Name: オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶオープントップ臓器チップを用いたヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成法。皮膚・肺・気道・腸などの組織特異的マーカーと機能を維持し、生体内微小環境を再現する革新的なオルガノイド培養技術です。

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<ol><li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials%3A+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li>
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<li>Mao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+type+II+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial type II cells in primary culture.</a> Physiological Reports. 3 (2), 12288(2015).</li>
<li>Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+significantly+alters+gene+expression+profiles+and+reduces+differences+between+myometrial+and+fibroid+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells.</a> Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).</li>
<li>Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+tissue+stiffness+and+bioadhesivity%3A+Advanced+biomaterials+to+model+tumor+microenvironments+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).</li>
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<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2d+to+3d+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
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<li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957(2021).</li>
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<li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+physiology+on-chip%3A+Historical+perspectives+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250(2021).</li>
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著者は、潜在的な競合する利益と見なされる可能性のある以下の金銭的利益/個人的な関係を宣言します。 ヴァローネアントニオはEmulate Inc.の元従業員であり、Emulateの株式を保有している可能性があります。

Open-Top Chipは、制御された微小環境において内皮、間質、上皮の間で発生する複雑な細胞相互作用をリアルタイムで調査するためのプラットフォームです。この技術は、流体せん断(流れ)、周期的伸張、マイクロパターニングによって達成される上皮表面トポグラフィの再構築など、ヒト組織の微小環境の再構成に関連する物理的および生化学的手がかりの統合など、従来の有機型およびオルガノイド培養 に比べて 重要な利点を提供します。このプラットフォーム内で増殖するヒト細胞は相乗効果を発揮して、免疫組織化学や上部および/または下部コンパートメントからの流出液(または排水)を使用した生化学的アッセイなど、従来の手法 で 分析できる組織特異的機能を再現します。現在の設計では、細胞が組織特異的線維芽細胞や他の間質細胞と直接接触して増殖する上皮層に容易にアクセスでき、上皮組織の多細胞構造を模倣しています。特に、Open-Top Chipプロトタイプは、他のオルガンオンチッププラットフォームの使用に関連する一般的な課題に対する実行可能なソリューションを提供します。間質コンパートメント内にいくつかの異なる細胞タイプを組み込むことがで...

