改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)
2023年5月12日
本稿では,活性化好中球由来の好中球細胞外トラップ残骸の2つの成分,ミエロペルオキシダーゼ抱合型DNAと好中球エラスターゼ抱合型DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法のプロトコルについて紹介する。
NETは最近注目を集めていますが、生体内でNETを定量することは困難であることが証明されています。このプロトコルは、臨床現場でNETの特性を調査するための、望ましく、高感度で、価値のある方法を提供します。この技術は、敗血症または敗血症性ARDS、急性呼吸窮迫症候群の重症度を評価するために拡張する必要があります。
ダンプまたは損傷に関連する分子パターンを調節することが敗血症の臨床状態を改善するための鍵であることは広く受け入れられています。この方法の最大の利点は、ミエロペルオキシダーゼ-DNAや好中球エラスターゼ-DNAなどの循環NET残骸を短時間で正確に定量できることです。アッセイの前にサンプルを回転させ、繰り返しの解凍を避けることをお勧めします。
プロトコルに記載されているインキュベーション時間に従うことが重要です。新たに単離した多形核好中球をフェノールレッドフリーRPMI 1640で1ミリリットルあたり10, 000細胞に希釈することから始めます。35ミリメートルの培養皿でそれらをふるいにかけます。
好中球細胞外トラップまたはNETを誘導するには、まず25ナノモルのPMAで多形核好中球を刺激します。次に、DNase Iのミリリットルあたり0.6マイクログラムを添加して細胞外トラップを部分的に消化し、混合物を室温で50分間インキュベートします。次に、5ミリモルのEDTAを加えてDNase活性を停止させ、合成されたNETを含む培地を収集します。
遠心分離機で細胞残渣を除去する。4つの健康な対照から上清を収集します。さらに使用するために、摂氏マイナス80度で混合して保管します。
0.05マイクログラムの抗体を含む100マイクロリットルの希釈抗ミエロペルオキシダーゼをELISAプレートにピペットで入れます。次に、サンプルの蒸発を防ぐためにプレートを粘着性のプラスチックカバーで覆い、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートして、捕捉抗体の結合を可能にします。翌日、希釈した抗体溶液をウェルから捨て、300マイクロリットルの洗浄溶液を各ウェルにピペットで入れた。
ペーパータオルでプレートを軽くたたいて乾かし、余分なPBSを取り除きます。プレートの各ウェルを200マイクロリットルのブロッキングバッファーでブロッキングします。それを粘着性のプラスチックカバーで覆い、それをインキュベートすることによってウェルを塞ぐ。
ブロッキング溶液をウェルから廃棄し、プレートを3〜4回洗浄した後、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。次に、ブランクを除くすべてのウェルに25マイクロリットルの血漿をピペットで入れます。そしてそれを75マイクロリットルのPBSで希釈し、最終的なウェル容量を100マイクロリットルにします。
次に、100マイクロリットルのPBSをブランクウェルに追加します。プレートをシェーカーに置き、室温で250 rpmで10秒間、サンプルを混合します。2マイクロリットルの100完全希釈DNase Iをすべてのウェルに加え、密封プレートをシェーカーに10秒間置き、サンプルを完全に混合します。
室温で15分間インキュベートします。各ウェルに1マイクロリットルの0.5モルEDTAを加えて、DNase反応を停止させます。次に、密封されたプレートをシェーカーに15秒間置き、サンプルを完全に混合します。
最後に、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートして、NETのタンパク質成分が捕捉抗体に付着できるようにします。翌日、ウェルから溶液を捨てます。複数回ウェル洗浄した後、希釈したペルオキシダーゼ結合抗DNA検出抗体100マイクロリットルを各ウェルにピペットで入れる。
プレートを1時間半インキュベートしてから、ウェル内の溶液を廃棄します。ウェルを3回洗浄した後、100マイクロリットルのABTS基質溶液を各ウェルにピペットで入れ、密閉プレートを暗所の振とう機上でインキュベートした。50マイクロリットルの2モル硫酸を加えて反応を停止します。
プレートの側面を慎重に叩いてウェルの内容物を混ぜます。次に、マイクロプレートリーダーをコンピューターに接続し、ソフトウェアアプリケーションを起動します。ステータス バーから、新しい実験を作成し、名前を付けます。
次に、読み取りタイプとして吸光度、読み取りモードとしてエンドポイント、波長として2を選択して、プレート読み取りパラメーターを設定します。次に、ラムダ1を405ナノメートル、ラムダ2を490ナノメートルに設定します。次に、オートキャリブレーションをオンのままにして、オートミックスとブランキングの両方のオフステータスを選択します。次に、ストリップの下のプレート全体を読み取るを選択します。
最後に、キャリッジ速度として [標準] で [列の波長の優先順位] を設定し、[自動読み取り] で [オフ] を選択します。プレートを計器の引き出しにしっかりと置き、閉じます。[読み取り]をクリックして、プレートがすぐに読み取られるようにします。
405ナノメートルで各ウェルの吸光度を読み取り、すべての未知のサンプルからアッセイ媒体の吸光度を自動的に減算します。MPO-DNAとNE-DNAの両方で、吸光度値がそれぞれ0.93と0.9を超えない場合、信頼できる標準検量線が得られました。最も高いODは、DNaseIのミリリットルあたり0.6マイクログラムを適用したときに得られた。
健常対照群の複合体のアッセイ間変動係数はそれぞれ1.871と0.987でしたが、COVID-19患者はそれぞれ2.532と2.010の変動係数を示しました。MPO-DNAおよびNE-DNAの平均アッセイ間変動係数はそれぞれ6.524および4.389であった。捕捉抗体のMPO-DNAおよびNE-DNA複合体に対する特異性は、アイソ型コントロール抗体が複合体にほとんど反応しないことを示した。
両方の複合体の割合は、健康な対照と比較して、COVID-19患者の血漿中で高かった。DNase消化時間を最適化する必要があります, そうでなければ、過度の消化は吸光度を低下させます.
