Name: ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶTol2トランスジェネシスシステムを用いたDanio rerioのモジュール式ゲートウェイベース法。胎児アルコールスペクトラム障害研究のための効率的なトランスジェニックゼブラフィッシュ作成プロトコルを習得できます。

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この記事で紹介した研究は、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH / NIAAA)R00AA023560からCBLへの助成金によってサポートされました。

この手順で使用されたすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル12に従って飼育および飼育されました。これらのプロトコルはルイビル大学によって承認されました。
注:野生型ゼブラフィッシュ株AB、および bmp4st72;smad5b1100 二重変異株をこの研究で使用しました。この手順で使用した水はすべて滅菌逆浸透水であった。共焦点画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡で撮影した。内胚葉の測定は、ImageJの測定ツールを使用して行われました。すべての統計分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました。
1.ソリューションとメディアの作成
<ol><li>細菌培地:製造元の指示に従ってLBブロスまたは寒天を溶解し、オートクレーブします。培地を100 mmペトリ皿に注ぐ前に、アンピシリン(50 μg / mL)、カナマイシン(50 μg / mL)、またはアンピシリン/クロラムフェニコールの組み合わせ(それぞれ50 μg / mLと30 μg / mL)を追加します。.</li>
	<li>20倍の胚培地ストックを作るには、1 Lの水に次のものを溶解します:17.5 gのNaCl、0.75 gのKCl、2.9 gのCaCl 2、0.41 gのK 2 HPO 4、0.142 gのNa 2 HPO 4、および4.9 gのMgSO 4·7H 2O。 0.22 μmの真空ろ過システムを使用して原液をろ過滅菌します。 4°Cで保存します。 注意: 形成される白い沈殿物は無視してください。これはメディアに影響を与えません。</li>
	<li>19 Lの水に1.2 gのNaHCO3 を溶解し、1 Lの20x胚培地ストックを加えて作業胚培地溶液を生成し、この溶液を28°Cに維持します。</li>
	<li>2%フェノールレッド溶液の場合、フェノールレッドナトリウム塩20 mgをRNaseフリー水1 mLに溶解し、室温で保存します。</li>
</ol>2.胚射出成形金型
<ol><li>アガロース注入プレートを作るには、沸騰するまで加熱することにより、胚培地にアガロースを最終濃度3%まで溶解します。</li>
	<li>50 mLのアガロースを100 mmのペトリ皿に注ぎ、アガロースがまだ液体である間に、射出成形金型をアガロースにそっと置き、金型の下に気泡が形成されないようにします。</li>
	<li>アガロースプレートを冷まします。アガロースが固まったら、射出成形金型を取り外し、使用できるようになるまで4°Cで保管します。</li>
</ol>3. インジェクションピペット
<ol><li>ソレノイドを2.5に、発熱体を14.6に設定した垂直ピペットプーラーを使用して、フィラメントを含む1.0 mm(OD)キャピラリーを針に引き込みます。 注:加熱されたプーラーは、毛細血管を2本の針にきれいに均等に引っ張れば機能しますが、一貫した注射結果を得るには、ゼブラフィッシュ胚を注入してから1週間以内に注射針を引っ張る必要があります。<ol><li>キャピラリーをプーラーに配置し、クランプの両端を締めてから、発熱体をアクティブにします。</li>
		<li>毛細血管を引っ張って2本の注射針を作ります。</li>
		<li>プラーから毛細血管を取り外し、ニードルホルダーとして機能するモデリング粘土のストリップを備えた空のペトリ皿に保管します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. トランスポゼmRNA調製
<ol><li>トランスポザーゼを含むTol2KitプラスミドをNotI制限エンドヌクレアーゼで直線化するには、0.5 mLマイクロ遠心チューブで以下を組み合わせることで、トランスポザーゼプラスミド10 μL(150 ng/μL)、制限エンドヌクレアーゼ1.5 μL、NotIエンドヌクレアーゼ0.3 μLを組み合わせます。</li>
	<li>反応液を20 μLまでRNaseフリーの水で満たし、37°Cで一晩混合して消化します。</li>
