Name: コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: 学ぶカルコフルーアを用いたコケ物理層の3次元タイムラプスイメージング法。細胞壁動態を可視化し、ggb変異体の細胞壁剥離や野生型の肥厚パターンを観察できます。蛍光タンパク質変換不要で長期安定したシグナルを得られ、植物発生研究に応用可能です。

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著者らは、共焦点顕微鏡の支援について、ルイビル大学のSoucy Patricia博士とBetty Nunn博士に感謝の意を表している。この研究は、全米科学財団(1456884からMPR)および全米科学財団協力協定(1849213からMPR)によって資金提供されました。

注意: 材料と機器のリストについては 材料の 表を、このプロトコルで使用されるソリューションのリストについては 表1 を参照してください。
1.ガラス底皿用植物の準備
<ol><li>BCDAT寒天培地中のコケ原始組織を、一定の白色光(~50 μmol m-2 s-1)下で13 cmシャーレ中で、成長チャンバー内で25°Cで7日間成長させます。</li>
	<li>カルコフルオールホワイトをフィルター滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。試薬は数ヶ月間安定しています。</li>
	<li>生後7日目のコケ組織を、20 μLの滅菌水を含む1.5 mLマイクロチューブに分散させます。コケの原始組織が小片として水中に十分に分散していることを確認してください。野生型(WT)の場合は、鉗子を使用してプロトンマタを分離します。 GGB 変異体には、P-1000ピペットを使用してください。</li>
	<li>滅菌したカルコフルオールホワイト10 μLを1.5 mLマイクロチューブに加え、マイクロチューブをフード内で2分間直立させて染色します。</li>
	<li>染色直後に、P-1000ピペットで5回ピペッティングすることにより、0.5%(w / v)グルコースと0.4%(w / v)ジェランガムを添加したBCDAT培地を含む200 μLの冷却BCDATGと植物を混合します。 注意: BCDATG培地が十分に冷却されていることを確認してください(培地が固化する直前)植物にストレスを与えないようにします。</li>
	<li>植物とBCDATG培地を含む混合物を直径27mmのガラスベースディッシュに移します。細胞を混合するためのBCDATGの容量が200μL以下であり、サンプルを含む200μLのBCDATGが7mmのガラス底皿の表面に均一に分布してフィルムの薄層を生成し、サンプルがイメージング中に対物レンズの作動距離内にあることを確認してください。</li>
	<li>室温で2分間固化させた後、薄層を冷却したBCDATG3 mLで覆い、10分間セットして再び固化させます。 注意: 汚染を避けるために、手順1.2〜1.5が滅菌フードで実行されていることを確認してください。</li>
	<li>皿の底に、平行方向と垂直方向にそれぞれ9本の線を引きます(図2)。行を a から h までの文字でマークし、列に 1 から 8 までの数字をマークします。上、下、右、中央、左を使用して、各正方形内の位置をマークします。たとえば、植物が2行目と6列目の正方形にあり、正方形の左上部分に配置されている場合、この植物には「b6_upper_left」という名前が付けられます。</li>
	<li>植物を含むガラス底皿を成長チャンバー内で25°Cで5日間赤色光下で前培養し、その後白色光下で1〜2日間、毎日最大3日間タイムラプスイメージングを行った。WTの場合、植物を上記からの弱い赤色光(0.5μmol m-2 s-1)で5日間前培養して、プロトネマタの光向性応答を誘導し、植物が皿11の底に付着できるようにした。 注意: 弱い赤色光は、白色光を厚さ3mmの赤いアクリルプラスチックフィルターに通して防光ボックスに入れることによって提供されます。ggb変異体の場合、ggb変異体は光向性応答を持たないため、赤色光での前培養はオプションです3。</li>
</ol>2. イメージングと3次元再構成
<ol><li>植物を含むガラス底皿を倒立共焦点顕微鏡のステージに置き、ガラス底部を対物レンズに向けます。共焦点顕微鏡を使用して、20倍の対物レンズでカルコフルーアを視覚化します。405 nmレーザー、1.0のピンホール、100のHVゲイン、0のオフセットバックグラウンド調整、5%〜7%のレーザー出力、1,024 x 1,024のスキャンサイズ、および1/2フレーム/秒のスキャン速度で画像を撮影します。ステップサイズ1.0μmの17〜30個のzシリーズ光学セクションを収集します。手順 1.6 のコードを使用して画像に "b6_upper_left-day0" などの名前を付け、保存します。<ol><li>[集録] で DAPI チャネルを選択し、[ND 集録] の [Z] チェック ボックスをオンにします。Z スタックの下限と上限を設定するには、[上] ボタンと [下] ボタンをクリックします。</li>
	</ol></li>
	<li>3-D イメージを再構築するには、.nd2 ファイル (図 3A; 材料表を参照) を開き、ボリューム (図 3B) をクリックします。</li>
</ol>3. 異なる時点での同じ植物のイメージング
<ol><li>各イメージングの後、ガラスベースディッシュを成長チャンバーに戻します。</li>