歴史的に、科学者は創薬のために前臨床動物実験に依存してきましたが、人間の転帰との相関性が低いため、これらの方法の多くが疑問視されてきました1。動物実験を置き換え、削減し、改良するための「3R」原則の実施は、科学者に前臨床薬物および化学毒物学のリスク評価をサポートするための新しいin vitro代替方法を見つけることを促します2。しかし、これまでに開発された多くのin vitroモデルは、人間の生体器官の動的な性質を再現するために必要な生物学的構造、細胞の複雑さ、および機械的環境を欠いています3,4。
従来のin vitro前臨床システムでは、通常、硬質プラスチック表面上で増殖したヒト細胞の2D単培養が使用されます。これらの方法は、簡単な機構研究を行うためのツールを提供し、医薬品候補の迅速なスクリーニングを可能にします。2Dモデルは比較的低コストで堅牢性が高いため、自動ハイスループットシステムと組み合わされることが多く、医薬品開発プロセスの初期段階で潜在的な医薬品候補を迅速に特定するために使用されます5,6。しかし、このような2Dモデルは、治療薬候補に対する組織レベル、臓器レベル、または全身反応をモデル化するためのトランスレーショナルアプローチを提供しておらず、開発の前臨床段階での医薬品の安全性と有効性を正確に予測する必要があります。フラットセル培養では、複雑な多細胞相互作用、生体力学的特性、ヒト組織の3次元(3D)構造など、天然の組織の微小環境を再現することはできません7。平坦な表面上で増殖する細胞は、成熟した表現型を獲得しないことが多く、したがって、天然組織の場合のように薬理学的刺激に応答することができません。例えば、in vitroで増殖した初代ヒト肺胞上皮細胞は、扁平上皮表現型を示し、サーファクタントタンパク質CおよびB(SP-CおよびSP-B)8を含む重要な表現型マーカーを失います。不十分な分化に加えて、初代細胞は、組織の炎症に関連する特定の生化学的経路が機能しなくなるため、in vitroで生物学的ストレッサーに対して鈍感になることがよくあります9。このような細胞機能の喪失は、主に硬い基質の使用と、肺線維芽細胞や平滑筋細胞などの組織特異的間質細胞によって自然に放出される可溶性因子の欠如に関連しているようです10,11。
化学的物理的および生物学的複雑さの欠如がin vitroでの細胞の生理学的挙動を制限することを理解することで、より洗練された多細胞モデルの開発が促進され、体外のヒト組織の複雑さをよりよく捉えることが証明されています12,13。1970年代初頭に最初の共培養モデルが作成されて以来14、合成および天然のヒドロゲルの導入により、天然の組織微小環境を模倣する能力が大幅に向上し、細胞分化を促進し、細胞の自己組織化を組織様構造に導き、天然の組織機能を回復するための貴重なツールになりました15,16.例えば、適切な3D足場で増殖させると、ヒト細胞はスフェロイドやオルガノイドなどの機能的な構造に自己配列し、幹細胞マーカーを発現し、自己複製することができます17。対照的に、ヒト細胞(幹細胞を含む)は、従来の2D基質上で増殖すると、急速に老化し、数回継代した後に老化を受ける18。さらに、ヒドロゲルは、多孔性、孔径、繊維の太さ、粘弾性、トポグラフィー、剛性などの特定の組織特性に合わせて「調整」することも、組織由来の細胞成分および/または生理活性分子でさらに操作して、生理学的または病理学的状態のエミュレーションを可能にすることもできます19,20.医薬品研究で使用される3Dヒドロゲルベースのモデルは、薬物試験の大きな可能性を秘めているにもかかわらず、in vivo組織の複雑な細胞構造を完全に再現しておらず、静水圧、周期的伸張、流体せん断など、人体に通常存在する重要な血行動態および機械的刺激を欠いています21。
臓器チップ(OOC)などの微小生理学的システム(MPS)は、インビトロで複雑な生理学的応答をキャプチャできるツールとして最近登場しました22,23。これらのモデルは、多くの場合、生体の動的な微小環境のモデリングを可能にするマイクロ流体プラットフォームの使用を採用しています。
3D組織バイオエンジニアリングとメカノバイオロジーの原理を組み合わせて、複雑なヒト上皮組織のオープントップチップモデルを作成しました。これにより、上皮組織の多細胞で動的な微小環境を詳細に再現することができました。これには、生体器官に自然に存在するが、従来のin vitroモデルでは無視されることが多い組織特異的な生化学的および生体力学的手がかりが含まれます24。Open-Top Chipには、多孔質膜で区切られた血管コンパートメント(図1A)と間質コンパートメント(図1B)の2つのコンパートメントが組み込まれており、2つのチャンバー間で栄養素を拡散させることができます(図1C)。血管コンパートメントは、生理学的せん断応力を再現するために連続的な流体の流れにさらされ、間質チャンバーの伸縮性のある設計により、呼吸運動または腸の蠕動運動に関連する機械的ひずみのモデリングが可能になります。間質コンパートメントには、組織特異的線維芽細胞の生理学的成長をサポートするように設計された調整可能な3Dヒドロゲル足場が収容されています。これは、空気 - 液体界面の確立を容易にする取り外し可能な蓋を有し、粘膜組織のヒト生理機能のより大きなエミュレーションを可能にする条件、ならびに上皮層に直接薬物を投与するための組織への直接アクセスを可能にする。補足図1は、寸法や生物学的コンパートメント(補足図1A-D)を含むオープントップチップ設計の主要コンポーネントのいくつかと、このプロトコルで説明されている主な技術的ステップ(補足図1E)を示しています。
オープントップチップの灌流は、プログラム可能な蠕動ポンプで実現されます(図1D)。ペリスタルティックポンプのセットアップにより、12個のオープントップチップを同時に灌流できます。ほとんどのインキュベーターは、インキュベーターあたり最大24チップの培養を可能にする2つのセットアップを収容できます。機械的延伸は、カスタムメイドのプログラム可能な真空圧力調整器を使用して実現されます(図1E)。これは、デジタル-アナログコンバータによって電子的に制御される電空真空レギュレータで構成されています。言い換えれば、電空真空レギュレータは、ユーザーが決定する振幅と周波数を持つ正弦波真空プロファイルを生成します。0%から15%の範囲の周期ひずみは、0〜-90kPaの範囲の振幅と0.2Hzの周波数でオープントップチップの真空チャネルに負圧を加えることによって生成されます。これは、以前に採用され、他の論文25に記載されている市販のFlexcellひずみユニットと同等のカスタムメイドのシステムです。例えば、肺の呼吸運動や腸の蠕動運動に関連する機械的組織変形を模倣するために、空気圧アクチュエータは正弦波真空/ひずみ波を適用し、その大きさと振幅は、ヒト細胞が本来の組織で経験する歪みと周波数の生理学的レベルに一致するように調整できます。
ここでは、プロトタイプのOpen-Top Chipプラットフォーム上で有機型上皮等価物をエンジニアリングおよび培養するための効率的で再現性のある方法について説明します。これにより、血管液の流れと機械的伸張を統合しながら、皮膚、肺胞、気道、結腸などの複雑な臓器モデルを生成できます。複雑な上皮モデルを生成するための組織工学の原理を実装する際に考慮しなければならない重要な技術的側面を概説します。現在の設計の利点と考えられる制限について説明します。
流れとストレッチのパラメーターを含む、組織と臓器の成熟を達成するために使用される主なステップの概要は、皮膚の場合の図2、肺胞の場合の図3、気道の場合の図4、および腸の場合の 図5で報告されています。 異なる臓器モデルの培養に使用される培地組成および試薬に関する追加情報は、補足表に含まれています(皮膚については補足表1;肺胞の補足表2;気道については附則表3、腸については附則表4)。