	<li>消化反応に1 μLの0.5 M EDTA(pH 8.0)、2 μLの5 M NH4OAc、および80 μLの100%EtOHを加えてトランスポザーゼ消化を停止し、-20°Cで一晩混合して冷却します。</li>
	<li>溶液を14,000x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を吸引してDNAペレットをRNaseフリーの水に再懸濁します。</li>
	<li>蛍光光度計を使用して、最初に2 μLのRNaseフリーウォーターブランクを実行し、次に2 μLの直鎖状プラスミドを実行して、直鎖プラスミド濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で決定します。 注:プラスミド濃度は通常100〜200 ng / μLの範囲です</li>
	<li>0.5 mLの微量遠心チューブで次の成分を順番に組み合わせて、SP6 mRNAの生産をセットアップします:10 μLの2x NTP/CAP、2 μLの10x反応バッファー、0.1-1 μgの線状DNAテンプレート、および2 μLのSP6酵素ミックス。</li>
	<li>反応液をRNaseフリーの水で最大20 μL満たし、混合して37°Cで2時間インキュベートします。</li>
	<li>2時間インキュベートした後、1 μLのDNaseを加えてよく混合し、37°Cでさらに15分間インキュベートします。</li>
	<li>SP6反応を停止するには、30 μLのLiCl沈殿溶液を反応管に加え、混合して-20°Cで一晩冷却します。</li>
	<li>溶液を14,000 x g で4°Cで20分間遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引してmRNAペレットを1 mLの80%EtOH(RNaseフリー水で希釈)で洗浄します。</li>
	<li>溶液を14,000 x g で4°Cで20分間遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引します。ペレットを風乾させます。</li>
	<li>mRNAペレットを20 μLのRNaseフリー水に再懸濁し、ステップ4.5に記載されている蛍光光度計を使用してmRNA濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で測定し(少なくとも100 ng/μLである必要があります)、単回使用の場合はチューブあたり100 ngのmRNAを分注し、-80°Cで保存します。 注:mRNAが分解されていないことを確認するために、2 μLのmRNAをDNA電気泳動ゲル上ですばやく実行して、1,950 bpsで単一バンドを確認することができます。</li>
</ol>5. トランスジェネシスのエントリーベクターを作成するためのマルチサイトゲートウェイクローニング
注:このプロトコルはKwan et al.10から変更されており、LR反応はハーフLR反応として書かれており、総容量は5μLです。新しいエントリ要素を生成するには、5'、中間、および3'ドナーベクターを使用するBP反応を使用する必要があります10,13。
<ol><li>反応を行うには、p5E、pME、およびp3Eをそれぞれ10 fmol、および宛先ベクター(pDest)を20 fmol集めます。 注:マルチサイトLR組換えは、5'エントリーベクター(p5E)、ミドルエントリーベクター(pME)、3'エントリーベクター(p3E)、および宛先ベクター(pDest)の4つの異なるプラスミドベクターを使用して、ゼブラフィッシュ胚に注入できるTol2リピートに隣接するユニークなトランスジェニック構築物を生成します。<ol><li>プラスミドソースから塩基対の4つのベクターすべてのサイズを特定します(表1、Tol2Kit Wikiページ14 またはAddgene11; 材料表を参照)。 注:新規ベクターの場合、市販のシーケンシング会社 を介した フルプラスミドシーケンシングにより、正確なプラスミドサイズをbpsで提供できます。</li>
		<li>ステップ4.5の説明に従って、蛍光光度計を使用して、4つのベクターすべての濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で決定します。</li>
		<li>DNAの重量を660 g/mol、プラスミドサイズ(bps単位)を使用して、10 fmol(エントリーベクター)または20 fmol(宛先ベクター)に到達するために必要なプラスミドの合計ナノグラム(ng)を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> 注:コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのMosimann研究室は、LR反応に必要なプラスミドの量(ng単位)とベクターの量(μL単位)を計算するために、無料で入手できるスプレッドシートを生成しました15。</li>
