汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム
2023年10月13日
臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場 で循環腫瘍細胞(CTC)を免疫蛍光染色し、単一のCTCの迅速な検出と同定を可能にする重要な生物医学的分析技術です。
このプロトコルは、赤色腫瘍細胞列挙、および臨床CTC単離のための方法を記載した。はじめに、腫瘍細胞MCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaを細胞培養フラスコ中で10〜5回、1ミリメートルのDMEMで培養し、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。
細胞株が接着性単層として95%コンフルエントに成長したら、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します。3マイクロリットルのカルセインAMを加えて腫瘍細胞を染色し、皿をインキュベーターに30分間入れます。インキュベーションの終わりに、トリプシンですべての細胞を消化します。
細胞計数チャンバーを用いてPBS中の培養腫瘍細胞を計数し、PBS1ミリリットル当たり100個の腫瘍細胞が得られるまで希釈する。次に、希釈した細胞懸濁液を、シリンジポンプを備えたシリンジを用いて、様々な流速でマイクロ流体チップに導入する。さまざまな流量の捕捉効率を取得し、最適な流量を決定します。
チップ上に捕捉され、出口から流出した腫瘍細胞の数を数えます。指定された式を使用してキャプチャ効率を計算します。この手順を繰り返して、10から100までの異なる数の腫瘍細胞の捕捉効率を得る。
マイクロ流体チップの希少な数の腫瘍細胞をテストおよび検証します。マイクロピペットプラーで作られた中空針を使用して、これらの10サンプル懸濁液をマイクロ流体チップに注入し、希釈された腫瘍細胞を吸引します。チップ上で捕捉した後の各サンプルの腫瘍細胞の数を検出して列挙します。
次に、腫瘍細胞をカルセインAMで染色し、5マイクロリットルのPBS中の100個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1ミリリットルの正常な血液サンプル全体にスパイクします。これらの細胞をチップに導入し、緑色の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙する。
記載したように生体内列挙を行い、捕捉後の捕捉効率を算出する。染色せずに1〜10個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1ミリリットルの正常な血液全体にスパイクします。
これらのサンプルをマイクロ流体チップに導入し、腫瘍細胞を捕捉します。20〜30マイクロリットルのPBSに3〜5マイクロリットルの蛍光色素を加え、この溶液をシリンジでチップに導入します。青と緑の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙し、捕捉効率を決定します。
次に、チップの表面を100マイクロリットルの4%3-メルカプトプロピルトリメトキシシランとエタノールで室温で45分間修飾し、抗上皮細胞接着分子の親和性ベースの捕捉を行います。インキュベーションの終わりに、チップをエタノールで3回洗浄する。次に、100マイクロリットルのカップリング剤GMBSを追加し、30分間相互作用させます。
インキュベーションの終わりに、注射器を使用してチップを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。チップを30〜40マイクロリットルの1ミリリットルあたり10マイクログラムのニュートラアビジンで室温で30分間処理し、細胞をGMBSに固定化してから、PBSで洗い流して余分なアビジンを除去します。3マイクロリットルの抗ビオチン化上皮細胞接着分子抗体でチップを修飾し、一晩インキュベートします。
すべての腫瘍細胞は、細胞が欠落することなくウェーブチップのアレイの周囲に捕捉され、マイクロ流体チップの高い捕捉効率を示しています。ヘキストおよびカルセインAMで染色された腫瘍細胞をここに示す。小さな楕円マイクロフィルターを使用してキャプチャされた胃がん患者のCTCがここに示されています。
また、台形のマイクロフィルターを使用してキャプチャされ、青色と緑色の両方の蛍光を発する結腸直腸癌患者のCTCが示されています。大きな楕円マイクロフィルターを使用して捕捉された腫瘍細胞について、高い捕捉効率と生存率が観察されました。マイクロ流体チップ上に捕捉された結腸直腸CTCの臨床免疫蛍光分析は、CTCをDAPI陽性、CK陽性、CD45陰性として認識し、WBCをDAPI陽性、CK陰性、CD45陽性として認識した。
ここでは、大きな楕円チップ上で捕捉した後に培養した大腸腫瘍細胞と、大きな楕円マイクロフィルター上で捕捉した大腸腫瘍細胞を示します。アプタマーを用いたこの修飾方法は、CTC単離を強化するための新しいアプローチを提供します。
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概要
このプロトコルは、臨床用マイクロ流体チップを使用して赤色腫瘍細胞を数え、循環腫瘍細胞（CTC）を分離する手法を説明しています。この技術は血液サンプルの前処理を簡素化し、単一のCTCの迅速な検出と同定を可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 生物医学分析
- 臨床診断
- 細胞培養技術
背景
- 循環腫瘍細胞（CTC）は、がんの診断とモニタリングに重要です。
- マイクロ流体チップは、CTCの分離効率を高めます。
- 免疫蛍光染色は、CTCの可視化を助けます。
- 標準的な細胞培養法は、腫瘍細胞を分析のために準備するために不可欠です。
研究目的
- CTCの信頼できる数え方を開発すること。
- 臨床血液サンプル処理の効率を向上させること。
- in situでのCTCの同定を容易にすること。
使用された方法
- DMEMでの腫瘍細胞株（MCF-7、MDA-MB-231、HeLa）の培養。
- 可視化のためのCalcein AMによる細胞の染色。
- 数えるためにトリプシンによる細胞の剥離。
- CTCの分離と分析のためのマイクロ流体チップの使用。
主要な結果
- 赤色腫瘍細胞の成功的な数え。
- 血液サンプルからのCTCの効率的な分離。
- 臨床現場でのマイクロ流体チップの有効性の実証。
- 免疫蛍光染色を通じた単一CTCの迅速な同定。
結論
- マイクロ流体チップはCTC分析のための貴重なツールです。
- この方法はがん診断の速度と正確性を向上させます。
