マイコプラズマ・ニューモニエの特異的検出のための抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(英語)

すべてのマイコプラズマ患者に関しては、マイコプラズマ肺炎の診断は交差反応のために困難です。我々が提案するELISAは、吸着技術を用いた非特異的肺炎マイコプラズム抗原の選択的枯渇に基づいている。このビデオで説明されている社内抗原捕捉ELISAは、高い広い特異性を保証します。

そして実際には、肺炎マイコモニエ感染症を正確に診断するための信頼できるスクリーニング検査であることが証明されています。ELISA前のステップを実演するのは、博士課程の学生であるイメン・クニバです。そして、ELISAのステップは、私たちの研究室の技術者であるナディーン・カドラウィです。

抗原吸着手順を開始するには、12個の異種細菌抗原を微小遠心チューブに引き込み、吸着する抗血清の半分に相当するタンパク質濃度を調整します。次に、抗原混合物を摂氏4度で14, 000 gで10分間遠心分離し、ペレットを回収します。次に、精製されたポリクローナル抗マイコプラズマ肺炎IgGでペレットを再懸濁し、ゆっくりと攪拌しながら摂氏37度で2時間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、懸濁液を摂氏4度で10分間14, 000Gで再び遠心分離し、特定のポリクローナルマイコプラズマ肺炎抗血清に対応する上清を回収する。96ウェルELISAプレートを捕捉抗体でコーティングするには、抗体を1ミリリットルあたり10マイクログラムに希釈し、pH 9.6で0.1モルの炭酸水素塩バッファーで希釈します。次に、100マイクロリットルの希釈抗体をマイクロプレートの各ウェルに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、コーティング溶液を取り出し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。次に、各ウェルに100マイクロリットルのブロッキング溶液を加えて、コーティングされたウェルの未結合表面をブロックします。プレートを室温で1時間インキュベートした後、ブロッキング溶液をピペットで除去し、前述のようにプレートを洗浄します。

同量のマイコプラズマ・ニューモニエ全タンパク質をウェルあたり10ナノグラムの濃度で添加し、抗原抗体反応を室温で2時間起こします。インキュベーション後、余分な抗原を取り除き、実証されているようにプレートを洗浄します。次に、ヒト血清試験サンプルを希釈し、陽性および陰性の血清対照を参照します。

次に、100マイクロリットルの希釈した試験サンプルとコントロールを適切なウェルと複製に追加します。抗原も血清も含まないウェルをブランクとしてマークします。プレートを室温で90分間インキュベートした後、血清溶液を取り出し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。

検出抗体を各ウェルに100マイクロリットルの適切な希釈酵素結合体をピペットし、暗所で摂氏37度で1時間インキュベートする。結合していない検出体を除去し、プレートを洗浄した後、100マイクロリットルのTMBクロモージェン溶液を加えて、抗原抗体結合を可視化します。プレートを室温で30分間発達させます。

その後、100マイクロリットルの7.5%硫酸を加えて反応を停止します。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して450ナノメートルの吸光度を読み取り、陽性指数の計算に基づいて結果を並べ替えます。マイコプラズマ・ニューモニエ非吸着ポリクローナル抗血清と異種細菌抗原との間のイムノブロット分析では、交差反応性が明らかになりましたが、強度はさまざまでした。

例えば、マイコプラズマ・ガリセプティカムとマイコプラズマ模倣抗原は、トリ類マイコプラズマであるにもかかわらず、最も強い反応性を示しました。対照的に、尿素プラズマ尿素溶解の2つのヒト臨床分離株のどちらも反応を示さなかった。しかし、残りのヒト性器マイコプラズマ種の抗原および他の細菌抗原は、抗血清とかなりの交差反応をもたらした。

イムノブロット分析により、異種細菌抗原に対するマイコプラズマ・ニューモニエ・ポリクローナル抗血清吸着の有効性が確認されました。吸着手順により、すべての交差反応が排除され、マイコプラズマ肺炎抗血清がその後のすべての血清学的およびイムノブロッティング試験に特異的になりました。さらに、本研究で開発した抗原捕捉ELISAを用いて試験したヒト血清セットは、良好な特異性を有するマイコプラズマ・ニューモニエIgGに対して陽性であることが証明された。

このELISAの特異性は、この重要なステップを注意深く実行し、少なくとも2回または3回繰り返すことが原始的であるため、主に吸着技術によって保証されます。この技術の原理は、他のマイコプラズマ種または他の細菌一般の診断に適用することができる。しかしながら、吸着のための細菌抗原の選択は無関係かつ適切であるべきである。