静的法と動的法を組み合わせたアプローチによる有機ペルオキシ酸の乳バイオフィルム根絶効果評価

バイオフィルム形成微生物は、乳製品産業を含む食品産業における大きな問題です。製品の品質に悪影響を与えるため、バイオフィルム制御戦略を開発することが重要です。このアプローチは、静的ハイスループットスクリーニング法とin situ条件を模倣する動的方法を組み合わせたものです。

これら2つの方法は、バイオフィルムに対する消毒剤の有効性を研究するための補完的なものです。このアプローチは、食品、医療、または環境分野のバイオフィルムを制御するための新しい生物学的または化学的製剤をテストするために使用できます。シュードモナスアゾトフォルマンス細菌培養チューブをボルテックスすることから始めます。

100マイクロリットルの細菌培養物を10ミリリットルの滅菌トリプシン大豆ブロスまたはTSB培地に無菌的に移し、ミリリットルあたり約2倍の10〜7番目のCFUの最終濃度を達成します。培養チューブをボルテックスします。次いでマルチチャンネルピペットを用いて、150マイクロリットルの希釈細菌培養物をバイオフィルムマイクロタイタープレートウェルに三重に移す。

コントロールとして、150マイクロリットルのTSB培地を3つの新しいウェルにロードします。次に、バイオフィルムマイクロタイタープレートを摂氏30度で24時間攪拌せずにインキュベートします。バイオリアクターの部品を洗浄して風乾してから、磁気バーでホルダーに取り付けられた1リットルのガラスビーカー内にフラットブレードを配置します。

バイオリアクターの蓋の内側に取り付けられたプラスチックバーを使用して、セットアップを直立させます。ドライバーを使用して、ステンレス鋼のクーポンまたはスライドをポリプロピレンロッドに配置します。クーポンまたはスライドを蓋の穴に挿入し、位置合わせピンをノッチに配置しずに、滅菌中に蒸気を逃がします。

すべてのバイオリアクターベントをアルミホイルで覆い、残りの機器、つまりサイズ18のチューブとサイズ16のチューブ、ガラスフローブレーキ、コンテナキャップ、ドライバー、鉗子、および0.2マイクロメートルのフィルターをアルミホイルで包みます。オートクレーブ バイオリアクターを摂氏121度で20分間のドライサイクルでセットアップします。バイオリアクターでのバイオフィルム形成の最初のステップをバッチモードで実行するには、生物学的安全キャビネット内で、サイズ18チューブの一方の端をバイオリアクターの出口注ぎ口に接続し、もう一方の端をアルミホイルで包みます。

バイオリアクターの蓋から1つのクーポンまたはスライドホルダーを取り外し、滅菌済みの50ミリリットルチューブに入れます。次いで、50ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、ロッドが占める穴を通して、1ミリリットルTSB培地当たり340ミリリットルの340ミリリットルをバイオリアクタービーカーに充填する。バイオリアクター内の培地に接種するには、5ミリリットルのピペットを使用して、1ミリリットルのシュードモナスアゾトフォルマンス細菌溶液あたり1ミリリットルの10を8番目のCFUに加え、ロッドを元の位置に戻します。

ピンがそれぞれのノッチに収まるように、すでに蓋の穴に配置されているロッドを配置します。次に、バイオリアクターの蓋にある最小直径のチューブの端に0.2マイクロメートルのバクテリアエアパージフィルターを配置します。同じ直径の他のチューブは、金属製のスクリューキャップまたはしっかりと閉じるシリコンプラグで恒久的に差し込まれたままになります。

バイオリアクターを摂氏30度に設定した加熱プレート上に24時間置き、130RPMで攪拌します。24時間後、連続フローモードでバイオリアクター内でバイオフィルム形成の第2工程を行う。18リットルの滅菌蒸留水を含むカーボイをバイオセーフティキャビネットに入れます。

次に、1リットルあたり1000ミリグラムのTSB培養培地を2リットル添加して、1リットルあたり100ミリグラムの最終濃度を得ます。2本のチューブが接続されている滅菌キャップで容器を覆います。1つ目は、媒体をポンピングするためにキャップの界面に固定されたシリコンチューブです。

2つ目は、サイズ16のチューブが外部ポートに接続されており、液体がバイオリアクターに向かって流れるようになっています。サイズ16のチューブをガラスフローブレーキの端に接続した後、後者をバイオリアクターの蓋のもう一方の端にある最大のチューブに挿入し、サイズ16のチューブを蠕動ポンプに取り付けます。別の20リットルのカーボイを使用して、バイオリアクターから廃液を収集します。

バイオリアクター出口注ぎ口に接続されたチューブの端を廃棄物容器のキャップに取り付けます。この容器の蓋にあるチューブに0.2マイクロメートルのフィルターを挿入します。完了したら、毎分11.3ミリリットルの流量で蠕動ポンプを始動し、システムを24時間稼働させます。

24時間後、蠕動ポンプをオフにし、バイオリアクターの攪拌と加熱を停止します。細菌のバイオフィルムを回収するには、クーポンまたはスライドを40ミリリットルのPBSですすぎ、プランクトン性細菌を除去します。次に、40ミリリットルのPBSを含む滅菌可能な50ミリリットルの円錐管にそれらを放出します。

