参照)を自由に塗布します。</li>
	<li>プローブを持って胸部の超音波ゲルに接触させ、胸部から首に向かってスキャンして甲状腺を見つけます(図2C)。 注意: スキャン中は静かに圧力をかけます。動物の首に過度の圧力がかかると、あえぎや無呼吸を引き起こす可能性があります。このプロトコルはハンドヘルドスキャンに基づいて開発されましたが、機械化されたスキャンは、x軸とy軸に沿って移動する動物イメージングプラットフォームなど、プローブをガイドする機械を使用して実行することもできます。</li>
	<li>上下にスキャンして腫瘍の境界を特定し、そのサイズと形状を評価します。 注:健康な甲状腺は通常、気管の前に低エコー性の均質な構造として現れます。未分化腫瘍は甲状腺をはるかに大きく見せますが、これは首のスキャンによって簡単に識別できます(図3)。</li>
	<li>解剖学的位置と超音波エコーに応じて、気管とストラップの筋肉からATC腫瘍を特定します。 注意: ストラップの筋肉は、甲状腺と気管の前、および甲状腺の後ろにあります。ストラップ筋肉の超音波エコーはATCの超音波エコーよりも高く見えますが、気管13の後ろに減衰が存在します。<ol><li>腫瘍全体の印象に基づいて、左から右に最大の腫瘍直径を持つ画像セクションを確認します。 フリーズ ボタンを押し、超音波ノギスを使用して前後および左から右の腫瘍直径を測定します。 注:前後の直径は、左から右への腫瘍の直径に対して垂直に測定する必要があります(図4)。ATCの腫瘍サイズは、前後直径に左から右への腫瘍直径14を乗じて計算した。左右の腫瘍の大きさに一貫性がなかったため、腫瘍の両側を別々に計算した。腫瘍の総サイズは、両側性腫瘍を加えることによって得られた。サイズは、ATCの成長曲線を観察するために記録されました。</li>
	</ol></li>
	<li>記録をシネループとして保存すると、選択した画像のレビューが容易になります。</li>
</ol>4.動物の回復
<ol><li>スキャン後、超音波ゲルを拭き、動物の手足から拘束テープをはがします。</li>
	<li>補助加熱装置の上にマウスを置きます(ステップ1.2)。動物を横に置きます(図2D)。</li>
	<li>マウスが回復したら(~5分)、ケージに戻します。</li>
	<li>超音波検査システム、プローブ、およびプラットフォームを、柔らかい布とイソプロピルアルコールまたはグルタルアルデヒドワイプを使用して清掃します。</li>
	<li>イメージングシステムの電源を切ります。</li>
</ol>

<ol><li>Maniakas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+overall+survival+in+patients+with+anaplastic+thyroid+carcinoma%2C+2000-2019%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019.</a> JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).</li>
<li>Molinaro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplastic+thyroid+carcinoma%3A+From+clinicopathology+to+genetics+and+advanced+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).</li>
<li>Champa, D., Di Cristofano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse.</a> Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).</li>
<li>Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lymph+node+volume+by+ultra-high-frequency+ultrasound+imaging+in+the+Braf%2FPten+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intensity+focused+ultrasound+%28LIFU%29+triggered+drug+release+from+cetuximab-conjugated+phase-changeable+nanoparticles+for+precision+theranostics+against+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma.</a> Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).</li>
<li>Mohammed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+prevention+of+pancreatic+cancer%3A+Use+of+genetically+engineered+mouse+models+and+advanced+imaging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies.</a> Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultrasound+including+elastography+and+contrast-enhanced+ultrasound+%28CEUS%29+for+early+detection+and+characterization+of+liver+lesions+in+the+humanized+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).</li>
<li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+imaging+for+the+study+of+mouse+models+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).</li>
<li>Renault, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultrasound+imaging+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiologie%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultrasound imaging of the mouse.</a> Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).</li>
<li>McFadden, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+constrains+progression+to+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+a+Braf-mutant+mouse+model+of+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).</li>
<li>Garassini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+ultrasonic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22GEN%22%5BJournal%5D)">Basic principles of ultrasonic diagnosis.</a> GEN. 39 (4), 283-289 (1985).</li>
<li>Aldrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+physics+of+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Basic physics of ultrasound imaging.</a> Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).</li>
<li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+ultrasound+microimaging+of+thyroid+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice.</a> Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).</li>
<li>Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+ultrasound+measurement+of+thyroid+gland+volume%3A+a+new+equation+with+higher+correlation+with+3-D+ultrasound+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

