薬物溶出物質の縦断抗菌活性を測定するための新しい方法

このプロトコルでは、ポリマーデバイスから溶出した抗生物質の抗菌効果をリアルタイムでテストし、翻訳価値を高める効果的な製剤を正確に決定するのに役立ちます。この方法により、薬物溶出物質の縦方向の活性を監視し、特定のインプラント製剤の抗菌活性の範囲を理解するためのリアルタイムの抗菌効果試験機能が可能になります。この高分子材料は、ベアリング面としてジョイント交換全体の90%以上で使用されています。

そして、これらの抗生物質溶出製剤は、人工関節周囲感染症の可能な治療法として開発されています。この方法は、多孔質金属、分解性および非分解性ポリマー、ゲル、および材料固有のプロトコル変更を伴う粒子状材料など、あらゆる薬物溶出装置で使用できます。はじめに、1ミリリットルのトリプシン大豆ブロスで細菌を一晩培養します。

次に、一晩増殖した細菌懸濁液を滅菌ミューラーヒントンブロス(MHB)で希釈し、原稿に記載されているように、実験開始前に発光ユニットを使用して生菌数を確認します。バージンと薬物を装填したUHMWPEストリップを3ミリリットルのシリンジに入れます。次に、MHB含有細菌懸濁液を付属の針を通して1.5ミリリットルのマークまでシリンジに引き込みます。

シリンジのセットアップを、指示された6時間の時点まで振とうインキュベーターに置き、その後7日目まで毎日置きます。指示された各時点の後、シリンジのセットアップを取り出し、2ミリリットルのチューブに培地を分注します。原稿に記載されているようなリアルタイムの微生物生存率アッセイを、100マイクロリットルの細菌懸濁液を用いて実施する。

生菌数を決定した後、対応する検量線を用いて発光単位からミリリットル当たりのコロニー形成単位を計算する。検出限界以下の発光値を示したサンプルに生菌が存在しないことを確認するために、トリプシン大豆寒天プレート上に培養物を広げます。プレートを摂氏35度で一晩インキュベートします。

その後、翌日コロニーの存在を確認します。残りの細菌懸濁液を遠心分離する。使用済みのメディアをそっと吸引します。

目に見えないペレットの入ったチューブに100マイクロリットルの上清を残します。ペレット化した細菌を新鮮なMHBに再懸濁します。完全な再懸濁を確実にするために10秒間ボルテックス。

次に、付属の針を通して同じシリンジセットアップに細菌懸濁液を引き込みます。7日目の研究終了後、注射器のセットアップからバージンおよび薬物を装填したUHMWPE表面を取得することから始めます。次に、表面を1.5ミリリットルのチューブに移し、1ミリリットルの滅菌PBSで3回すすぎます。

1ミリリットルの滅菌PBSで40分間表面を超音波処理します。超音波処理されたサンプルの100マイクロリットルで発光アッセイを行うことにより、付着細菌の生存率を決定します。バンコマイシンおよびゲンタマイシン装填UHMWPEからの薬物放出は、6時間でバースト放出を示し、その後7日まで最小阻害濃度を超える濃度で安定した放出速度を示した。

バンコマイシンとゲンタマイシンを含むUHMWPEは、6時間から感受性の高いATCC 12600の3対数以上の減少を示し、3日目に完全な根絶が観察されました。ゲンタマイシン感受性およびバンコマイシン中間株L1163では、両方の薬物溶出物質が6時間で3対数以上の減少を引き起こし、初日にコロニーの成長は観察されませんでした。UHMWPEからのゲンタマイシン溶出は、ゲンタマイシン耐性およびバンコマイシン中間株L1101の細菌生存率に影響を与えませんでした。.

それどころか、UHMWPEからのバンコマイシン溶出は、6時間で細菌の生存率を有意に低下させた。ゲンタマイシンとバンコマイシン溶出UHMWPEの両方の表面は、7日目以降に感受性および中間耐性株にさらされた場合、生存可能な付着細菌を示さなかった。しかし、ゲンタマイシン耐性L1101に曝露されたゲンタマイシン溶出UHMWPEには、いくつかの生菌が存在していました。

コントロールバージンポリエチレンの表面は、各株に曝露されたときに生菌の付着菌を示した。微生物集団のキャリーオーバーを促進する各時点での使用済み培地の分離は、抗生物質への持続的な曝露をシミュレートするために重要です。静的メソッドを改良しながら、この半静的シミュレーションメソッドは、感染症に対する新規製剤の活性動態をさらに理解するために、継続的なセットアップでフォローアップできます。

このプロトコルにより、菌株依存性の細菌動態に対する薬物溶出の影響を捉えることができました。これは、持続的な抗生物質送達デバイスの有効性評価のためのツールを強化します。