- さらなる研究により、臨床腫瘍学での応用を拡大できる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and enumeration of circulating tumor cells (CTCs) are critical for advancing liquid biopsy strategies in oncology drug discovery and translational research. This microfluidic chip platform enables high-sensitivity detection and in situ characterization of rare CTCs, supporting predictive biomarker development and early-stage mechanistic de-risking. Integration of affinity-based capture and immunofluorescence analysis positions this technology at a key inflection point for portfolio triage and target validation in cancer R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumor cell heterogeneity and metastatic potential through rare cell capture.
- Supports functional validation of epithelial and mesenchymal markers via immunofluorescence staining.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct enumeration and phenotyping of CTCs from clinical samples.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for preparing and analyzing blood samples for CTC content.
- Delivers quantitative outputs for capture efficiency and cell viability, supporting assay reproducibility.
- Enables platform scalability and reuse for compound screening or biomarker studies involving rare cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ CTC characterization from patient samples.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by bridging in vitro and clinical sample analysis.
- Reduces biological risk in candidate selection by providing real-time, patient-derived cellular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic chip platform fits within the discovery-to-translational continuum, enabling early hypothesis testing, lead identification, and preclinical biomarker validation for oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of CTC biology and metastatic mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative CTC enumeration and viability metrics for assay development.
- Analytics: Provides immunofluorescence-based phenotyping and statistical capture efficiency outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Enables direct analysis of patient-derived CTCs, supporting biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, reusable platform adaptable to diverse cancer types and biomarker panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in oncology research.
- Operational Value: Standardizes rare cell isolation and analysis, improving reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative CTC data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oncology assets based on translational biomarker evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, immunofluorescence, and rare cell analysis.
- Needs access to cell culture, fluorescence microscopy, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptable to various tumor types and blood sample volumes with protocol optimization.
- Capture efficiency and marker specificity must be validated for each clinical context.