	</ol></li>
	<li>後述するコンストラクトsox17: EGFPCAAXを生成するには、以下のベクターを使用します:ゼブラフィッシュ sox17 プロモーターを含むp5Eベクター(サイズ16で6,918 bp)。プレニル化EGFPを含むpMEベクターであって、サイズ10で3,345bpであり、サイズ10で2,838 bpであるSV40後期ポリAシグナル配列を含むp3Eベクター;pDestはサイズ10で5,883 bpです。</li>
	<li>ステップ5.1.2で決定したプラスミド濃度と各ベクターのナノグラム(ng)単位の量(ステップ5.1.3)を使用して、10 fmol(エントリーベクター)または20 fmol(宛先ベクター)のいずれかに到達するために必要な各プラスミドの合計マイクロリットル(μL)を計算し、これを2で割って5 μLのハーフLR反応に使用します(以下の値はすべて 表2に記載されています)。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>10 fmolのp5E-sox17を生成するには、45.66 ng(濃度140.3 ng/μL)を使用し、滅菌水で4倍に希釈して0.65 μLを得ます。</li>
		<li>10 fmolのpME-EGFPCAAXを生成するには、22.08 ng(濃度213.5 ng/μL)を使用し、滅菌水で10倍に希釈して0.52 μLを得ます。</li>
		<li>10 fmolのp3E-ポリAを生成するには、15.73 ng(濃度276.1 ng/μL)を使用し、滅菌水で20倍に希釈して0.57 μLを得ます。</li>
		<li>20 fmolの宛先ベクターに対して、77.66 ngのpDest(濃度307.3 ng/μL)を使用し、滅菌水で5倍に希釈して1.63 μLを得ます。</li>
	</ol></li>
	<li>5 μLのハーフLR反応をセットアップするには、ステップ5.3で決定したp5E、pME、p3E、およびpDestの容量を0.5 mLの微量遠心チューブに組み合わせ、滅菌水を加えて総反応容量4 μLにします。</li>
	<li>LR酵素ミックスを2回ずつ1分間激しくボルテックスして適切な混合を確保し、次に反応に1 μLを加えて完全に混合します。</li>
	<li>25°Cで一晩(16+時間)インキュベートします。</li>
	<li>0.5 μLのプロテイナーゼK(2 μg/μL)を加えてLR反応を停止し、37°Cで10分間インキュベートした後、室温まで冷却します。</li>
	<li>3〜4 μLのプラスミドを解凍した化学的にコンピテントな細胞に形質転換するには、プラスミドを添加し、細胞を氷上に25〜30分間放置します。</li>
	<li>細胞を氷の上に置いた状態で、2枚のLB-アンピシリン寒天プレートを室温に温めます。</li>
	<li>細胞を42°Cの水浴中で正確に30秒間ヒートショックします。</li>
	<li>ヒートショック後、抗生物質を含まないリッチな液体培地250 μLを細胞に加え、37°Cで1.5時間振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>1枚のアンピシリンプレートに300 μLの細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌朝、透明と不透明の2つの表現型の存在についてコロニーをスクリーニングし、透明なコロニー(Kwan et al.10に記載されている)を一度に1つずつ選び、液体培養液を接種し、37°Cで一晩振とうします。 注:透明なコロニーには、ほとんどの場合、正しいLRコロニーが含まれています(&gt;85%の確率)。</li>
	<li>製造元の指示に従って市販のキットを使用して、各液体培養でプラスミド調製を実行し、各プラスミドを診断的に消化して、LRゲートウェイ反応が適切に機能したことを示すトランスジェニックコンストラクトの適切なサイズを確認します。</li>
	<li>0.5-1 μLのプラスミドを使用して、ステップ5.4-5.12に記載されている標準的な細菌形質転換プロトコルを使用して正しいトランスジェニックコンストラクトを再形質転換し、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>コロニーを再ストリークし、それぞれがステップ5.14のようにLRトランスジェニック構築物を有することを確認する。</li>
	<li>ステップ4.5に記載されているようにプラスミド濃度を決定します(胚注射には少なくとも150 ng/μLが必要です)。</li>