ボルテックスの30秒後、30秒間40キロヘルツでチューブを超音波処理します。これを3回繰り返します。完了したら、40ミリリットルのバイオフィルム懸濁液を滅菌50ミリリットルのコニカルチューブに集め、クーポンまたはスライドを2つの滅菌PBS溶液ですすいでください。

このすすぎ液を回収し、すでに採取したバイオフィルム懸濁液に加えます。マイクロタイタープレートを摂氏30度から取り出します。200マイクロリットルのPBSを96ウェルマイクロプレートの3つのウェルに加えます。

バイオフィルムを洗浄し、浮遊細菌を除去するには、ペグ上にバイオフィルムが形成されたバイオフィルムマイクロプレートの蓋をPBSを含む96ウェルマイクロプレートに10秒間移します。必要な濃度で消毒剤を準備し、各消毒剤濃度の200マイクロリットルを新しい96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに3重に追加します。バイオフィルムマイクロタイタープレートの蓋を消毒剤を含む96ウェルマイクロタイタープレートに移し、プレートを室温で所望の曝露時間インキュベートします。

次に、200マイクロリットルのDey-Engley中和ブロスを新しい96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えます。バイオフィルムマイクロタイタープレートの蓋を中和ブロスを含む96ウェルマイクロタイタープレートに移す。マイクロタイタープレートをパラフィルムで密封し、40キロヘルツのバス超音波処理器に30分間入れます。

30分後、超音波処理プレートの最初の列から、100マイクロリットルの剥離したバイオフィルムを新しい96ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に移す。次に、180マイクロリットルの滅菌PBSを最初の行を除く96ウェルプレートに追加します。次に、1列目のバイオフィルム溶液20マイクロリットルをPBS180マイクロリットルを含む2列目のウェルに移し、希釈10をマイナス1にした。

次に、20マイクロリットルを2列目から次の列のウェルに移して、10からマイナス2に希釈します。これを繰り返して、10からマイナス5、10からマイナス7の間の希釈を取得します。100マイクロリットルの所望の希釈液をTSAに接種し、細菌の増殖パラメータに従ってプレートをインキュベートします。

バイオリアクター内のクーポン上にシュードモナスアゾトフォルマンスPFLA 1バイオフィルムを形成し、クーポンを保持しているロッドを取り外し、30ミリリットルのPBSを含む円錐管内でロッドをすすぎ、プランクトン細胞を除去します。ドライバーを使用して、各クーポンを滅菌済みの50ミリリットルの円錐形のチューブにドロップします。次に、コントロール用に4ミリリットルの適切な有機ペルオキシ酸溶液またはPBSを追加します。

5分間のインキュベーション後、36ミリリットルのDey-Engley中和ブロスを加えます。円錐管を30秒間ボルテックスした後、40キロヘルツで30秒間超音波処理します。このプロセスを3回繰り返して、バイオフィルム懸濁液を得る。

他のロッドで同じ手順を繰り返し、バイオフィルム懸濁液の連続妄想を準備し、前述のようにTSA培地に懸濁液をプレートします。SCM分析は、バイオフィルムマイクロプレートペグ上のシュードモナスアゾトフォルマンスPFL1Aによるバイオフィルムの存在を示した。バイオリアクターを用いてステンレススライド上に形成されたシュードモナスアゾトフォルマンスPFL1Aバイオフィルムは非常に緻密に見え、成熟した3次元バイオフィルムの形態学的特徴を示した。

動的システムにおけるこの分離物によって開発されたバイオフィルムの細菌数の結果は、TSB培養培地でセンチメートル四方あたり8.74 log CFU、滅菌スキムミルクで7.86 log CFUセンチメートル四方に相当する有意な細胞密度を示しました。B.vesicularis分離物で得られた結果は、栄養素濃度が1リットル当たり100から900ミリグラムに増加し、バイオフィルムの細菌数が6.11から8.71対数CFUセンチメートル平方に増加したことを示した。また、流量を毎分6.0ミリリットルに減らすと、有意なバイオフィルムの成長が観察され、特定の要因がバイオリアクター内のバイオフィルム形成に影響を与える可能性があることが示されました。

どのバイオフィルムも、有機ペルオキシ酸と500ppm、および乳製品植物で通常適用される消毒剤の過酸化水素濃度で100, 000ppmの5分間の接触時間で検出可能な生細胞を含んでいませんでした。SCMは未処理の最小バイオフィルム除菌濃度またはMBECバイオフィルムの3次元構造を示したが、処理されたMBECバイオフィルムは3次元立体構造を失った。このプロトコルを実行している間、無菌状態にとどまることが不可欠です。

また、ユーザーは、生成された結果が固有の分離および消毒剤に関連付けられていることを覚えておく必要があります。消毒剤と機械的振動、超音波、または酵素処理を組み合わせることで、バイオフィルム根絶の有効性を向上させることができます。バイオフィルムを形成するために静的および動的方法を使用するこのアプローチは、研究者がさまざまな分野でバイオフィルムをより適切に制御するための新しい抗バイオフィルム製剤をスクリーニングおよび研究するための道を開いた。