実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

実験的自己免疫性脳脊髄炎またはEAEは、多発性硬化症患者の新しく改良された治療法を開発するために使用される動物モデルです。EAEで疾患を誘発するには、一貫した結果を得るために完璧な油と水のエマルジョンが必要です。ここで提示するエマルジョン調製方法は、人間の影響を伴わないため、ある実験から別の実験への矛盾が制限される。

この方法はEAE用に最適化されていますが、他の自己免疫疾患モデルやがんワクチンの試験にも使用できます。7ミリリットルのチューブに100ミリグラムの凍結乾燥M結核H37 RAおよび5つの3.2ミリメートルのスチールビーズでCFAスラリーを調製した。ホモジナイザーでチューブを最高速度設定で60秒間振とうします。

5ミリリットルのIFAアジュバントをチューブに加え、最高速度で60秒間再び振とうします。次に、ビーズを残してピペットでスラリーを新しいチューブに移し、使用するまで摂氏4度で保管します。CFA/ペプチドエマルジョンを調製するには、補足ファイル1をダウンロードして、各試薬に必要な量を計算してください。

次に、使用するスクリューキャップ付きチューブと試薬を氷上に置きます。次に、エマルジョン成分を添加する。最初にPBS、次にペプチド、CFAスラリー。

そして最後に、IFA。キャップを数回締めたり緩めたりして、キャップ付きのチューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬をプレミックスします。

チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高設定に設定し、時間を60秒に設定します。ランニングが終了したら、チューブを氷の上に3分間置き、同じ設定でさらに1〜2回ランを繰り返します。

チューブを1分から300Gで遠心分離し、閉じ込められた空気を除去し、エマルジョンを圧縮します。チューブからキャップを取り外します。プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。

チューブの下部にあるスナップオフエンクロージャをねじって取り外します。次に、すべての注射器からプランジャーを取り外し、注射注射器に針を追加します。次に、注射器の背面をチューブの下部にある専用ロックに取り付け、短いひねりでロックします。

プランジャーを軽く押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射器の0.15ミリリットルの目盛りに達したら停止する。注射シリンジをチューブから分離し、このシリンジに空気が入らないように注意しながらプランジャーを挿入します。

エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押し、チューブ内に存在する残りのエマルジョンに対してこのプロセスを繰り返します。水と油の粒子のサイズを分析するには、顕微鏡のスライドにエマルジョンの小さな滴を追加し、カバースリップで塗りつけてから、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。塗抹したエマルジョンを400倍の倍率の位相差顕微鏡で調べ、エマルジョンの単層のあるフィールドに焦点を合わせます。

小さい、均一な、灰色または白い粒子が見えることを確認してください。均質化法によって製造されたエマルジョンは、水と油のエマルジョンの小さな液滴を表す灰色または白豆の形をした粒子を示しました。対照的に、シリンジ法を使用して生成されたエマルジョン液滴は、より大きく、より広くなりました。

ボルテックス法では、エマルション中に捕捉された気泡に対応する大きな灰色または黒色の粒子が観察された。水および油エマルジョンのレーザー屈折式粒度分析装置を用いて測定した経時的な粒度分布の変化は、6週間にわたって粒径の変化を示さなかった。新鮮な3週齢および15週齢のエマルジョンはすべて、実験全体を通して試験されたすべての動物において同様のEAE疾患を誘発した。

マウスはすべての実験で同様の疾患パターンを発症し、ここに提示されたホモジナイズ法が一貫した再現性のある方法でEAEを誘導するエマルジョンを生成することを明らかにしました。実験用のエマルジョンを作る前に、補足ファイル番号1をダウンロードして、廃棄物を最小限に抑えるために必要な各成分の量を計算してください。ここで紹介した方法は、前臨床研究だけでなく、将来的には臨床でがんワクチンを調製するためのエマルジョン調製の標準化にも使用できる可能性があります。