</ol>6.導入遺伝子の胚への注入
<ol><li>シングルユーストランスポザーゼmRNAサンプルとTol2トランスジェニックコンストラクトを氷上で解凍し、アガロース注射プレートを室温に事前に警告します。</li>
	<li>氷上で次のものを組み合わせます:150 ngのプラスミド、100 ngのトランスポザーゼmRNA、および2%フェノールレッド(0.3 μL)。次に、RNAフリーの水を加えて容量を3μLにします。</li>
	<li>寒天を完全に覆うEMで満たされた注入プレート(ステップ2に記載)にトランスファーピペットを使用して1つの細胞段階の胚を移し、次に注入プレートのスロットあたり約50〜75個の胚を静かに押します。</li>
	<li>mRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物をキャピラリー注射針の開放端に追加し、キャピラリーニードルを射出リグアーマチュアに配置し、射出リグをオンにします。 メモ:注入リグは、空気などの圧縮ガスを使用して、活性化時にmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の所望の量(ステップ6.5で説明)を胚にパルスします。</li>
	<li>キャピラリーニードルを注入プレートのEMに下げ、鉗子を使用して先端を折って、少量のmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物のみを注入リグから汲み出すことができます。</li>
	<li>mRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の小さな3 nLボーラスを胚の細胞体に注入します。 注:3 nLボーラスは、理論的には7つのボーラスが胚の正中線全体に均等に適合するmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の体積です。</li>
	<li>胚の注入が終了したら、スロットからそっと飛び出し、新鮮なEM(約40 mL)を含む100 mmのペトリ皿にトランスファーピペッティングして注入プレートから取り出し、28.5°Cでインキュベートして胚を発育させます。</li>
</ol>7. 遺伝子導入胚のスクリーニング
<ol><li>蛍光タンパク質の発現には、蛍光導入遺伝子を発現させる適切な発生段階を選択し、蛍光解剖顕微鏡で蛍光の存在をスクリーニングします。 注:これらの胚は、その発現においてモザイク化され、トランスジェニック構築物のゲノム挿入を示す。</li>
	<li>異なる宛先ベクターに含まれる、遺伝子 cmlc2 またはmCherryの心臓特異的プロモーターによって駆動されるGFPなどの蛍光トランスジェニックマーカー(ステップ7.1に記載される)のスクリーニングによる非蛍光導入遺伝子のスクリーニング。</li>
	<li>トランスジェニック挿入陽性の胚が成体のゼブラフィッシュ期に完全に発達するのを待ちます。</li>
	<li>潜在的なトランスジェニック魚が繁殖年齢に達したら、野生型ゼブラフィッシュに繁殖させることにより、生殖細胞系列の伝達と導入遺伝子の発現性の両方について個別にスクリーニングします。</li>
	<li>胚が正常に発達し、最も強力かつ最も適切な導入遺伝子発現を与える成虫は、将来の研究と分析のためにユニークなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統として保持されます。 注:トランスジェニックコンストラクトのゲノム挿入をスクリーニングするための代替アプローチとして、トランスジェニックコンストラクトのみを増幅し、野生型DNAを増幅しないPCRプライマーを設計します。</li>
</ol>

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<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

ゼブラフィッシュは、エタノール曝露が発育および病態に与える影響を研究するのに理想的です7,8。ゼブラフィッシュは、半透明の、体外受精の、遺伝的に扱いやすい胚を大量に産生し、複数の環境状況で同時にいくつかの導入遺伝子標識組織および細胞タイプのライブイメージングを可能にします19,20。これらの強みは、ヒトとの強力な発生的遺伝的保存と相まって、ゼブラフィッシュをエタノールの影響を画像化するための強力なモデルシステムにしています7,8。ここでは、トランスジェニックコンストラクトを生成および注入し、将来のエタノール研究のためにトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を確立するためのモジュラーアプローチのプロトコルについて説明しました。
トランス...