このプロトコルは、高解像度超音波検査を使用して、遺伝子操作されたマウスモデルで同所性ATC腫瘍を分析します。遺伝子型が TPO-cre/ERT2のトランスジェニックモデル。 ブラフCA/重量;Trp53 Δex2-10/Δex2-10は当研究室で開発されました。動物はブラフV600E を過剰発現し、Trp53を欠いています。動物にタモキシフェンを腹腔内注射すると、約1ヶ月後に腫瘍が増殖します10。腫瘍は急速に成長し、50日以内に測定可能なサイズに達します。このプロトコルは、腫瘍の成長を4か月間モニターするために使用されました。
超音波検査は、肝臓、甲状腺、胎児など、人間の組織と同様の体の位置を占める組織をイメージングするためにマウスで信頼性があることが証明されています9。ヒトと同様に、マウス甲状腺は甲状腺軟骨および気管13の両側に位置する。...

未分化甲状腺癌(ATC)は甲状腺癌の2%未満を占めていますが、毎年甲状腺癌関連の死亡の50%以上を引き起こします。ATCと診断された後の生存期間の中央値はわずか約6か月であり、生存率を大幅に改善する治療法はありません1,2。
ATCの希少性は、病気がどのように始まり、積極的に進行するかを研究する研究を妨げてきました。この病気を模倣する遺伝子操作されたマウスモデルが最近利用可能になり、病気と可能な治療法に対するその反応についての洞察を提供します3,4,5。このような研究では、測定とモニタリングのための正確な腫瘍イメージングが必要であり、これは通常、磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影、または高解像度超音波検査を使用して実行されます6,7。超音波検査はマウスの臓器で広く使用されています。これは、リアルタイムで実行でき、被験者を放射線にさらさないため、磁気共鳴画像法やコンピューター断層撮影よりも利点があり、必要な機器は持ち運びできるほど小さいです8,9。ただし、超音波を使用してATCの成長を継続的に監視する研究はまれです。したがって、この研究は、この文脈における超音波の有用性を探ります。
ここでは、高解像度超音波検査を使用して、ATCのマウスモデルで腫瘍を正確にスキャン、監視、および測定するためのプロトコルが提示されています。

<table><tbody><tr><td>粘着テープ</td><td>ウィナー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brafflox/wt</td><td>マウス ライフサイエンス研究所との共同研究、eBond Pharmaceutical Technology Ltd、成都、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔導入用チャンバー</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>勝者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気加熱毛布</td><td>Petbee</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>医療用手袋</td><td>勝者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>Breeze</td><td>B914JY</td><td></td></tr><tr><td>TPO-cre/ERT2 マウス</td><td>生命科学研究所、eBond Pharmaceutical Technology Ltd、成都、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>とのコラボレーションTrp53flox/wt mice</td><td>Institute of Life Science、eBond Pharmaceutical Technology Ltd、成都、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>とのコラボレーション 超音波ゲル</td><td>ケプラーKL-250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波装置</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 3100</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子改変マウスモデルにおける同所性atc腫瘍の解析のための高解像度超音波検査

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

未分化甲状腺癌(ATC)は予後不良と生存期間の中央値が短いことと関連しているが、アウトカムを有意に改善する効果的な治療法はない。ATCの進行を模倣する遺伝子操作されたマウスモデルは、研究者がこの病気の治療法を研究するのに役立つ可能性があります。マウスの3つの異なる遺伝子型、 TPO-cre / ERT2を交配します。ブラフCA/重量;Trp53 Δex2-10/Δex2-10トランスジェニックATCモデルを開発した。ATCマウスモデルは、タモキシフェンの腹腔内注射により、BrafV600E の過剰発現とTrp53の欠失により誘導され、約1か月以内に腫瘍が発生しました。高解像度超音波を適用して腫瘍の開始と進行を調べ、腫瘍のサイズを測定することにより動的成長曲線を取得しました。磁気共鳴画像法(MRI)やコンピューター断層撮影スキャンと比較して、超音波はATCマウスモデルを観察する上で、非侵襲的、ポータブル、リアルタイムで、放射線被曝がないなどの利点があります。高分解能超音波は、動的および複数の測定に適しています。ただし、マウスの甲状腺の超音波検査には、関連する解剖学的知識と経験が必要です。この記事では、高分解能超音波を利用してトランスジェニックATCモデルの腫瘍をスキャンするための詳細な手順を説明します。一方、超音波パラメータ調整、超音波スキャンスキル、動物の麻酔と回復、およびプロセス中に注意が必要なその他の要素がリストされています。

