Name: 汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶ臨床用マイクロ流体チップを用いた循環腫瘍細胞の単離法。MCF-7、MDA-MB-231、HeLa細胞株を培養し、Calcein AM染色と免疫蛍光法で迅速に検出・同定します。がん診断の精度向上に貢献します。

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この研究成果は、中国安徽自然科学財団(1908085MF197、1908085QB66)、中国国家自然科学財団(21904003)、天津教育委員会科学研究プロジェクト(2018KJ154)、安徽省高等教育機関の省自然科学研究プログラム(KJ2020A0239)、および華東多次元情報重点実験室上海多次元情報処理重点実験室の支援を受けました処理、華東師範大学(MIP20221)。

患者の血液サンプルは、上海医科大学附属龍華病院から提供され、プロトコルは北京大学第三病院の人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。研究目的でサンプルを使用することについて、患者からインフォームドコンセントが得られました。
1. 培養腫瘍細胞による捕捉効率を確認するための事前実験
<ol><li>腫瘍細胞をMCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaで培養し、捕捉効率を測定した。腫瘍細胞懸濁液を希釈し、腫瘍細胞の数を数え、1 mLのPBS中の所望の細胞数が得られるまで繰り返します。<ol><li>10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した1mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の開始細胞数~1×105 細胞を有する細胞培養フラスコ内で細胞を培養する。5%CO2 雰囲気で37°Cの加湿雰囲気中でインキュベートします。</li>
		<li>細胞株が接着性単層として95%コンフルエントまで増殖したら、Chenらに記載されているように、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します16。</li>
		<li>腫瘍細胞をカルセインAMで染色します。培養皿に3 μLのカルセインAMを入れ、培養器内で30分間保持します。その後、トリプシンですべての細胞を消化します。</li>
		<li>細胞計数チャンバーを用いてPBSで培養した腫瘍細胞を計数し、PBS1mLあたり100個の腫瘍細胞が得られるまで希釈する。 注:細胞数を正確に列挙するために、得られた細胞懸濁液の50μLを採取して、その中の腫瘍細胞の数が5個であるかどうかを顕微鏡で確認します。50μLの細胞懸濁液中の実際の腫瘍細胞数に応じて、100個の腫瘍細胞を得るために採取する必要のある細胞懸濁液の量を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>シリンジポンプ付きシリンジを使用して、PBS1 mLあたり100個の腫瘍細胞を含む細胞懸濁液を、0.5 mL/h、1 mL/h、2 mL/h、3 mL/h、4 mL/h、および5 mL/hのさまざまな流速でマイクロ流体チップに導入します。さまざまな流量の捕捉効率を取得し、最適な流量を決定します。<ol><li>チップ上に捕捉され、出口から流出する腫瘍細胞の数を数えます。キャプチャ効率を次のように計算します。 捕捉効率=捕捉細胞数/(捕捉細胞数+流出細胞数)×100%</li>
		<li>繰り返して、10〜100(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100)の異なる数の腫瘍細胞の捕捉効率を得る。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロ流体チップの希少な数の腫瘍細胞をテストおよび検証します。マイクロピペットプラーで作った中空針を使用して、これらの10サンプル懸濁液をマイクロ流体チップに注入し、1 mLのPBSで希釈した1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を吸引します。チップ上で捕捉した後の各サンプルの腫瘍細胞の数を検出して列挙します。 注意: 中空針の長さは約3 cm、外径は1 mmです。</li>
	<li>正常な血液サンプルにスパイクされた腫瘍細胞の臨床実験前テストを実行します。<ol><li>腫瘍細胞をカルセインAMで染色し、5 μLのPBS中の100個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1mLの全正常血液サンプルにスパイクします。.これらの細胞をチップに導入し、緑色の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙する。上記のようにチップ上で 生体内 計数を行い、捕捉後の捕捉効率を算出する。</li>
		<li>ステップ1.4.1を繰り返して、腫瘍細胞数の10から90までの9つの追加濃度(10、20、30、40、50、60、70、80、90)について繰り返します。</li>
		<li>ステップ1.3で説明したように、染色せずに1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を列挙し、1 mLの全正常血液にスパイクし、これらのサンプルをマイクロ流体チップに導入し、チップ上の腫瘍細胞を捕捉します。</li>
		<li>チップをヘキスト、CK-FITC、およびCD45-PEで染色します。3〜5μLの蛍光色素を20〜30μLのPBSに入れ、次いでこの溶液をシリンジを用いてマイクロ流体チップ上に導入する。チップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を青と緑の両方の免疫蛍光で列挙し、捕捉効率を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>抗EpCAMの親和性ベースの捕捉のためにマイクロ流体チップの修飾を行う。 メモ: Wave チップはアフィニティベースと物理的特性ベースの両方の分離を組み合わせているため、エージェントでチップを変更します。<ol><li>100 μLの4%(v/v)3-メルカプトプロピルトリメトキシシランをエタノール中で室温で45分間チップの表面改質します。チップの内部構造、特に上面と基板ガラスの接着を破壊する場合に備えて、この溶液をチップに注意深くゆっくりと導入してください。 注:チップ表面はメルカプトシランを使用して改質されています。チップ上で発生する相互作用は、化学結合によって決定されます。抗原で修飾された抗体の結合を実現するために化学結合が確立されます。チップ内では、さまざまな試薬が修飾され、互いに結合する化学結合が確立されます。修飾される最後の試薬は、抗上皮接着分子(抗EpCAM)である。EpCAMの腫瘍細胞表面抗原は、チップ内の抗EpCAMと組み合わせて、CTCの捕捉を実現します。</li>
