Name: 実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘導のための標準化されたホモジナイズ法。Mycobacterium tuberculosis H37 RAとスチールビーズを用いた水包油エマルジョン調製により、結果の再現性を向上させる。

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著者は、ルンド大学の動物飼育ユニットであるカミラ・ビョルクレフとアグニエシュカ・チョペックの支援、および英国オックスフォード大学ケネディリウマチ研究所のリチャード・ウィリアムズがこの原稿の作成について建設的な批判と言語的支援を行ったことに感謝したいと思います。

すべての動物の手順は、スウェーデン動物研究委員会の慣行に従って実行され、スウェーデンのルンドマルメにある動物倫理委員会によって承認されました(許可番号:M126-16)。
注: この方法の概略フローを 図 1 に示します。
1.材料の準備
注:すべての試薬を滅菌フードで無菌的に調製し、指定された温度で分注して保管します。試薬は、効果を失うことなく最大2年間保存できます。
<ol><li>下記のように、20 mg/mLの結核菌 を含むCFAを調製します。<ol><li>100 mgの凍結乾燥 結核菌 H37RA(材料 表を参照)と5つの3.2 mmスチールビーズを7 mLチューブ( 材料表を参照)に加えます。チューブをホモジナイザー( 材料表を参照)で最高速度設定(5,000 rpm)で60秒間振とうします。</li>
		<li>5 mLの不完全なフロイントアジュバント(IFA)をチューブに加え、最高速度で60秒間再び振とうします。IFA(現在はCFAと名付けられています)で均質化された 結核菌 のスラリーを、ビーズを残してピペット付きの新しいチューブに移し、使用するまで4°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>MOG35-55 ペプチドの凍結乾燥粉末( 材料表参照)に超純水を加え、最終ペプチド濃度10mg/mLを得た。溶液を0.2μmのフィルターに通して滅菌します。60 μLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。 注:この実験に使用したMOG35-55 ペプチドは、ImmunoGrade純度(~70%)であり、TFA切断され、水に容易に溶解し、C末端アミド(-NH2)を含むため、 生体内 安定性が向上します14。ペプチドアリコートは、2回以上解凍および再凍結することはなく、使用するまで-20°Cで保存した。</li>
	<li>100 mLの百日咳毒素バッファーを調製する:2.9 gのNaClを80 mLの1x Ca2+/Mg2+ 遊離PBSに溶解し、100 μLの10%Triton X-100を加えます。PBSで容量を100 mLに調整し、0.2 μmのフィルターに通して溶液を滅菌します。10 mLアリコートを準備し、使用するまで4°Cで保存します。</li>
</ol>2. CFA/ペプチドエマルジョンの調製
<ol><li>予防接種に必要なエマルジョンの量を計算します。この標準プロトコルでは、各マウスは、フロイントアジュバント(CFA)に分散した50μgのMOG35-55 ペプチドおよび300μgの 結核菌 を投与されます。エマルジョンの調製に必要な各試薬(MOG35-55 ペプチド、PBS、CFA、およびIFA)の量は、 補足ファイル1を使用して計算できます。エマルジョンのわずかな損失を補うために、全試薬の追加の20%が計算に含まれます。 注:この研究で使用された市販のエマルジョンキット( 材料表を参照)は、滅菌ポーチ内のチューブ、スクリューキャップ、およびプランジャーで構成されています。エマルジョンキットの各チューブは最大9.6 mLを保持し、40匹のマウス(または1匹あたり100 μLのエマルジョンを使用する場合は80匹)の免疫に十分な8 x 1 mLシリンジを準備することができます。</li>
	<li>スクリューキャップ付きチューブ(市販のエマルジョンキットから)と使用する試薬を氷上に置きます。</li>
	<li>ステップ2.1で計算された容量に次の順序でエマルジョン成分を追加します:PBS、次にペプチド、次にCFAの 結核菌 、最後にIFAです。</li>
	<li>キャップを数回締めたり緩めたりして、キャップ付きのチューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬を事前に混合します。</li>
	<li>チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高設定に設定し、時間を60秒に設定します。実行が終了したら、チューブを氷の上に3分間置きます。同じ設定でさらに1〜2回実行を繰り返します。</li>
	<li>チューブを300 x g で1分間遠心分離して、閉じ込められた空気を取り除き、エマルジョンを圧縮します。</li>