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコルでは、好中球細胞外トラップ（NETs）残渣を定量的に測定するための、改良型サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ELISA）を提示します。本手法では、活性化好中球由来のミエロペルオキシダーゼ結合DNAおよび好中球エラスターゼ結合DNA複合体に焦点を当てます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 臨床研究
背景
- 好中球細胞外トラップ（NETs）は免疫応答において重要な役割を果たしています。
- 生体内（in vivo）でのNETsの定量化は困難とされてきました。
- NETsを理解することは、敗血症などの病態評価に役立ちます。
- ダメージ関連分子パターンを制御することは、臨床転帰を改善するために不可欠です。
研究目的
- NETsの特徴を調査するための高感度な手法を提供すること。
- 敗血症および敗血症性ARDSの重症度を評価すること。
- 血中を循環するNETs残骸の正確な定量を可能にすること。
使用方法
- 改良型サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）技術。
- ミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の測定。
- 遠心分離および凍結融解の繰り返しを避けることを含むサンプル調製。
- 迅速評価のための臨床現場への適用。
主な結果
- NET残渣の正確な定量化を実現した。
- 本手法は高い感度を示した。
- 本プロトコルは臨床研究に適用可能である。
- 敗血症におけるNETの関与の理解を促進する。
結論
- 本プロトコルは、NET研究において価値のあるツールを提供します。
- これにより、敗血症および関連疾患への理解を深めることができます。
- 今後の応用により、敗血症の臨床管理が改善される可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
NET由来のMPO-DNAおよびNE-DNA複合体の定量的測定は、免疫介在性疾患の研究およびトランスレーショナル・バイオマーカー開発における重要な課題を解決します。この改良型サンドイッチELISAにより、NET残骸の高感度かつ再現性のある検出が可能となり、初期探索および前臨床パイプラインにおけるメカニズムのリスク低減とターゲットバリデーションを支援します。NETの信頼性の高い定量化は、炎症性疾患および感染性疾患プログラムにおけるリスク調整後のポートフォリオ決定に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- NETに関連するパスウェイとその疾患メカニズムへの寄与についての解析を可能にします。
- 適切なモデルにおいてNETの形成と消失を定量化することで、生物学的なリスク低減をサポートします。
- NET調節治療薬における機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- NET関連ターゲットを前進させるための予測的な信頼性を提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 血漿および上清中のNETバイオマーカーについて、検証済みの定量的な読み取り値を提供します。
- 再現性と研究間での比較可能性を確保するため、アッセイ条件を標準化します。
- NET形成に対する化合物の影響をスクリーニングするのに適した高感度検出を可能にします。
- 複数の疾患関連システムにおけるプラットフォームの再利用をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 炎症性および感染性疾患モデルにおける翻訳バイオマーカー戦略とNET定量化を整合させます。
- in vitroでの発見から、NET標的介入の前臨床検証への継続性を提供します。
- 定量的なNETバイオマーカーデータに基づいた、リスク調整後の開発推進の意思決定に情報を供します。
- 前臨床候補化合物の選択における、メカニズム的なリスク低減（de-risking）をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この改良型ELISAは、発見段階から前臨床段階までの連続的なプロセスに組み込むことができ、初期のメカニズム研究からトランスレーショナルリサーチに至るまで、堅牢なNET定量化を可能にします。
- 探索生物学： 疾患におけるNETの関与に関する仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物評価およびアッセイ開発のための、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析： 条件間の比較のための、標準化された吸光度ベースの測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの知見と、疾患モデルにおける前臨床バイオマーカーとの整合性を結びつけます。
- 企業内での再利用： 複数のプログラムにわたるNET定量化のための、再利用可能なアッセイプラットフォームを構築します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： NET関連研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： NETバイオマーカーアッセイの標準化、再現性、および拡張性を向上させる。
- 戦略的価値： 堅牢なバイオマーカー主導のトリアージを可能にすることで、Go/No-Go判断と資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けおよびNET調節候補物質の推進をサポートする。
実施上の検討事項
- immunoassayの開発およびNET生物学に関する専門知識が必要です。
- ELISA装置および吸光プレートリーダーへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、インキュベーション時間およびサンプルハンドリングプロトコルを厳守してください。
- アッセイの感度に影響を与える不十分な消化や過剰消化を避けるため、DNase消化の最適化が極めて重要です。
- 研究室間の標準化において、多様なサンプルタイプに対する追加のバリデーションが必要となる場合があります。