		<li>エタノール3倍で洗浄します。カップリング剤N-y-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS、1 μM)を100 μLチップ上に加え、30分間相互作用させます。</li>
		<li>PBS 3xで洗浄します。シリンジを使用して、洗浄するチップに1 mLのPBSを導入します。</li>
		<li>チップを30-40 μLの10 μg/mLニュートラアビジンで室温で30分間処理し、細胞をGMBSに固定化してから、PBSで洗い流して余分なアビジンを除去します。</li>
		<li>100 μLのPBS溶液中に10 μg/mLの濃度の抗ビオチン化EpCAM抗体3 μLを1%(w/v)BSAでチップを修飾します。これを一晩保管してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2.循環腫瘍細胞(CTC)を列挙するためのチップ上の臨床実験
<ol><li>赤血球溶解(RBCL)溶液を使用して臨床がん患者の血液サンプルを前処理するか、シリンジを使用して2〜3 mLの血液サンプルをマイクロ流体チップに直接導入します。<ol><li>約30分かかる前処理を実行します。抗凝固チューブで全血サンプルを収集します。6〜9 mLのRBS溶解溶液を2〜3 mLの血液に加えます。111 x g で室温で5〜8分間遠心分離し、赤い透明な液体の上層を廃棄します。</li>
	</ol></li>
	<li>以下に説明するように、チップ上の細胞を捕捉、染色、認識、および列挙します。<ol><li>ステップ 1 の説明に従ってチップ上の細胞を捕捉します。Hoechst、CK-FITC、および CD45-PE を使用して捕捉された CTC のチップを染色します。CK-FITCは腫瘍細胞に対する特異的染色剤であり、CD45-PEは白血球に対する特異的染色剤である。</li>
		<li>3 μL の CK-FITC を 20 μL の PBS に加えます。これをシリンジに入れ、希釈したCK-FITCをチップに送り込みます。30分間染色します。チップ上に300 μLのPBSを導入してチップを洗浄します。</li>
		<li>3 μLのCD45-PEを20 μLのPBSに加えます。これをシリンジに入れ、希釈したCD45-PEをチップに送り込みます。30分間放置します。チップ上に300 μLのPBSを導入してチップを洗浄します。</li>
		<li>倒立蛍光顕微鏡で20倍または40倍の倍率でCTCを同定します。CTCは青色と緑色の両方の蛍光を発し、白血球(WBC)は青色と赤色の両方の蛍光を発します。青と緑の両方の蛍光を持つCTCと、青と赤の両方の蛍光を持つWBCを特定します。</li>
		<li>免疫蛍光画像から、チップ上に捕捉されたCTCの数を列挙する。CTC を Hoechst+/CK-FITC+/CD45- として列挙し、WBC を Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ として列挙します。</li>
	</ol></li>
	<li>シリンジを通してPBSでマイクロ流体チップに逆方向にフラッシュし、チップ上に捕捉されたCTCを入口から回収することにより、捕捉されたCTCを濃縮します。1 mLのPBSを含むシリンジを使用し、出口から導入して、2〜3分以内にチップ上に捕捉されたCTCを濃縮し、入口から収集します。洗浄ステップごとに1 mLのPBSを使用し、3回繰り返します。</li>
	<li>マイクロ流体チップ上に捕捉された腫瘍細胞またはCTCを以下のように染色する。<ol><li>カルセインAMを使用して染色します。5 μLのカルセインAMを20 μLのPBSに加え、細胞を30分間染色した後、111 x g で室温で2分間遠心分離して腫瘍細胞を取得し、1 mLのPBSに懸濁します。</li>
		<li>細胞核を特定するには、20 μLのDAPI溶液(20 μLのPBSに10 μLのDAPI試薬)を、大きな楕円マイクロフィルターの場合は1 mL/h、台形のマイクロフィルターの場合は1.5 mL/hの最適な流速でチップに追加します。20 μLの抗サイトケラチン原液(20 μLのPBS中に3 μLの抗サイトケラチン抗体)を通過させて、チップと30分間反応させます。</li>
		<li>チップにキャプチャされたWBCを染色します。CTCをチップ上に捕捉した後、25 μLの抗CD45抗体溶液(20 μLのPBS中に5 μLの抗CD45溶液)をチップに加え、30分間染色します。PBSで洗浄し、青色と緑色の両方の蛍光で上皮細胞を同定します。</li>
	</ol></li>
	<li>以下に述べるように蛍光顕微鏡による免疫蛍光同定を行う。<ol><li>蛍光顕微鏡を使用し、青色レーザーでサンプルを励起します。核細胞である青色蛍光を発する細胞を見つけます。次の倍率のいずれかを使用します:10倍、20倍、または40倍。腫瘍細胞の明確なフィールドを見つけます。青色レーザー光源には、励起板波長420〜485 nm、発光板波長515 nmを使用します。</li>
		<li>サンプルを移動せずに、別のレーザー光源を使用します。蛍光顕微鏡を回転させ、緑色レーザーで試料を励起します。腫瘍細胞の指標である緑色の蛍光を発する細胞を見つけます。この緑色レーザー光源で同じ視野の画像を同じ倍率で撮影します。青色と緑色の両方の蛍光を発する細胞は、腫瘍細胞として認識されます。緑色レーザー光源には、励起板波長460〜550 nm、発光板波長590 nmを使用してください</li>
		<li>サンプルを移動せずに、別のレーザー光源を使用します。蛍光顕微鏡を回転させ、赤色レーザーで試料を励起します。赤色蛍光を発する細胞を見つけます。この赤色レーザー光源で同じ視野の画像を同じ倍率で撮影します。青色と赤色の両方の蛍光を発する細胞は、白血球として認識されます。</li>
		<li>上記の各レーザー光源を使用して得られた画像を保存します。異なる色のライトで同じフィールドの複数の画像を撮ります。</li>
		<li>励起板波長330〜400nm、発光板波長425nmの紫外線を使用してください。励起板波長395-415nm、発光板波長455nmの紫色光を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>手順1.2.1のようにキャプチャ効率を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-sensitive+capture+of+circulating+tumor+cells+using+micro-ellipse+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters.</a> Scientific Reports. 7 (1), 610(2017).</li>
<li>World Health Organization Cancer report. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer</a> (2022).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).</li>