出生前のエタノール曝露は、胎児アルコールスペクトラム障害(FASD)1,2,3,4と呼ばれる構造的欠損と認知障害の連続を引き起こします。複数の要因間の複雑な関係により、ヒトにおけるFASDの病因の研究と理解は困難になっています。この課題を解決するために、多種多様な動物モデルが使用されてきました。これらのモデルで利用可能な生物学的および実験的ツールは、エタノール催奇形性の機構的基礎の理解を深める上で重要であることが証明されており、これらのモデルシステムからの結果は、ヒトエタノール研究で見られるものと著しく一致しています5,6。これらの中で、ゼブラフィッシュはエタノール催奇形性を研究するための強力なモデルとして浮上しています7,8、部分的には、それらの外部受精、高い繁殖力、遺伝的扱いやすさ、および半透明の胚のために。これらの強みが組み合わさって、ゼブラフィッシュはトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いたFASDのリアルタイムライブイメージング研究に最適です。
トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の複数の側面を研究するために広く使用されています9。しかし、トランスジェニックコンストラクトとそれに続くトランスジェニック株を作成することは非常に困難な場合があります。標準的な導入遺伝子は、導入遺伝子を駆動するための活性プロモーター要素と、一般的なベクター維持のために安定した細菌ベクター中のポリAシグナルまたは「テール」を必要とします。多成分トランスジェニック構築物の従来の生成は、複数の時間のかかるサブクローニングステップ10を必要とする。ギブソンアセンブリなどのPCRベースのアプローチは、サブクローニングに関連する問題のいくつかを回避できます。しかしながら、固有のプライマーは、すべての固有のトランスジェニック構築物の生成のために設計および試験されなければならない10。導入遺伝子の構築を超えて、ゲノム統合、生殖細胞系列伝達、および適切な導入遺伝子統合のスクリーニングも困難でした。ここでは、トランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステム(Tol2Kit)を使用するためのプロトコルについて説明します10,11。このモジュラーシステムは、マルチサイトゲートウェイクローニングを使用して、「エントリ」および「宛先」ベクターの増え続けるライブラリから複数のトランスジェニックコンストラクトを迅速に生成します。統合されたTol2転移因子は、導入速度を大幅に増加させ、複数の導入遺伝子の迅速な構築とゲノム統合を可能にします。このシステムを使用して、内胚葉トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成を使用して、FASDの根底にある組織特異的な構造欠陥を研究する方法を示します。最終的に、このプロトコルでは、モジュラーセットアップとトランスジェニックコンストラクトの構築がゼブラフィッシュベースのFASD研究に大いに役立つことを示します。

<table><tbody><tr><td>Addgene Tol2ツールボックス</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Air</td><td></td><td></td><td>大学から直接提供</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>ホウ素 1.0 mm OD x 0.75 mm 内径 キャピラリー</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr>クロ<tr><td>ラムフェニコール</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>蛍光解剖顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>SZX16</td><td></td></tr>カナ<tr><td>マイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ローソンラボ ドナープラスミド調製</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB 寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>低EEO/多目的/分子生物学グレード アガロー</td>ス <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LRClonase II Plus</td><td>Enzyme Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(七水和物)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー</td><td>Applied Scientific</td><td>Instrumentation MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ 0.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ 1.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>応用科学機器</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ10 &mu;L&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ1000 &mu;L&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ200 &mu;L&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6転写キット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>モシマンラボTol2計算ワークシート</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度計</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 100 