	<li>チューブからキャップを外し、プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。チューブの下部にあるスナップオフクロージャーをねじって取り外します。</li>
	<li>注射器からプランジャーを取り外します(1 mL; 材料の表を参照)。注射器に針(好ましくは25〜27G)を加える。</li>
	<li>注射器の後端をチューブの下部にある専用ロックに取り付け、短いひねりでロックします。</li>
	<li>プランジャーを軽く押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射器の0.15mL目盛りに達したら停止します。.</li>
	<li>注射器をチューブから分離し、空気が注射器に入らないように注意しながら、プランジャーを慎重に挿入します。エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押します。 注:この時点で、エマルジョンの一部を品質管理に使用できます(ステップ3を参照)。</li>
	<li>チューブ内に存在する残りのエマルジョンについて、手順2.8〜2.11を繰り返します。 注:高価なCFA/抗原エマルジョンの無駄を最小限に抑えるために、1mLシリンジを使用する必要があります。チューブの底部にある専用ロックに適合する他のシリンジを使用してもよい。しかしながら、より大きな体積のエマルジョンを調製する必要があるかもしれない。CFA/MOG35-55 ペプチドエマルジョンは、EAE誘導能を失うことなく、4°Cで最大15週間保存できます。</li>
</ol>3.エマルジョンの品質管理
<ol><li>落下試験:20mLの冷水で満たされた滅菌済みの50mLコニカルチューブに少量のエマルジョンを追加します。チューブを閉じて、手で数秒間振ってください。小さな明確な液滴の出現は、油中水型エマルジョンの形成を裏付けています。</li>
	<li>位相差顕微鏡を用いてエマルションを調べる。<ol><li>油中水粒子のサイズを分析するには、顕微鏡スライドにエマルジョンの小さな滴(2〜3 μL)を加え、カバースリップで塗りつけてから、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。</li>
		<li>塗抹されたエマルジョンを400倍の倍率の位相差顕微鏡( 材料表を参照)で調べ、エマルジョンの単層を有するフィールドに焦点を合わせる。小さな均一な灰色/白の粒子が見えることを確認します(図2A)。</li>
	</ol></li>
	<li>レーザー回折を用いてエマルジョン粒子径を分析します。 注:レーザー回折は、レーザービームを使用して粒度分布を測定します。これは、エマルジョンの究極の品質管理テストです。ここで記載した方法を用いた粒度分布の代表的な結果を 図2B に示す(詳細な説明については、Topping et al.6を参照されたい)。それにもかかわらず、落下試験および顕微鏡検査は、満足のいくエマルジョンが形成されたかどうかを検証するのに十分である。<ol><li>粒度分析計(材料表を参照)では、分散剤の赤色レーザーと青色レーザーの両方の屈折率を1.456に設定し、サンプルの屈折率を1.33に設定します(材料表を参照)。屈折率の吸光度を0.02に設定します。</li>
		<li>ペプチドエマルジョンを含むシリンジから軽質鉱物油を含む分散ユニットに1滴加えます。エマルジョンの分散後すぐにデータ収集を開始します。 注:粒度分布の推定には、汎用モデルを適用し、球状粒子を想定しました。</li>
	</ol></li>
</ol>4. C57BL6/JマウスにおけるMOG 35-55 ペプチドエマルジョンを用いたEAE誘導
注:すべての実験において、5匹の8〜12週齢の雌C57BL6 / Jマウスが使用されました。
<ol><li>免疫の前に、2.5%気化したイソフルランを用いてマウスを麻酔し、しっかりとつま先ピンチを用いて確認する。</li>
	<li>1 mLシリンジを使用して各マウスを後腹の右側と左側の2つの異なる部位に、50 μgのMOG35-55 ペプチドを1:1(v / v)比のペプチド/ CFAで含む200 μLのエマルジョンを皮下注射します。</li>
	<li>エマルジョンによる免疫の少なくとも1.5時間後、および24時間後に、腹腔内注射(左側に100 μL、右側に100 μL)を介して、各マウスに200 μLの百日咳毒素中の百日咳菌菌の合計80 ngを投与します。 注:百日咳毒素による腹腔内注射の正確な局在化は、排液リンパ節15におけるT細胞の活性化に不可欠であることが示されている。</li>
	<li>オプション:ステップ4.2を繰り返して、7日目(一部のプロトコル16で使用されているように)にMOG35-55ペプチドを再度注入します。 注意: 最も重要なことは、MOG / CFAまたは百日咳毒素を含む予防接種に使用される注射器と針がバイオハザードバッグ/容器に適切に廃棄されていることを確認することです。</li>
	<li>前述のように0〜6のスケールを使用して、臨床スコアを毎日評価します6。</li>
</ol>