<table><tbody><tr><td>10倍エメム&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>12-684F</td><td>ミディアム;Stroma</td></tr><tr><td>18ゲージニードル</td><td></td><td>MicroGroup316H18RW</td><td>チューブステンレス鋼316溶接、18RWフルハード&nbsp;</td></tr><tr><td>19ゲージニードル</td><td></td><td>MicroGroup316H19RW</td><td>チューブステンレス鋼316溶接、19RWフルハード</td></tr><tr><td>2ストップPharMed BPT&nbsp;</td><td>コール・パーマー&nbsp;</td><td>EW-95723-12</td><td>チューブ、0.25 mm、12個入り</td></tr><tr><td>70%エタノールおよびワイプ&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>表面滅菌用&nbsp;</td></tr><tr><td>8-ブロモアデノシン 3&prime;,5&prime;-環状一リン酸ナトリウム塩 (8-Br-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td>Medium supplement&nbsp;</td></tr><tr><td>A-83-01&nbsp;</td><td>トクリス&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマ</td><td>A9795</td><td></td></tr><tr><td>アドバンスド DMEM/F12&nbsp;</td><td>サーモ</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>気道上皮細胞ライフ</td><td>ラインセル</td><td>テクノロジーFC-0016</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>肺胞細胞</td><td>Cell Biologics</td><td>H6621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ABCA3&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab24751&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体 [3C9]&nbsp;</td></tr><tr><td>抗アクアポリン5 Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab215225&nbsp;&nbsp;</td><td>ウサギモノクローナル抗体 [EPR3747]&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>抗アクアポリン5&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab92320&nbsp;</td><td>ウサギモノクローナル抗体 [EPR3747]&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ベータIVチューブリン&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab11315&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体 [ONS.1A6]&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD31(PECAM-1)&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab9498&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル[JC/70A]抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチCK5&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab75869&nbsp;</td><td>ウサギ組換えモノクローナル [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>抗サイトケラチン10&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>MA5-13705&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体 (DE-K10)&nbsp;</td></tr><tr><td>抗サイトケラチン14&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>AB7800&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチE-カドヘリン&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab1416&nbsp;&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗フィラグリン&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>PA5-79267&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチHTI-56&nbsp;</td><td>テラス・バイオテック&nbsp;</td><td>TB-29AHT1-56&nbsp;&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体(IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチHTII-280&nbsp;</td><td>テラス・バイオテック&nbsp;</td><td>TB-27AHT2-280&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体(IgM)&nbsp;</td></tr><tr><td>抗インボルクリン&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>MA5-11803&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体(SY5)&nbsp;</td></tr><tr><td>抗アイソフォームTA p63-&α;、-&β;、-&γ;&nbsp;&nbsp;</td><td>ビオレンゲント&nbsp;</td><td>618902&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチキ67&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab8191&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体 [B126.1]&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチランプ3&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab111090&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチマチュアSP-B&nbsp;</td><td>セブンヒル&nbsp;</td><td>WRAB-48604&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチMUC5AC&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>PA5-34612&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ムチン-2&nbsp;</td><td>SantaCruz Biotechnology</td><td>sc-7314</td><td>マウスモノクローナル抗体 (IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチp63&nbsp;&nbsp;</td><td>ダコ&nbsp;</td><td>GA662&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体p63タンパク質(Dako Omnis)&nbsp;クローンDAK-p63&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチPCNA&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>PA5-32541&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ポドプラニン(AT-1&alpha;)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab128994&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗Pro+成熟界面活性剤タンパク質B&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab40876&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>界面活性剤C&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>セブンヒル&nbsp;&nbsp;</td><td>WRAB-9337&nbsp;&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗子宮グロビン/SCGB1A1&nbsp;</td><td>ハイカルト・バイオテック&nbsp;</td><td>HM2178&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体 [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>抗VE-カドヘリン&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab33168&nbsp;</td><td>ウサギポリクローナル抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチZO-1&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>33-9100&nbsp;</td><td>マウスモノクローナル抗体 [1A12]&nbsp;</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>吸引ピペット&nbsp;</td><td>コーニング/ファルコン&nbsp;</td><td>357558&nbsp;</td><td>2mL、ポリスチレン、個包装&nbsp;</td></tr><tr><td>吸引のヒント&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>滅菌(オートクレーブ滅菌)&nbsp;</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA (10X) in PBS solution&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>37525&nbsp;</td><td>ブロッカー剤&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td></td><td>Sigma C7902</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133</td><td>10 mg/mL (Stroma)</td></tr><tr><td>Collagen I&nbsp;</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td>3 mg/mL (Vascular ECM)</td></tr><tr><td>コラーゲンIV</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;C5533</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIV</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>C5533-5MG&nbsp;</td><td>ヒト胎盤由来のコラーゲン、5 mg粉末、1 mg / mLに再構成&nbsp;</td></tr><tr><td>結腸性線維芽細胞&nbsp;</td><td>細胞生物学的製剤</td><td>&nbsp;H6231</td><td></td></tr><tr><td>大腸微小血管内皮細胞</td><td>&nbsp;Cell Biologics</td><td>H6203&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>15 mLおよび50 mL&nbsp;ポリプロピレン、滅菌&nbsp;</td></tr><tr><td>架橋剤(ER-1)&nbsp;</td><td>エミュレート&nbsp;</td><td>10461</td><td>5 mg粉末&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、乳酸)&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>D3571&nbsp;</td><td>DNAプローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>真皮線維芽細胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-010</td><td></td></tr><tr><td>真皮微小血管内皮細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Σ</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12&nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td></td><td></td>11320082</tr><tr><td>DMEM/F-12、GlutaMAX&nbsp;&nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>〒10565-018&nbsp;</td><td>ALI培地用基礎培地&nbsp;</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG H&L (Alexa Fluor 488)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab150105&nbsp;</td><td>ロバ抗マウス二次抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG H&L(アレクサフロー568)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab175472&nbsp;</td><td>ロバ抗マウス二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG H&L (アレクサ フロー 647)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab150107&nbsp;</td><td>ロバ抗マウス二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgGハンド&L (Alexa Fluor 488)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>&nbsp;ab150073&nbsp;</td><td>ロバ抗マウス二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgGハンド&L(アレクサフロー568)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab175470&nbsp;</td><td>ロバ抗マウス二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgGハンド&L (アレクサ フロー 647)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab150075&nbsp;</td><td>ロバ抗マウス二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコs PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+なし)&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>21-031-CV&nbsp;</td><td>1倍&nbsp;</td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)ヒト、大腸菌の組換え</td><td>PromoCell</td><td>C-60170</td><td>培地サプリメント&nbsp;</td></tr><tr><td>F-12ハムs</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21700-108</td><td>血管ECM</td></tr><tr><td>FibriColの場合&nbsp;</td><td>アドバンスドバイオマトリックス&nbsp;</td><td>5133-20ML&nbsp;</td><td>I.コラーゲン溶液(10mg/mL)</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>コーニング</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン、ヒト、ナチュラル、&nbsp;&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>47743-654&nbsp;</td><td>ヒト血漿フィブロネクチン&nbsp;</td></tr><tr><td>細先端精密ピンセット&nbsp;</td><td>アベン</td><td>18056USA&nbsp;</td><td>Technik Style 5B-SA 精密ステンレス製ピンセット</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21700-108</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgGハンド&L (Alexa Fluor 594)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab150080&nbsp;</td><td>ヤギ抗マウス二次抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgGハンド&L (アレクサ フロー 647)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab150115&nbsp;</td><td>ヤギ抗マウス二次抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgGハンド&L (FITC)&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab6785&nbsp;</td><td>ヤギ抗マウス二次抗体&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG1 Alexa Fluor 568&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>A-21124&nbsp;</td><td>ヤギ抗マウスIgG1二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgM Alexa Fluor 488&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>A-21042&nbsp;</td><td>ヤギ抗マウスIgM二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ハンドヘルド真空吸引器&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>4930&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒートイン不活化 HyClone FetalClone II セラム (FCS)&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Human [Leu15] - Gastrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>ヒトコロノイド</td><td>臨床</td><td></td><td>切除から得られた</td></tr><tr><td>ヒト EGF 組換えタンパク質&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>human epithelial growth factor&nbsp;</td><td>サーモ&nbsp;</td><td></td><td></td>PHG0311</tr><tr><td>HyClone FetalClone II Serum(米国) &nbsp;</td><td>GEヘルスケア&nbsp;</td><td>SH30066.02HI&nbsp;&nbsp;</td><td>滅菌FBS&nbsp;ヒート不活性化&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン21-ヘミスコハク酸ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン&nbsp;</td><td>プロモーションセル&nbsp;&nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>ミディアムサプリメント&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>アイスバケツ&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>イスマテック