<li>Mehlen, P., Puisieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+A+question+of+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: A question of life or death.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-selective+collection+of+circulating+tumor+cells+using+Vortex+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+patients+with+localized+and+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (25), 23(2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumor+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Murlidhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radial+flow+microfluidic+device+for+ultra-high-throughput+affinity-based+isolation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells.</a> Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).</li>
<li>Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdevice+for+the+isolation+and+enumeration+of+cancer+cells+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood.</a> Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).</li>
<li>Preira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+circulating+cell+sorting+by+deformability+using+a+microfluidic+gradual+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter.</a> Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).</li>
<li>Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microfluidics+combined+with+active+and+passive+approaches+for+continuous+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation.</a> Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).</li>
<li>Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumour+cells+by+physical+means+in+a+microfluidic+device%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review.</a> RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).</li>
<li>Kumeria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitchable+membranes+based+on+peptide-modified+nanoporous+anodic+alumina%3A+Toward+smart+membranes+for+on-demand+molecular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport.</a> Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).</li>
<li>Mahesh, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+platform+for+physical+and+immunological+detection+and+capture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells.</a> Biosensors. 12 (4), 220(2022).</li>
<li>Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+antibody-coated%2C+physical-based+microfluidic+chip+with+wave-shaped+arrays+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells.</a> Biomedical Microdevices. 19 (3), 66(2017).</li>
<li>Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+circulating+tumour+cell+enrichment+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A review of circulating tumour cell enrichment technologies.</a> Cancers. 13 (5), 970(2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inertia-deformability+hybrid+CTC+chip%3A+Design%2C+clinical+test+and+numerical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study.</a> Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004(2018).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