<ol><li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide%3A+Insights+from+the+Atlas+of+MS%2C+third+edition%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li>
<li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis%3A+identity%2C+mechanisms+and+potential+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760(2020).</li>
<li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+No+One%2C+and+One+Hundred+Thousand%3A+T+Regulatory+Cells%27+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947(2019).</li>
<li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li>
<li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li>
<li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251(2022).</li>
<li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen%2Fadjuvant+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li>
<li>Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li>
<li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li>
<li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+neuritis%3A+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li>
<li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+%28H-2%29+type%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li>
<li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).</li>
<li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li>
<li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1%2827-35%29+peptide%3A+implications+for+peptide+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li>
<li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li>
<li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li>
<li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778(2012).</li>
<li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603(2022).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612(2022).</li>
<li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li>
</ol>

BTB Emulsions ABは、動物およびヒトの免疫化ならびにエマルジョンを調製するための装置および方法の使用に関する特許出願を提出した(欧州特許出願番号:EP3836884A1)。BTBは同社のCEO兼創設者であり、BTBエマルジョンの株主です。ベルタン・インスツルメンツは、この出版物で使用されているエマルジョンキットを世界中に配布しています。

抗原/フロイントアジュバントなどの油中水型エマルジョンは、EAE17を誘導するために半世紀以上にわたって使用されてきました。現在、ヒトの影響に依存しない抗原乳剤を調製するための標準化された方法はありません。シリンジを使用した手動混合はほとんどの研究室で標準的ですが、この方法は時間がかかり、多くの場合、材料の過度の損失をもたらし、品質は準備する科学者によって異なります。
この原稿で提示された方法は、標準的な振とうホモジナイズマシンを使用して抗原/ CFAエマルジョンを調製します。さらに、ここで使用されるすべての試薬は、分注して長期間保存できるため、エマルジョンの調製が便利で迅速になります。最大80匹のマウスのエマルジョンを調製するための合計時間は約30分です。これは、MOG35〜55エマルジョンを調製するために1〜1.5時間を必要とする他の公表された方法とはまったく対照的である16,18。1つのシリ...