IPC-N&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-78000-41</td><td>低速デジタル蠕動ポンプ; q24-Channel (12 チップごとに 1</td></tr>)<tr><td>ITES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-839Z</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK</td><td>PromoCell</td><td>C-63821</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>ビオラミナ</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン、521 CTG(CT521)&nbsp;</td><td>ビオラミナ&nbsp;&nbsp;</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td>ヒト組換えラミニン521&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>肺線維芽細胞</td><td>生物製剤</td><td>H6013</td><td></td></tr><tr><td>肺線維芽細胞</td>ライフ<td>ライン細胞技術</td><td>FC-0049</td><td></td></tr>肺<tr><td>微小血管内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>肺平滑筋細胞ライフ</td><td>ライン細胞技術</td><td>FC-0046</td><td></td></tr><tr><td>手動カウンター&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Masterflex (TPE) トランスファーチューブ&nbsp;</td><td>コールパー</td><td>マーFV-96880-02</td><td>PharMed BPT、1/32 "ID×5/32"OD</td></tr><tr><td>ミディアム199、フェノールレッドサー</td><td>モなし&nbsp;</td><td></td><td></td>11043023</tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;&nbsp;</td><td>1.5mL、滅菌&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡(カメラ付き)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>明視野イメージング用&nbsp;</td></tr><tr><td>N2</td><td>Sigma</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma</td><td>A5099</td><td></td></tr><tr><td>Noggin (HEK293T コンディショニング メディウム)</td><td>Sigma</td><td>N17001</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ヤギ セラム&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>50062Z&nbsp;</td><td>ブロッキングソリューション&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>O-ホスホスリルエタノールアミン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (4% wt/vol)&nbsp;&nbsp;</td><td>EMS&nbsp;</td><td>15710&nbsp;</td><td>固定剤&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>10,000 U/mL; 10 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>ピペットのヒント&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>P20、P200、P1000&nbsp;滅菌、低接着</td></tr><tr><td>ピペット&nbsp;</td><td>ギルソン&nbsp;</td><td>&nbsp;F167380&nbsp;</td><td>P20、P200、P1000&nbsp;</td></tr><tr><td>PluriQ Serum Replacement (またはまたはKO Serum Replacement)</td><td>AMSBIO (or Thermo)</td><td>N/A (or C1910828010)</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine coated microscope glass slides&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P0425&nbsp;</td><td>スライドガラス&nbsp;</td></tr><tr><td>プリモシン</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>プロロング ゴールド&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>P36931&nbsp;</td><td>DAPI付き退色防止封入剤&nbsp;</td></tr><tr><td>レチノイン酸&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ROCK阻害剤(Y27632)</td><td>Tocris</td><td>TB1254-GMP/10</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin(HEK293T Conditioning medium)</td><td>Sigma</td><td>SCC111</td><td></td></tr><tr><td>SAGM SingleQuotsサプリメント&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>CC-4124</td><td></td></tr><tr><td>SAGMTM 小気道上皮細胞増殖培地 BulletKitTM&nbsp;</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td>ミディアムサプリメント&nbsp;</td></tr><tr><td>SB2001190&nbsp;</td><td>トクリス&nbsp;</td><td>1264/10</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>2 mL、5 mL、10 mL、および25 mLの低エンドトキシン、滅菌&nbsp;</td></tr><tr><td>小気道上皮細胞増殖培地(SAGM)</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ソルベントバッファー(ER-2)&nbsp;</td><td>エミュレート&nbsp;</td><td>10462</td><td>25 mLボトル&nbsp;</td></tr><tr><td>ステリフリップ-HV&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>SE1M003M00</td><td>滅菌ろ過円錐管</td></tr><tr><td>Sterilin 100 mm角シャーレ</td><td>Thermo</td><td>103</td>滅菌<td>、6チップごとに1つ&nbsp;</td></tr><tr><td>T25フラスコ&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>T75フラスコ&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>トリヨードチロニン</td><td>Σ</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (0.3% (vol/vol)&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>T8787&nbsp;</td><td>透過剤&nbsp;</td></tr><tr><td>トリパンブルー&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>93595&nbsp;</td><td>0.4%溶液&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypEEソリューション&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>12604013&nbsp;</td><td>細胞剥離ソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>トゥイーン-20&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P2287&nbsp;</td><td>透過剤&nbsp;</td></tr><tr><td>UVライトオーブン(ピーク周波数365nm、強度100 & マイクロ;J/cm2)</td><td>VWR</td><td>21474-598</td><td>UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L</td></tr><tr><td>真空セットアップ&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>最低圧力:-70 kPa&nbsp;</td></tr><tr><td>血管内皮増殖因子165(VEGF-165)ヒト、大腸菌の組換え</td><td>PromoCell</td><td>C-64420</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-165&nbsp;&nbsp;</td><td>プロモーションセル&nbsp;&nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>ミディアムサプリメント&nbsp;</td></tr><tr><td>フォン・ヴィレブランド因子共役FITC&nbsp;&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab8822&nbsp;</td><td>ヒツジポリクローナル抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ウォーターバス(またはビーズ)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>37 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Wnt3A(L-Wnt3A調整媒体)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr></tbody></table>

オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

ほぼすべての人間の臓器は上皮組織で裏打ちされており、3次元(3D)構造に編成された緊密に接続された細胞の1つまたは複数の層で構成されています。上皮の主な機能の1つは、下線組織を物理的および化学的傷害および感染性病原体から保護する障壁の形成である。さらに、上皮は栄養素、ホルモン、およびその他のシグナル伝達分子の輸送を媒介し、多くの場合、臓器内の細胞の位置決めと区画化を導く生化学的勾配を作成します。上皮は、臓器の構造と機能を決定する上で中心的な役割を果たすため、動物モデルでは必ずしも捕捉されない多くのヒト疾患の重要な治療標的です。明らかな種間の違いに加えて、動物の上皮のバリア機能と輸送特性に関する調査研究を行うことは、生体系でこれらの組織にアクセスすることの難しさによってさらに悪化します。二次元(2D)ヒト細胞培養は、基本的な科学的質問に答えるのに役立ちますが、 in vivo での予測が不十分であることがよくあります。これらの制限を克服するために、過去10年間で、臓器チップとして知られる多数のマイクロエンジニアリングされた生体模倣プラットフォームが、従来の in vitro および動物実験の有望な代替手段として浮上しました。ここでは、皮膚、肺、腸などの臓器特異的な上皮組織をモデル化するために設計されたプラットフォームであるオープントップ臓器チップ(またはオープントップチップ)について説明します。このチップは、機械的に活性なシステム内に組織特異的な線維芽細胞と内皮細胞を組み込むことによって3D間質成分を再現する機能を含む、上皮組織の多細胞構造と機能を再構成するための新しい機会を提供します。このOpen-Top Chipは、単一細胞から多層組織構築物まで、複数の解像度スケールで上皮/間葉系および血管の相互作用を研究するための前例のないツールを提供し、健康と疾患における上皮化臓器の細胞間クロストークの分子解剖を可能にします。

表面マイクロパターニング 細胞外マトリックス(ECM)のマイクロパターニングは、腸陰窩界面の空間的構成を複製するために使用することができる。Open-Top Chipの構成を変更して、結腸上皮-間質界面の自然なトポグラフィー(図6A、B)とマイクロメートルスケールの腸陰窩(図6C-E)を模倣するように特別に設計されたマイクロパターンスタンプを統合することができます。皮膚、気道、肺胞のモデルには平らな(パターン化されていない)表面を使用したことに注意してください。このスタンプをこの際に用いて、種子上皮細胞に対して均一なヒドロゲル表面を得た。私たちは、腸の陰窩を模倣した正と負のドームの交互からなる、人間の腸粘膜の自然な構造を模倣できるデザインを選択しました。
臓器モデル Open-Top ...