	<li>イメージングと3D再構成について、手順2.1から繰り返します。 注意: 同じ植物を見つけるには、手順1.6で説明したコードを使用して、植物の年齢に応じて「b6_upper_left-day1」または「b6_upper_left-day2」という名前を付けます。</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+construction%2C+perception%2C+and+remodeling+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li>
<li>Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+integrity+maintenance+during+plant+development+and+interaction+with+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Naure+Plants%22%5BJournal%5D)">Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment.</a> Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).</li>
<li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+function+of+ROP+GTPase+prenylation+important+for+multicellularity+in+the+moss+Physcomitrium+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens.</a> Development. 149 (12), (2022).</li>
<li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+living+plant+cell%3A+From+probes+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging the living plant cell: From probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFang%2C+Y+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2010 (2), (2010).</li>
<li>Goh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live-cell+imaging+approaches+to+study+lateral+root+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana.</a> Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).</li>
<li>Hamant, O., Das, P., Burian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+developing+shoot+meristems+using+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).</li>
<li>Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+FM4-64%2C+a+tool+for+tracing+the+endocytic+pathways+in+Arabidopsis+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).</li>
<li>Yagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+synthetic+fluorescent+probe+labeling+for+live-cell+imaging+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants.</a> Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).</li>
<li>Whitewoods, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLAVATA+was+a+genetic+novelty+for+the+morphological+innovation+of+3D+growth+in+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants.</a> Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).</li>
<li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PSTAIRE-type+cyclin-dependent+kinase+controls+light+responses+in+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants.</a> Science Advances. 8 (4), 2116(2022).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益や金銭的利益を宣言していません。