免疫寛容の崩壊は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫疾患の発生につながる可能性があります。世界中で280万人がMSとともに生活していると推定されています1。MSの正確な原因はまだほとんど不明ですが、自己反応性T細胞とB細胞の調節不全、およびTreg機能の欠陥は、疾患の病因に重要な役割を果たしています2,3。
自己免疫疾患の動物モデルは、潜在的な治療法を調査するために不可欠なツールです。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルは、MS4に関心のある研究者によってほぼ1世紀にわたって使用されてきました。初期の実験では、この病気の発生率は比較的低かった。 マイコバクテリウム と百日咳毒素を含む完全フロイントアジュバント(CFA)の導入により、マウスにおけるEAEの一貫した誘導が可能になりました4。最も重要なことは、CFAを中枢神経系(CNS)特異的抗原と混合して、EAEを誘導するための均質な油中水型エマルジョンを生成する必要があることです。現在利用可能な最も一般的なEAEモデルは、脳原性ペプチドによるマウスの能動免疫に基づいています。マウスの遺伝的背景は疾患感受性に重要な役割を果たしており、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)およびミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP139-151)ペプチドは、それぞれC57BL/6JおよびSJLマウスにおいてEAEを誘導するために用いられている5。しかしながら、他のマウス系統およびCNS由来ペプチドも使用することができる。
CFA/ペプチドエマルジョンの品質は、能動免疫EAEモデルにおける疾患浸透率を決定する重要な要素です6。均質な油中水型エマルジョンは、水性緩衝液に溶解した脳形成ペプチドをCFAと混合することによって調製されなければならず、そうでなければ動物は疾患を発症しないであろう。CFA/ペプチドエマルジョンの調製に関する多数のプロトコルが公開されています。例としては、渦7、超音波処理8、シリンジおよび三方Tコネクタ9、または1つのシリンジのみ5の使用が含まれる。ただし、これらの方法はすべて標準化が難しく、多くの場合、長く複雑なプロトコルに関連付けられています。
上記のすべての方法と比較して、エマルジョン調製のためにここで説明する簡単な方法は、人間の違いがなく、比較的高速であるという利点を提供します。エマルジョンは、設定された速度、時間、温度で試薬を振とうするホモジナイザーによって生成され、高速で一貫した結果を保証します。この方法は、EAEモデルで疾患を誘発するだけでなく、コラーゲン誘発関節炎(CIA)や抗原誘発関節炎(AIA)などの他の自己免疫疾患モデルの研究にも使用できます6。したがって、この方法は、実験的自己免疫性神経炎(EAN)10、実験的自己免疫性甲状腺炎(EAT)11、自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)12、重症筋無力症(MG)13など、自己抗原を含む油中水型エマルジョンに依存する他の動物モデルで疾患を一貫して誘発するために使用できることが期待されます。この方法はまた、遅延型過敏症(DTH)などの一般的な免疫応答を一貫して誘導するため6、癌やマラリアワクチンの送達に使用できる可能性があります(議論を参照)。
したがって、迅速(総調製時間~30分)、単純(すべての試薬を事前に調製して保存することができる)、および標準化された(エマルジョンは振とうホモジナイザーを使用して達成される)方法が開発され、ここに提示されています。このプロトコルを使用して調製されたCFA /抗原エマルジョンは、自己免疫動物モデルで一貫して疾患を誘発します。

<table><tbody><tr><td>1 mL注射器</td>B<td>.ブラウン</td><td>9166017V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 mL注射器シリンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683531</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 空チューブ キャップ付き</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000944LYSK0A.0</td><td>7 mL チューブ</td></tr><tr><td>50 mL 滅菌遠心チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10788561</td><td>50 mLチューブ</td></tr><tr><td>百日咳菌毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2980</td><td>-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>分散剤、軽油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>RTに保管</td></tr><tr><td>エマルジョンキット</td><td>Bertin-Instruments</td><td>D34200.10 ea</td><td>チューブ、キャップ、プランジャーを含む</td></tr><tr><td>不完全なフロイントのアジュバント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;F5506</td><td>+4 >C</td></tr><tr><td>結核菌、H37RA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF3114-33-8</td><td>+4 >C</td></tr><tr><td>マスターサイザー2000&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>N/A</td><td>粒度分析装置</td></tr><tr><td>Minilys-Personal ホモジナイザー</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td>振とうホモジナイザー</td></tr><tr><td>MOG 35-55 ペプチド&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Innovagen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Montanide ISA 51 VG</td><td>Seppic</td><td>36362Z</td><td>FDA承認のオイルアジュバント</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc シリンジ フィルター 0.2 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>17124381</td><td>スターリーフィルター</td></tr><tr><td>PBS、Ca2+/Mg2+ フリー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>位相コンストラスト顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX40-B</td><td></td></tr><tr><td>スチールビーズ 3.2 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0445832</td><td>オートクレーブとRTでの保管</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648463</td><td>RTでの保管</td></tr></tbody></table>