本プロトコルは、初代組織(皮膚、肺胞、気道、および腸)の全層臓器チップ培養の確立と成熟を成功させるためのOpen-Top Organ-Chipの機能と本質的な培養モダリティを説明し、ヒトの上皮/間葉系および血管ニッチ界面のさまざまな機能的側面をin vitroで調査する機会を提供します。

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

従来の拡散培養法では、生体臓器の複雑な環境を再現できないことが多く、組織特異的なマーカーや機能が失われていました。私たちは、拡散培養とマイクロ流体原理を組み合わせて、上皮組織の微小環境を厳密に模倣するオープントップチップを開発しました。生体臓器に自然に存在するが、従来のin vitroモデルでは無視されがちな生化学的および生体力学的手がかりを含めることにより、オープントップチップはクローズドシステム間のより良い代替手段となります。手順を実演するのは、今日、私の研究室の研究生であるアディア・パンチャルです。はじめに、必要な試薬を氷上のバイオセーフティキャビネットの下に置きます。組織特異的間葉系細胞を培養して80%〜90%のコンフルエント性を得た後、メーカーの推奨に従ってトリプシンまたは他の方法を使用して細胞を解離します。細胞を250gで摂氏24度で5分間ペレット化します。細胞ペレットを氷冷した10X EMEMおよび再構成バッファーのそれぞれ225マイクロリットルに再懸濁します。ピペッティングによって細胞を混合し、1, 800マイクロリットルの氷冷コラーゲン1溶液を加える。次に、プレゲル溶液を氷上で5〜6回ピペッティングして混合します。プレゲル溶液を18マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウム1個で中和し、ピペッティングで穏やかに混合した後、気泡を避けながら150マイクロリットルの細胞含有ヒドロゲルをオープントップチップの中央チャンバーにピペットで入れます。各ペトリ皿に2ミリリットルの滅菌二重蒸留水で満たされた遠心分離管キャップを含む、チップを別々のペトリ皿にグループ化し、摂氏37度と5%二酸化炭素でペトリ皿をインキュベートします。ストローマヒドロゲルの表面マイクロパターニングを行うには、滅菌3Dプリントスタンプのパターン化された表面に中和コラーゲン1プレゲル溶液20マイクロリットルをピペットで移し、ストローマヒドロゲルがまだ液体の形である間にオープントップチャンバー内にスタンプを挿入します。アスピレーターを使用して、オープントップチャンバーの上部からこぼれる可能性のあるヒドロゲルの残留物を取り除きます。前に示したように、すべてのチップを水で満たされた円錐形のチューブキャップを備えた別々のペトリ皿にグループ化します。そして、すべてのペトリ皿を摂氏37度と5%二酸化炭素で90分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、チップをバイオセーフティキャビネットの下に戻し、精密ピンセットを使用してスタンプをそっと取り除き、ヒドロゲルを損傷するリスクを減らします。培養細胞が80%から90%のコンフルエントに達したら、細胞提供者が推奨するタンパク質分解酵素手順を使用して細胞を解離します。解離後、遠心分離によって細胞をペレット化し、原稿に記載されているように適切な細胞断片密度に上皮細胞を再懸濁する。上皮細胞を播種するには、チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、間質表面を100マイクロリットルの新鮮な上皮細胞培養培地で3回すすぎ、余分なコーティング溶液を取り除きます。リンス媒体が吸引されたら、適切な細胞密度を使用して50マイクロリットルの上皮細胞懸濁液をヒドロゲル表面に播種し、チップをインキュベーターに2時間戻します。細胞の破片を除去するには、細胞培養培地でヒドロゲル表面を2回穏やかにすすぎ、密閉されたオートクレーブ可能な容器でオートクレーブして培地をリフレッシュし、チップを蠕動ポンプに接続します。ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移した後、上部のリザーバーに残っている培地の量を取り除きます。次に、上部のマイクロ流体チャネルからすべての媒体を穏やかに吸引し、バインダークリップを使用して上部の入口に接続された短いマイクロ流体チューブをクランプして、媒体の蒸発と気液界面(ALI)の維持を減らします。オープントップチップをハウジングキャリアに置き、インキュベーターに戻します。チップをペリスタルティックポンプに再接続し、ペリスタルティックポンプを始動して流れを再開します。血管室を内皮細胞培養培地ですすぎ、次いで25マイクロリットルの内皮細胞懸濁液を播種する。チップを逆さまにして、内皮細胞がマイクロ流体チャンバーの上面に付着できるようにします。チップをペトリ皿にグループ化します。前に示したようにそれらをインキュベーターに戻し、内皮細胞を1時間付着させます。インキュベーションの最後に、チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、血管チャネルを内皮細胞培養培地で2回すすぎ、細胞の破片を除去します。血管チャネルの底面への内皮細胞の接着を容易にするために、チップを平らに置く。バイオセーフティキャビネットの下の脱気された血管細胞培養培地で血管培地リザーバーを満たします。チップをチップハウジングキャリア内に戻し、チップを一方の端の媒体リザーバーともう一方の端のペリスタルティックポンプに再接続します。マイクロ流体接続を検査して、すべてのチップが正しく接続され、媒体の滴りの目に見える液滴がないことを確認します。次に、蠕動ポンプを始動して流体の流れを再開します。細胞の有無にかかわらず、マイクロパターン化されたゲル表面が視覚化されます。組織学的分析により、チップ上で分化した成熟した多層層状表皮が明らかになりました。皮膚チップの上面図は、真皮層の内側の線維芽細胞の存在を示した。PECAM-1、VE-cadherin、およびvon Willebrandは、オープントップスキンチップで共培養したヒト微小血管内皮細胞の分化を示しました。MUC5AC、αおよびβチューブリン、クロロ細胞タンパク質16、p63、およびZO-1蛍光染色は、成熟気道上皮を示した。拍動繊毛と分化した成熟擬似重層上皮がオープントップ気道チップで観察されました。I型、II型、およびE-カドヘリン蛍光染色では、チップ上に成熟肺細胞の存在が示されました。電子顕微鏡検査は、成熟した肺胞表現型の証拠である微絨毛およびリソソーム小胞の存在を明らかにした。組織学的解析では、I型表現型と一致する扁平扁平上皮細胞、II型表現型と一致する直方体玉石様細胞、および真皮層内の線維芽細胞の存在が示されました。腸細胞および成熟杯の存在は、ムチン2およびE-カドヘリン染色によって確認された。真皮層内部の線維芽細胞は単純な円柱状上皮の存在を確認した。すべての試薬は冷たくなければならず、ゲルの表面は十分にすすがれて均一な表面を得る必要があります。接着していない細胞や破片を取り除き、細胞接着を均一にし、コンパクトな汚れた単層と血管壁を得ることが重要です。同様のアプローチを使用して、腸や肺などの他のタイプの上皮器官モデルを生成し、特定の薬物または環境要因がヒト組織の恒常性にどのように影響するかを評価し、特に上皮および血管バリア機能に重点を置くことができます。間質コンパートメントの有効性段階に簡単にアクセスできるため、研究は特定の顔パターンを生成し、他のデバイスでは達成が困難なcryptviveoliなどの機能的な組織構造を再現できるようになりました。