タイムラプス3D再構成、または4Dイメージングは、発生過程における細胞形態のダイナミクスを観察するための強力なツールです。このプロトコールでは、カルコフルオールホワイトを培地に混合することにより、コケ P.パテンの3D細胞形態の動態を観察することができます。この方法を用いて、 ggb 変異体の細胞壁の表面が発生中に引き裂かれることを観察しました3。さらに、細胞壁の肥厚の減少は、野生型の細胞増殖/分岐部位と相関しており、拡張/分岐部位の予測を可能にします。さらに、カルコフルオールホワイトはミクロスフェアなどの他の色素と一緒に使用できるため、細胞増殖に関する追加情報を観察することができます3。 
カルコフルオール色素が分子標的に影響を与えたり損傷したりすることなく、植物に数日間結合する方法を説明できる2つの理由があります。まず、低使用濃度(BCDATG培地200 μLで10 μL、または5%)は、コケプロトネマタが影響を受けないように十分に低い場合がありま...

植物細胞壁は、細胞の拡大と発生の間に動的な変化を受けます1,2,3。細胞壁の完全性を維持することは、成長および発生中の植物細胞の接着、および環境シグナルへの応答にとって重要です。発生中の細胞接着や環境変化への適応を理解するためには、生細胞の細胞壁動態を長期間可視化することが重要ですが、細胞壁動態を直接観察する方法は依然として課題です。
細胞変化のタイムラプスイメージングは、高解像度蛍光顕微鏡4,5,6,7を用いて生物の有益な発生動態を提供することができる。タイムラプス3Dイメージングは、成長および発生中の細胞形状の動的変化を研究するための大きな可能性を秘めていますが、この技術は通常、蛍光タンパク質の形質転換を必要とします4,5,6,7。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子変換には時間がかかるか、技術的に困難です。代替として、細胞成分に付着する蛍光色素が長い間利用可能であった。蛍光色素は、特定の波長の光を照射した後に蛍光を発することができる。一般的な例は、Edu、DAPI、PI、FM4-64、およびカルコフルーアホワイト8,9,10です。しかしながら、1つの大きな欠点は、これらの色素が細胞に害を及ぼすこともあり、通常、固定組織または短時間の実験にしか使用できないことである8、9、10。
ここに示すプロトコルでは、コケP.パテンのタイムラプス実験中にカルコフルーアホワイトが培地内に混合されると、カルコフルーア信号は安定しています。この方法を用いて、3Dタイムラプスイメージングを用いてggb変異体における細胞の剥離を3日間にわたって観察した(図1)。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。

<table><tbody><tr><td>厚さ3mmの赤色プラスチックライトフィルター</td><td>&nbsp;三菱&</td><td>nbsp;No.102</td><td></td></tr><tr><td>27mm径ガラスベースディッシュ&nbsp;</td><td>いわき</td><td>3930-035</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>&nbsp;シグマ</td><td>A6924</td><td></td></tr><tr><td>カルコフロー ホワイト&nbsp;</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>18909-100ML-F</td><td>Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>A1</td><td> NIS element software; NIS-elements Viewer の .nd2 ファイル、https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer </td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&nbsp;</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>TE200&nbsp;</td><td>DS-U3カメラを搭載。</td></tr><tr><td>ジェランガム&nbsp;</td><td>Nacali Tesque</td><td>12389-96</td><td></td></tr><tr><td>植物成長室</td><td>SANYO&nbsp;</td><td>三洋電機MLR-350H</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ0.22 &mu;mフィルター</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。一般に、長期間にわたる観察のために、この技術は蛍光タンパク質の形質転換を必要とする。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子形質転換には時間がかかるか、技術的に利用できません。この原稿は、コケの Physcomitrium patensで開発されたカルコフルオロ色素(植物細胞壁のセルロースを染色する)を使用して、3日間にわたる細胞壁ダイナミクスの3Dタイムラプスイメージングのプロトコルを提示します。細胞壁からのカルコフルオール色素シグナルは安定しており、明らかな崩壊なしに1週間持続します。この方法を使用して、 ggb 変異体(タンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ-Iベータサブユニットがノックアウトされている)における細胞の剥離は、調節されていない細胞増殖および細胞壁完全性の欠陥によって引き起こされることが示されている。さらに、カルコフルアー染色のパターンは時間とともに変化します。それほど強く染色されていない領域は、野生型の将来の細胞増殖/分岐部位と相関しています。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。

この方法により、野生型および ggb 変異体の発生過程における細胞壁動態の観察が可能となります(図1)。その結果、細胞壁の肥厚が少ない領域は細胞増殖・分岐部位と相関し、野生型の増殖・分岐部位の予測が可能となりました(図1A)。 ggb 変異体の細胞壁の表面は、制御されない細胞増殖のために発生中に引き裂かれました3 (図1B)。さらに、 ggb 変異体(古いセルロース)の破砕表面の染色シグナルは、壊れた細胞壁表面の下の細胞表面(若いセルロース)よりも強い。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64651/64651fig01.jpg"><br...

