コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング
2023年2月10日
本論文は、生きたコケ組織の3次元細胞壁動態を画像化するための詳細なプロトコルを提示し、長期間にわたる発生中の野生型における ggb 変異体の細胞壁の剥離と肥厚する細胞壁パターンの可視化を可能にします。
蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。3Dタイムラプスイメージング用のこのシンプルなプロトコルは、長期間にわたる細胞壁のダイナミクスを直接研究することができます。このプロトコルは、カルコフルオール色素を使用して細胞壁の厚さのダイナミクスをマークするため、蛍光タンパク質の形質転換を必要としません。
カルコフルーア信号は安定しており、1週間以上続くことがあります。この方法は、細胞壁を含む単純な構造を持つ他の多くのシステムに適用でき、顕花植物などのカルコフルアーで染色することができます。このプロトコルでは、タイムラプスイメージングの全プロセス中にこの色素を培地内で混合すると、カルコフルーア信号は安定しています。
まず、生後7日目のコケ組織を20マイクロリットルの滅菌水を入れた1.5ミリリットルのマイクロチューブに分散させます。野生型の場合は、鉗子を使用してプロトンマタを分離します。ggb変異体については、AP-1000ピペットを使用してプロトンマタを分離します。
滅菌したカルコフルオールホワイトを10マイクロリットルマイクロチューブに加え、染色のためにチューブをフードに2分間直立させたままにします。染色直後に、P1000ピペットで5回ピペッティングすることにより、植物を200マイクロリットルの冷却BCDATG含有BCDAT培地と混合し、混合物を27ミリメートルのガラスベースディッシュに移します。サンプルを含む200マイクロリットルのBCDATGが27ミリメートルのガラス底皿の表面に均一に分布し、イメージング中にサンプルが対物レンズの作動距離内にあるようにフィルムの薄層を生成することを確認します。
室温で2分間固化させた後、薄層を3ミリリットルの冷却BCDATGで覆い、10分間セットして再び固化させます。皿の底に平行方向と垂直方向にそれぞれ9本の線を引き、AからHまでの文字で行をマークし、1から8までの数字で列をマークします。上、下、右、中央、左を使用して、各正方形内の位置をマークします。
たとえば、植物が2行目の6列目の正方形にあり、正方形の左上部分に配置されている場合、この植物には左上のb6の名前が付けられます。ガラス底皿を白色光の下に1〜2日間置いてから、毎日最大3日間タイムラプスイメージングを行います。3D画像を再構築するには、ND2ファイルを開き、ボリュームをクリックします。
0日目、1日目、3日目、4日目に細胞壁を再構築します。各画像を撮影した後、ガラスベースの皿を成長チャンバーに戻します。クロスウォールの動的変化は、野生型およびggb変異体におけるカルコフルーア白色染色によって示された。
ggb変異体の場合、各画像の下の白い破線は拡大細胞における破断面の細胞壁を示し、オレンジ色の線はggbにおける細胞壁表面の下の細胞を示す。カルコフルオール-ホワイトシグナルの違いは、野生型のggb変異体または新たに分岐部位における細胞増殖を示す細胞の表面位置および密度の低い染色領域で検出することができる。野生型の前培養の場合, カルコフルオールホワイトはマイクロスフェアなどの他の色素と一緒に使用できるため、植物を皿の底に付着させ、植物をイメージング中に客観的なアップワーキング距離内に出現させることができるように、上記からの弱い赤色光で5日間植物を誘導する必要があります.
細胞増殖に関する追加情報も研究することができる。植物細胞壁のダイナミクスは、効率的な成長と発達、および環境シグナルへの応答に不可欠です。このプロトコルは、細胞壁シグナルの変化の分割および積分を直接可能にする。
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概要
この原稿は、生きた苔の組織における細胞壁ダイナミクスの3Dタイムラプスイメージングの詳細なプロトコルを提示しています。この方法により、ggb変異体における細胞壁の剥離や、発達の過程で野生型苔の細胞壁の厚みの変化パターンを長期間にわたって可視化することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 植物発生
- 顕微鏡技術
背景
- タイムラプスイメージングは細胞のダイナミクスを観察する上で重要です。
- 蛍光顕微鏡は成長プロセスの詳細な可視化を可能にします。
- カルコフルオール染色剤は、蛍光タンパク質の変異を必要とせずに細胞壁を染色するのに使用されます。
- カルコフルオールシグナルの安定性により、時間経過でのイメージングの信頼性が向上します。
研究の目的
- 苔の細胞壁ダイナミクスを観察するためのプロトコルを開発すること。
- ggb変異体と野生型苔の細胞壁挙動の違いを調査すること。
- 細胞壁を持つ他の植物システムにも適用可能な方法を提供すること。
使用された方法
- 蛍光顕微鏡を用いた3Dタイムラプスイメージング。
- 細胞壁ダイナミクスをマークするためのカルコフルオール染色剤の使用。
- イメージングプロセス全体を通じて維持される安定したカルコフルオールシグナル。
- 様々な植物システムへのプロトコルの適用。
主要な結果
- ggb変異体における細胞壁の剥離の成功的な可視化。
- 野生型苔の厚みの変化パターンの観察。
- 他の植物構造へのプロトコルの適用可能性のデモンストレーション。
- 長期間のイメージングに対する安定したカルコフルオールシグナルの確認。
結論
- このプロトコルは細胞壁ダイナミクスを研究するための信頼できる方法を提供します。
- 得られた洞察は植物発生の理解を深めることができます。
- この方法は様々な植物種に適用可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