実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)と同様の免疫学的および臨床的特徴を共有しているため、より良い患者治療のための新しい薬物標的を特定するためのモデルとして広く使用されています。MSは、再発寛解型MS(RRMS)、原発性進行型MS(PPMS)、二次進行型MS(SPMS)、およびまれな進行性再発型のMS(PRMS)など、いくつかの異なる疾患経過を特徴としています。動物モデルは、これらの対照的なヒト疾患表現型のすべてを正確に模倣するわけではありませんが、MSのさまざまな臨床症状のいくつかを反映するEAEモデルがあります。例えば、C57BL/6Jマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)誘導性EAEはヒトPPMSを模倣し、SJL/Jマウスのミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP)誘導EAEはRRMSに類似しています。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)などの他の自己抗原、および多数の異なるマウス系統もEAEの研究に使用されます。これらの自己抗原免疫EAEモデルにおいて疾患を誘導するために、油中水型エマルジョンを調製し、皮下注射する。EAEモデルの大部分は、百日咳毒素の注射も必要とします 病気が発症するために。一貫性のある再現性のあるEAE誘導のためには、抗原/アジュバントエマルジョンを製造するための試薬を調製するための詳細なプロトコルが必要です。ここで説明する方法は、標準化された方法を利用して油中水型エマルジョンを生成します。シンプルで高速で、シリンジの代わりに振とうホモジナイザーを使用して品質管理されたエマルジョンを調製します。

CFA/MOGエマルジョンを調製するための迅速でシンプルで標準化されたプロトコルを 図1に示します。この方法は、最近、他の場所6に記載されている。CFA/MOGエマルジョンは、従来のシリンジ法やボルテックス法などの他の方法で調製することもできます。これらの方法は、エマルジョンの品質を評価することによってここで比較されました。すべての方法で油中水型エマルジョンが生成されました。これらのエマルジョンの均質性と品質は、スライドガラス上に小さな滴を加え、続いて位相差顕微鏡で観察することによって評価されました。振とう均質化法で製造されたエマルジョンは、油中水型エマルジョンの小さな液滴を表す灰色/白豆形の粒子を示しました。対照的に、シリンジ法を使用して生成されたエマルジョン液滴は、より大きく、より白色であった。ボルテックス法では、エマルションに閉じ込められた気泡に対応する大きな灰色/黒色の粒子が観察されました(図2A)。
油中水...