がんの予後と早期診断は、がん治療に大きな影響を与えます1.マイクロ流体チップによるCTC分離は、浸潤のないリキッドバイオプシーを提供します。しかし、CTCは血液中で非常にまれで不均一であるため1、CTCを単離することは困難です。 CTCは、それらが由来する元の腫瘍源と同様の特性を有する。したがって、CTCは癌転移において重要な役割を果たします1。 
提案されたプロトコルは、マイクロ流体チップによるCTC分離の完全な分析を可能にします。プロトコルには、CTC分離に関連するすべての主要な手順が含まれています。たとえば、このプロトコルには、細心の注意を払って記録され、さまざまなパッケージに編成されたRBCL分析、希少腫瘍細胞の取得、最適な流速の決定、捕捉効率、臨床特性評価、および列挙が含まれます。操作の慎重な管理は、臨床患者のサンプル処理を容易にします。このプロトコルは、臨床患者サンプルの前処理と処理を可能にし、臨床医に不可欠なサービスを提供しま...

循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCはまれで異種であるため、CTCの列挙は不可欠です。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離のための強力な技術です1。2〜3 mLの実際の患者の血液には1〜10個のCTCしか含まれていないため、正常な血液と混合されたまれな数の腫瘍細胞は実際の患者の血液を厳密に模倣します。重要な実験問題を解決するために、PBSに導入された多数の腫瘍細胞を使用するか、正常な血液と混合する代わりに、まれな数の腫瘍細胞を使用すると、実験を行う際の現実に近い血球数が少なくなります。
がんは世界の主要な死因です2。CTCは、血液およびリンパ循環系を循環する元の腫瘍から脱落した腫瘍細胞である3。CTCが新しい生存可能な環境に移動すると、それらは2番目の腫瘍として成長します。これは転移と呼ばれ、がん患者の死亡の90%の原因です4。CTCは、予後、早期診断、および癌のメカニズムを理解するために不可欠です。しかし、CTCは患者の血液中では非常にまれで不均一です5,6。
マイクロ流体チップは、腫瘍に浸潤しないリキッドバイオプシーを提供します。それらには、ポータブルで低コストであり、セルに一致するスケールを備えているという利点があります。マイクロ流体チップによるCTCの単離は、主に2つのタイプに分類されます:抗原抗体結合に依存するアフィニティベース7,8,9であり、CTC単離のオリジナルで最も広く使用されている方法です。腫瘍細胞と血液細胞10,11,12,13,14,15のサイズと変形能の違いを利用する物理ベースのチップは、ラベルフリーで、操作が簡単です。他の技術に対するマイクロ流体チップの利点は、大きな楕円マイクロフィルターの物理ベースのアプローチが高い捕捉効率でCTCをしっかりと捕捉することです。この理由は、楕円のマイクロポストがラインラインギャップの細いトンネルに編成されているためです。ラインラインギャップは、菱形マイクロポストなどのマイクロポストによって形成される従来のポイントポイントギャップとは異なります。CTCのウェーブチップベースのキャプチャは、物理的特性ベースの分離とアフィニティベースの分離の両方を組み合わせたものです。ウェーブチップベースのキャプチャには、円形のマイクロポストに抗EpCAMの抗体をコーティングした30のウェーブ型アレイが含まれます。CTCは小さなギャップによって捕捉され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。見逃されたCTCは、次のアレイの小さなギャップを通過しなければならず、チップ16の内部に組み込まれたアフィニティベースの絶縁によって捕捉される。
このプロトコルの目的は、まれな数の腫瘍細胞のカウントと、マイクロ流体チップを使用したCTCの臨床分析を実証することです。プロトコルは、CTC単離ステップ、低数の腫瘍細胞を取得する方法、小楕円フィルター、大楕円フィルター、および台形フィルターの臨床的物理的分離、親和性修飾、および濃縮17について説明しています。