研究開始時の右ATCの平均サイズは4.867 mm 2であり、平均左ATCサイズは5.189 mm2でした。4回目の測定では、右ATCの平均サイズは11.844 mm 2に拡大し、左葉の腫瘍サイズは9.280 mm2に拡大しました。ATC の合計サイズが 10.057 mm 2 から 15.843 mm2 に増加しました。研究の後期段階で、ATCは急速に成長しました。「P92」と標識されたマウス(表1)に関しては、4回目の測定で腫瘍のサイズは、最初の測定のサイズのほぼ4倍に拡大していました。4匹のマウスの代表的な測定値および成長曲線を図5に示す。
高周波超音波検査は、ヒトの甲状腺を検査するために最も頻繁に使用される画像診断法であり、この技術はマウスにも適しているようです。マウスの甲状腺全体と甲状腺病変の成長の詳細を視覚化できます。高周波超音波検査の方法を適用す...

本プロトコルは、マウス甲状腺全体を視覚化し、未分化甲状腺癌の成長を監視するための高周波超音波検査を記載しています。

遺伝子改変マウスモデルにおける同所性ATC腫瘍の解析のための高解像度超音波検査

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...

このプロトコルは、ユーザーが高解像度超音波検査を利用して、未分化甲状腺癌のマウスモデルで腫瘍をスキャン、監視、および測定するのに役立ちます。超音波検査は、肝臓、甲状腺、胎児など、人間の組織と同様の体の位置を占める組織をイメージングするためにマウスで信頼性があることが証明されています。まず、超音波検査システムをオンにして、画像をキャプチャしてデータを収集するための新しいフォルダーを作成します。次に、40メガヘルツラインプローブを選択し、表在組織パターンをクリックして表在組織トランスデューサーをアクティブにし、得られたBモードを甲状腺イメージングに使用します。動物イメージングプラットフォームを清掃し、プラットフォームの温度が摂氏38〜40度に達するように加熱ボタンをオンにしてから、動物をその上に置きます。マウスを麻酔し、加熱されたプラットフォームに置きます。麻酔口に接続されたノーズコーンで鼻を覆います。次に、マウスを仰臥位にして、粘着テープを使用して手足を加熱プラットフォームに固定します。腫瘍イメージングの場合は、イメージングシステムを調整して解像度を最適化します。2次元ゲインを25〜30デシベル、画像深度を10ミリメートル、中央を3〜6ミリメートルに設定します。パラメータを設定した後、脱毛クリームを使用して達成される素肌の領域に超音波ゲルを自由に適用します。プローブを持って、胸部の超音波ゲルと接触させます。次に、胸から首に向かってスキャンして、甲状腺を見つけます。解剖学的位置と超音波エコーに応じて、気管とストラップの筋肉から未分化甲状腺癌腫瘍を特定します。腫瘍全体の印象に基づいて、左から右に最大の腫瘍直径を持つ画像セクションを確認します。次に、フリーズボタンを押し、超音波ノギスを使用して前後および左から右の腫瘍直径を測定します。スキャンが完了したら、超音波ゲルを拭き、動物の手足から拘束テープをはがします。左右の葉のATC腫瘍サイズを4時間間隔で測定した。4回目の測定では、右ATCの平均サイズは11.844平方ミリメートルに拡大し、左葉の腫瘍サイズは9.280平方ミリメートルに拡大し、合計サイズは15.843平方ミリメートルに増加しました。興味深いことに、P92と標識されたマウスでは、腫瘍のサイズは最初の測定のサイズのほぼ4倍に成長していました。この技術の主な利点は、超音波が柔軟であり、放射線なしでリアルタイムで実行できることです。

high-resolution-ultrasonography-for-analysis-orthotopic-atc-tumors

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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遺伝子改変マウスモデルにおける同所性ATC腫瘍の解析のための高解像度超音波検査

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