reconstituting-cytoarchitecture-function-human-epithelial-tissues-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。...

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

ここでは、初代細胞、組織モデル、パンチ生検をマイクロ流体多臓器チップで最大28日間共培養するプロトコールを紹介します。ヒト真皮微小血管内皮細胞、肝臓凝集体、および皮膚生検は、共通の培地循環で成功裏に組み合わせられました。...

多臓器チップ - 長期マルチ組織の共培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。...

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

この文書では、内皮下電気抵抗 (TEER) の直接定量の統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの作製について説明します。検証、このマイクロ流体デバイス内部の血液-脳関門をまねて、そのバリア機能をモニターしていた。電極の統合及び直接 TEER...

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

ここでは、伸縮性、デュアル チャネルの作製、臓器レベルの機能体外の概説のため器官チップ マイクロ細胞培養装置を記述するプロトコルを提案する.

伸縮性、デュアル チャネル、オルガン マイクロ流体チップのスケーラブルな作製

血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。...

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

イヌ腸オルガノイドとGut-on-a-Chipマイクロ流体システムの統合により、ヒトの腸疾患に関連するトランスレーショナルモデルが提供されます。提示されたプロトコルは、腸の3D形態形成と動的 in vitro モデリングを可能にし、One...

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

当社の詳細なプロトコルは、3D構造とさまざまな細胞タイプでヒトの腸粘膜をシミュレートし、微生物のコロニー形成に応答した免疫応答と細胞機能の詳細な分析を可能にする高度な腸オンチップモデルの作成と使用について概説しています。...

腸粘膜免疫応答を解析するための免疫適格腸内チップモデル

ポリジメチルシロキサン(PDMS)チップデバイスの膜用防水シリコーン系シールを製造するための新しいシーリングプロトコル。ラボでのチップモデルの構築や小規模なチッププラットフォーム開発を目的としています。このプロトコルはプラスチックとネイティブ組織膜を用いて実証します。この手順にはPDMS、トルエン、型、膜、真空チャンバーのみが必要です。...

柔軟で信頼性の高い接着のためのシリコーンチップ・トゥ・膜シールのアクセスしやすい手順

学ぶオープントップ臓器チップを用いたヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成法。皮膚・肺・気道・腸などの組織特異的マーカーと機能を維持し、生体内微小環境を再現する革新的なオルガノイド培養技術です。

オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成

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