<table><tbody><tr><td>Calcein AM</td><td>BIOTIUM</td><td>80011</td><td></td></tr><tr><td>較正済みマイクロキャピラリーピペット</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P0799</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CK-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td>サイトケラチンモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30081.05</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GIBCO、米国</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes、Solarbio Corp.、中国</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Ying 信頼性の高いバイオテクノロジー、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解 (RBCL)</td><td>Solarbio、北京</td><td>R1010</td><td></td></tr></tbody></table>

汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCの列挙は、CTCがまれで不均一であるため、患者の疾患を決定する上で不可欠です。CTCは原発腫瘍から剥離し、血液循環系に入り、離れた部位で増殖する可能性があるため、腫瘍が転移します。CTCは原発腫瘍と同様の情報を持っているため、CTCの分離とその後の特性評価は、がんのモニタリングと診断において重要な場合があります。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離の強力な方法です。マイクロ流体チップは、患者の痛みのないリキッドバイオプシー法を提供します。この研究では、CTCの分離、分析、および早期診断に必要な一連の機能とサービスを組み込んだ、汎用性の高いCTC分離プラットフォームである臨床マイクロ流体チップのプロトコルのリストを提示し、生体分子分析と癌治療を容易にします。このプログラムには、まれな腫瘍細胞カウント、赤血球溶解を含む臨床患者の血液前処理、およびマイクロ流体チップ上でのその 場 でのCTCの分離と認識が含まれます。このプログラムでは、腫瘍細胞またはCTCの正確な列挙が可能です。 さらに、このプログラムには、汎用性の高いマイクロ流体チップによるCTC分離と、チップ上の その場での 免疫蛍光同定、それに続く生体分子分析を組み込んだツールが含まれています。

セットアップ全体には、シリンジポンプ、シリンジ、およびマイクロ流体チップが含まれます。シリンジ内の細胞懸濁液をシリンジポンプに接続し、細胞懸濁液をマイクロ流体チップに導入して細胞を捕捉します。利用したすべてのマイクロ流体チップの捕捉効率は約90%以上でした。ウェーブチップでは、ギャップの異なる微細構造を設計しました。小さなギャップはCTCを捕捉するために使用され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。細胞懸濁液は大きなギャップ領域で素早く流れます。欠落したCTCは、後続のアレイ16の小さなギャップによって捕捉される傾向がある。楕円チップの場合、ポイントとポイントのギャップではなくラインラインギャップを設計して、キャプチャを強化するためにスリムなトンネルを形成しました。したがって、高い捕捉効率を達成した1.生存率を維持するために、エッジとコーナーを避けるように楕円構造を設計しました。台形フィルターには、台形と円形のマイクロポストバリアが埋め込まれた2つの円形スパイラルチャネルがあります。台形フィルターの場合、MCF-7、MDA-MB...

臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場 で循環腫瘍細胞(CTC)を免疫蛍光染色し、単一のCTCの迅速な検出と同定を可能にする重要な生物医学的分析技術です。