本論文は、生きたコケ組織の3次元細胞壁動態を画像化するための詳細なプロトコルを提示し、長期間にわたる発生中の野生型における ggb 変異体の細胞壁の剥離と肥厚する細胞壁パターンの可視化を可能にします。

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。3Dタイムラプスイメージング用のこのシンプルなプロトコルは、長期間にわたる細胞壁のダイナミクスを直接研究することができます。このプロトコルは、カルコフルオール色素を使用して細胞壁の厚さのダイナミクスをマークするため、蛍光タンパク質の形質転換を必要としません。カルコフルーア信号は安定しており、1週間以上続くことがあります。この方法は、細胞壁を含む単純な構造を持つ他の多くのシステムに適用でき、顕花植物などのカルコフルアーで染色することができます。このプロトコルでは、タイムラプスイメージングの全プロセス中にこの色素を培地内で混合すると、カルコフルーア信号は安定しています。まず、生後7日目のコケ組織を20マイクロリットルの滅菌水を入れた1.5ミリリットルのマイクロチューブに分散させます。野生型の場合は、鉗子を使用してプロトンマタを分離します。ggb変異体については、AP-1000ピペットを使用してプロトンマタを分離します。滅菌したカルコフルオールホワイトを10マイクロリットルマイクロチューブに加え、染色のためにチューブをフードに2分間直立させたままにします。染色直後に、P1000ピペットで5回ピペッティングすることにより、植物を200マイクロリットルの冷却BCDATG含有BCDAT培地と混合し、混合物を27ミリメートルのガラスベースディッシュに移します。サンプルを含む200マイクロリットルのBCDATGが27ミリメートルのガラス底皿の表面に均一に分布し、イメージング中にサンプルが対物レンズの作動距離内にあるようにフィルムの薄層を生成することを確認します。室温で2分間固化させた後、薄層を3ミリリットルの冷却BCDATGで覆い、10分間セットして再び固化させます。皿の底に平行方向と垂直方向にそれぞれ9本の線を引き、AからHまでの文字で行をマークし、1から8までの数字で列をマークします。上、下、右、中央、左を使用して、各正方形内の位置をマークします。たとえば、植物が2行目の6列目の正方形にあり、正方形の左上部分に配置されている場合、この植物には左上のb6の名前が付けられます。ガラス底皿を白色光の下に1〜2日間置いてから、毎日最大3日間タイムラプスイメージングを行います。3D画像を再構築するには、ND2ファイルを開き、ボリュームをクリックします。0日目、1日目、3日目、4日目に細胞壁を再構築します。各画像を撮影した後、ガラスベースの皿を成長チャンバーに戻します。クロスウォールの動的変化は、野生型およびggb変異体におけるカルコフルーア白色染色によって示された。ggb変異体の場合、各画像の下の白い破線は拡大細胞における破断面の細胞壁を示し、オレンジ色の線はggbにおける細胞壁表面の下の細胞を示す。カルコフルオール-ホワイトシグナルの違いは、野生型のggb変異体または新たに分岐部位における細胞増殖を示す細胞の表面位置および密度の低い染色領域で検出することができる。野生型の前培養の場合, カルコフルオールホワイトはマイクロスフェアなどの他の色素と一緒に使用できるため、植物を皿の底に付着させ、植物をイメージング中に客観的なアップワーキング距離内に出現させることができるように、上記からの弱い赤色光で5日間植物を誘導する必要があります.細胞増殖に関する追加情報も研究することができる。植物細胞壁のダイナミクスは、効率的な成長と発達、および環境シグナルへの応答に不可欠です。このプロトコルは、細胞壁シグナルの変化の分割および積分を直接可能にする。

3-d-time-lapse-imaging-cell-wall-dynamics-using-calcofluor-moss

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JoVE Journal

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全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

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