実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法
December 9th, 2022
多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。
実験的自己免疫性脳脊髄炎またはEAEは、多発性硬化症患者の新しく改良された治療法を開発するために使用される動物モデルです。EAEで疾患を誘発するには、一貫した結果を得るために完璧な油と水のエマルジョンが必要です。ここで提示するエマルジョン調製方法は、人間の影響を伴わないため、ある実験から別の実験への矛盾が制限される。
この方法はEAE用に最適化されていますが、他の自己免疫疾患モデルやがんワクチンの試験にも使用できます。7ミリリットルのチューブに100ミリグラムの凍結乾燥M結核H37 RAおよび5つの3.2ミリメートルのスチールビーズでCFAスラリーを調製した。ホモジナイザーでチューブを最高速度設定で60秒間振とうします。
5ミリリットルのIFAアジュバントをチューブに加え、最高速度で60秒間再び振とうします。次に、ビーズを残してピペットでスラリーを新しいチューブに移し、使用するまで摂氏4度で保管します。CFA/ペプチドエマルジョンを調製するには、補足ファイル1をダウンロードして、各試薬に必要な量を計算してください。
次に、使用するスクリューキャップ付きチューブと試薬を氷上に置きます。次に、エマルジョン成分を添加する。最初にPBS、次にペプチド、CFAスラリー。
そして最後に、IFA。キャップを数回締めたり緩めたりして、キャップ付きのチューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬をプレミックスします。
チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高設定に設定し、時間を60秒に設定します。ランニングが終了したら、チューブを氷の上に3分間置き、同じ設定でさらに1〜2回ランを繰り返します。
チューブを1分から300Gで遠心分離し、閉じ込められた空気を除去し、エマルジョンを圧縮します。チューブからキャップを取り外します。プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。
チューブの下部にあるスナップオフエンクロージャをねじって取り外します。次に、すべての注射器からプランジャーを取り外し、注射注射器に針を追加します。次に、注射器の背面をチューブの下部にある専用ロックに取り付け、短いひねりでロックします。
プランジャーを軽く押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射器の0.15ミリリットルの目盛りに達したら停止する。注射シリンジをチューブから分離し、このシリンジに空気が入らないように注意しながらプランジャーを挿入します。
エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押し、チューブ内に存在する残りのエマルジョンに対してこのプロセスを繰り返します。水と油の粒子のサイズを分析するには、顕微鏡のスライドにエマルジョンの小さな滴を追加し、カバースリップで塗りつけてから、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。塗抹したエマルジョンを400倍の倍率の位相差顕微鏡で調べ、エマルジョンの単層のあるフィールドに焦点を合わせます。
小さい、均一な、灰色または白い粒子が見えることを確認してください。均質化法によって製造されたエマルジョンは、水と油のエマルジョンの小さな液滴を表す灰色または白豆の形をした粒子を示しました。対照的に、シリンジ法を使用して生成されたエマルジョン液滴は、より大きく、より広くなりました。
ボルテックス法では、エマルション中に捕捉された気泡に対応する大きな灰色または黒色の粒子が観察された。水および油エマルジョンのレーザー屈折式粒度分析装置を用いて測定した経時的な粒度分布の変化は、6週間にわたって粒径の変化を示さなかった。新鮮な3週齢および15週齢のエマルジョンはすべて、実験全体を通して試験されたすべての動物において同様のEAE疾患を誘発した。
マウスはすべての実験で同様の疾患パターンを発症し、ここに提示されたホモジナイズ法が一貫した再現性のある方法でEAEを誘導するエマルジョンを生成することを明らかにしました。実験用のエマルジョンを作る前に、補足ファイル番号1をダウンロードして、廃棄物を最小限に抑えるために必要な各成分の量を計算してください。ここで紹介した方法は、前臨床研究だけでなく、将来的には臨床でがんワクチンを調製するためのエマルジョン調製の標準化にも使用できる可能性があります。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を誘発するための水油エマルジョンの標準化された準備方法を提示します。この方法は、エマルジョン準備中に人間の影響を最小限に抑えることで、結果の変動性を減少させることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫学
- 自己免疫疾患研究
背景
- 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は多発性硬化症の研究に使用されます。
- 一貫したエマルジョンの準備は、信頼性の高い実験結果に不可欠です。
- 現在の方法は大きく異なる可能性があり、再現性に影響を与えています。
- この研究では、迅速で簡単なホモジネーションプロトコルを導入します。
研究の目的
- エマルジョンの準備のための標準化された方法を提示すること。
- EAE誘発の変動性を減少させること。
- 他の自己免疫モデルやがんワクチンのテストに適用可能なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 凍結乾燥したM tuberculosis H37 RAを使用したCFAスラリーの準備。
- エマルジョンの準備に鋼ビーズとホモジナイザーの使用。
- 一貫性のために振とう時間と速度の最適化。
- EAEと他のモデルへの方法の適用。
主な結果
- この方法は、EAE誘発に適した安定したエマルジョンを生成しました。
- 人間の影響を減少させることで、より一貫した実験結果につながりました。
- 他の自己免疫疾患モデルへの適用可能性を実証しました。
- がんワクチンのテストへの潜在的な使用が注目されました。
結論
- 標準化されたエマルジョンの準備方法は、EAE研究における再現性を向上させます。
- このアプローチは様々な研究用途に適応できます。
- 将来の研究は、このプロトコルを利用して実験結果を改善する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