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

このプロトコルは、赤色腫瘍細胞列挙、および臨床CTC単離のための方法を記載した。はじめに、腫瘍細胞MCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaを細胞培養フラスコ中で10〜5回、1ミリメートルのDMEMで培養し、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。細胞株が接着性単層として95%コンフルエントに成長したら、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します。3マイクロリットルのカルセインAMを加えて腫瘍細胞を染色し、皿をインキュベーターに30分間入れます。インキュベーションの終わりに、トリプシンですべての細胞を消化します。細胞計数チャンバーを用いてPBS中の培養腫瘍細胞を計数し、PBS1ミリリットル当たり100個の腫瘍細胞が得られるまで希釈する。次に、希釈した細胞懸濁液を、シリンジポンプを備えたシリンジを用いて、様々な流速でマイクロ流体チップに導入する。さまざまな流量の捕捉効率を取得し、最適な流量を決定します。チップ上に捕捉され、出口から流出した腫瘍細胞の数を数えます。指定された式を使用してキャプチャ効率を計算します。この手順を繰り返して、10から100までの異なる数の腫瘍細胞の捕捉効率を得る。マイクロ流体チップの希少な数の腫瘍細胞をテストおよび検証します。マイクロピペットプラーで作られた中空針を使用して、これらの10サンプル懸濁液をマイクロ流体チップに注入し、希釈された腫瘍細胞を吸引します。チップ上で捕捉した後の各サンプルの腫瘍細胞の数を検出して列挙します。次に、腫瘍細胞をカルセインAMで染色し、5マイクロリットルのPBS中の100個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1ミリリットルの正常な血液サンプル全体にスパイクします。これらの細胞をチップに導入し、緑色の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙する。記載したように生体内列挙を行い、捕捉後の捕捉効率を算出する。染色せずに1〜10個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1ミリリットルの正常な血液全体にスパイクします。これらのサンプルをマイクロ流体チップに導入し、腫瘍細胞を捕捉します。20〜30マイクロリットルのPBSに3〜5マイクロリットルの蛍光色素を加え、この溶液をシリンジでチップに導入します。青と緑の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙し、捕捉効率を決定します。次に、チップの表面を100マイクロリットルの4%3-メルカプトプロピルトリメトキシシランとエタノールで室温で45分間修飾し、抗上皮細胞接着分子の親和性ベースの捕捉を行います。インキュベーションの終わりに、チップをエタノールで3回洗浄する。次に、100マイクロリットルのカップリング剤GMBSを追加し、30分間相互作用させます。インキュベーションの終わりに、注射器を使用してチップを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。チップを30〜40マイクロリットルの1ミリリットルあたり10マイクログラムのニュートラアビジンで室温で30分間処理し、細胞をGMBSに固定化してから、PBSで洗い流して余分なアビジンを除去します。3マイクロリットルの抗ビオチン化上皮細胞接着分子抗体でチップを修飾し、一晩インキュベートします。すべての腫瘍細胞は、細胞が欠落することなくウェーブチップのアレイの周囲に捕捉され、マイクロ流体チップの高い捕捉効率を示しています。ヘキストおよびカルセインAMで染色された腫瘍細胞をここに示す。小さな楕円マイクロフィルターを使用してキャプチャされた胃がん患者のCTCがここに示されています。また、台形のマイクロフィルターを使用してキャプチャされ、青色と緑色の両方の蛍光を発する結腸直腸癌患者のCTCが示されています。大きな楕円マイクロフィルターを使用して捕捉された腫瘍細胞について、高い捕捉効率と生存率が観察されました。マイクロ流体チップ上に捕捉された結腸直腸CTCの臨床免疫蛍光分析は、CTCをDAPI陽性、CK陽性、CD45陰性として認識し、WBCをDAPI陽性、CK陰性、CD45陽性として認識した。ここでは、大きな楕円チップ上で捕捉した後に培養した大腸腫瘍細胞と、大きな楕円マイクロフィルター上で捕捉した大腸腫瘍細胞を示します。アプタマーを用いたこの修飾方法は、CTC単離を強化するための新しいアプローチを提供します。

clinical-microfluidic-chip-platform-for-isolation-versatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。...

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。...

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。...

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。...

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

プロトコルは、ポリ（N -iso-プロピル）効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞（CTC）の熱応答性放出のための（PIPAAm）コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。...

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs...

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

循環腫瘍細胞(CTC)の特徴付けは、翻訳研究で一般的な話題です。このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)患者サンプルにおけるCTCのPD-L1特性測定および列挙に関する半自動免疫蛍光(IF)アッセイについて説明する。...

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin...

in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。...

循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ臨床用マイクロ流体チップを用いた循環腫瘍細胞の単離法。MCF-7、MDA-MB-231、HeLa細胞株を培養し、Calcein AM染色と免疫蛍光法で迅速に検出・同定します。がん診断の精度向上に貢献します。

汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム

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