多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

実験的自己免疫性脳脊髄炎またはEAEは、多発性硬化症患者の新しく改良された治療法を開発するために使用される動物モデルです。EAEで疾患を誘発するには、一貫した結果を得るために完璧な油と水のエマルジョンが必要です。ここで提示するエマルジョン調製方法は、人間の影響を伴わないため、ある実験から別の実験への矛盾が制限される。この方法はEAE用に最適化されていますが、他の自己免疫疾患モデルやがんワクチンの試験にも使用できます。7ミリリットルのチューブに100ミリグラムの凍結乾燥M結核H37 RAおよび5つの3.2ミリメートルのスチールビーズでCFAスラリーを調製した。ホモジナイザーでチューブを最高速度設定で60秒間振とうします。5ミリリットルのIFAアジュバントをチューブに加え、最高速度で60秒間再び振とうします。次に、ビーズを残してピペットでスラリーを新しいチューブに移し、使用するまで摂氏4度で保管します。CFA/ペプチドエマルジョンを調製するには、補足ファイル1をダウンロードして、各試薬に必要な量を計算してください。次に、使用するスクリューキャップ付きチューブと試薬を氷上に置きます。次に、エマルジョン成分を添加する。最初にPBS、次にペプチド、CFAスラリー。そして最後に、IFA。キャップを数回締めたり緩めたりして、キャップ付きのチューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬をプレミックスします。チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高設定に設定し、時間を60秒に設定します。ランニングが終了したら、チューブを氷の上に3分間置き、同じ設定でさらに1〜2回ランを繰り返します。チューブを1分から300Gで遠心分離し、閉じ込められた空気を除去し、エマルジョンを圧縮します。チューブからキャップを取り外します。プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。チューブの下部にあるスナップオフエンクロージャをねじって取り外します。次に、すべての注射器からプランジャーを取り外し、注射注射器に針を追加します。次に、注射器の背面をチューブの下部にある専用ロックに取り付け、短いひねりでロックします。プランジャーを軽く押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射器の0.15ミリリットルの目盛りに達したら停止する。注射シリンジをチューブから分離し、このシリンジに空気が入らないように注意しながらプランジャーを挿入します。エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押し、チューブ内に存在する残りのエマルジョンに対してこのプロセスを繰り返します。水と油の粒子のサイズを分析するには、顕微鏡のスライドにエマルジョンの小さな滴を追加し、カバースリップで塗りつけてから、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。塗抹したエマルジョンを400倍の倍率の位相差顕微鏡で調べ、エマルジョンの単層のあるフィールドに焦点を合わせます。小さい、均一な、灰色または白い粒子が見えることを確認してください。均質化法によって製造されたエマルジョンは、水と油のエマルジョンの小さな液滴を表す灰色または白豆の形をした粒子を示しました。対照的に、シリンジ法を使用して生成されたエマルジョン液滴は、より大きく、より広くなりました。ボルテックス法では、エマルション中に捕捉された気泡に対応する大きな灰色または黒色の粒子が観察された。水および油エマルジョンのレーザー屈折式粒度分析装置を用いて測定した経時的な粒度分布の変化は、6週間にわたって粒径の変化を示さなかった。新鮮な3週齢および15週齢のエマルジョンはすべて、実験全体を通して試験されたすべての動物において同様のEAE疾患を誘発した。マウスはすべての実験で同様の疾患パターンを発症し、ここに提示されたホモジナイズ法が一貫した再現性のある方法でEAEを誘導するエマルジョンを生成することを明らかにしました。実験用のエマルジョンを作る前に、補足ファイル番号1をダウンロードして、廃棄物を最小限に抑えるために必要な各成分の量を計算してください。ここで紹介した方法は、前臨床研究だけでなく、将来的には臨床でがんワクチンを調製するためのエマルジョン調製の標準化にも使用できる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

DAラットの慢性再発性実験的自己免疫性脳脊髄炎：このビデオでは、多発性硬化症の動物モデルの誘導と臨床スコアを示しています。全体ラット脊髄と完全フロイントアジュバントを含むエマルジョンをラットを免疫することにより誘導される疾患は、、人間の病気に似た臨床症状を示しています。...

誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング

自己免疫性下垂体炎は、マウス下垂体タンパク質の抽出物を注入することにより、マウスで再現することができる。...

実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。...

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

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自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンの調製

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

私たちは、マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を含む融合タンパク質を大量に生成し精製するための基本的な実験装置のみを使用した簡単なプロトコルを記述します。このタンパク質は、T細胞とB細胞の両方によって引き起こされる実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために使用できます。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

ここでは、加熱死菌菌アビウム亜種パラ結核を含む不完全フロイントアジュバントに懸濁した免疫原性エピトープミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を使用して、C57BL/6マウスで実験的自己免疫性脳脊髄炎を積極的に誘導するための代替プロトコルを提示します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における自己抗原の免疫原性増強における 抗酸菌パラ結核の アジュバント活性

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。...

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学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘導のための標準化されたホモジナイズ法。Mycobacterium tuberculosis H37 RAとスチールビーズを用いた水包油エマルジョン調製により、結果の再現性を向上させる。

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