mm&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマンLp1000Lマイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマンLp200Lマイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマンLp2Lマイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム(二塩基性)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>圧力インジェクター</td><td>応用科学機器</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprepスピンミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(二塩基性)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>ステリカップ.22&micro;m 真空ろ過システム&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Wiki Page</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Chemically Competent E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Pipetter Puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション モールド</td><td>適応科学ツール</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュtol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、出生前のエタノール曝露によって生じる構造的欠陥および認知障害の非常に多様なセットによって特徴付けられる。FASDの複雑な病理のために、動物モデルはエタノール誘発性発達障害の現在の理解にとって重要であることが証明されています。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュとヒトの間の遺伝学と発生の両方の高度な保存のために、エタノール誘発性発達障害を調べるための強力なモデルであることが証明されています。モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは、遺伝的に扱いやすく半透明の多数の外部受精胚を含む、発生研究に理想的な多くの属性を持っています。これにより、研究者は複数の遺伝的状況でエタノール曝露のタイミングと投与量を正確に制御することができます。ゼブラフィッシュで利用可能な重要な遺伝的ツールの1つは、遺伝子導入です。しかし、トランスジェニック構築物の生成とトランスジェニック株の確立は複雑で困難な場合があります。この問題に対処するために、ゼブラフィッシュの研究者はトランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステムを確立しました。このモジュラーシステムは、マルチサイトGatewayクローニングアプローチを使用して、完全なTol2トランスポゾンベースのトランスジェニックコンストラクトを迅速に組み立てます。ここでは、柔軟なTol2システムツールボックスと、ゼブラフィッシュのトランスジェネシスの準備ができているトランスジェニックコンストラクトを生成するためのプロトコルと、エタノール研究におけるそれらの使用について説明します。

トランスジェニック構築物を生成するために、我々はTol2トランスジェネシスシステムを使用した。遺伝子プロモーター/エンハンサーエレメントを保持するp5E、プロモーター/エンハンサーエレメントによって発現される遺伝子を保持するpME、および少なくともpolyAテールを保持するp3Eを含む3つのエントリーベクターを使用して、マルチサイトゲートウェイLRクローニング を介して トランスジェニック構築物を生成しました。宛先ベクターpDestは、ゼブラフィッシュ胚におけるトランスジェニック構築物のゲノム挿入のためのTol2リピートを提供し、細菌の増殖に必要なすべての遺伝情報を含んでいます(図1A)。この原稿の目的のために、我々は sox17:EGFPCAAX トランスジェニックコンストラクトを作成して注入した。内胚葉 マーカーsox17のプロモーターは、ゼブラフィッシュの発育中の内胚葉において膜タグ付きEGFPを駆動するために使用されました。非蛍光色素タンパク質を発現するトランスジェニック構築物の場合、 cmlc2:EGFP ...

この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。

ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の理解に不可欠であることが証明されています。Tol2システムは、研究者がFASD研究のために複数のトランスジェニックゼブラフィッシュを迅速かつ体系的に生成することを可能にする汎用性の高いツールです。モジュラー設計と新しいキットコンポーネントの生成の容易さにより、Tol2システムは、キットのコンポーネントを再設計することなく、新しいトランスジェニックを生成するための汎用性の高いツールになります。この技術を初めて行う研究者への私のアドバイスは、トランスジェニックコンストラクトの生成と注入の精度を訓練するために数回の試運転を行うことです。まず、トランスポザーゼを含むTol2キットプラスミドを、10マイクロリットルのトランスポザーゼプラスミド、1.5マイクロリットルの制限エンドヌクレアーゼ反応バッファー、および0.3マイクロリットルの1つのエンドヌクレアーゼを500マイクロリットルのマイクロ遠心チューブに組み合わせて、1つの制限エンドヌクレアーゼで直線化します。反応液を20マイクロリットルまでRNAseフリーの水で満たします。摂氏37度で一晩混合して消化します。翌日、反応混合物に1マイクロリットルの0.5モルEDTA、2マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウム、および80マイクロリットルの100%エタノールを加えて消化を停止します。マイナス20°Cで一晩混ぜて冷やします。翌日、上清を遠心分離して吸引してから、DNAペレットをRNAseフリーの水に再懸濁します。次に、2マイクロリットルのサンプルを実行して、蛍光光度計でナノグラム/マイクロリットル単位の線形プラスミド濃度を決定します。500マイクロリットルのチューブに2マイクロリットルのSP6酵素ミックスに10マイクロリットルの2X NTP/CAP、2マイクロリットルの10X反応バッファー、0.1〜1マイクログラムの線状DNAテンプレートを組み合わせて、SP6 mRNAの生産を設定します。反応液をRNAseフリーの水で最大20マイクロリットル満たし、摂氏37度でインキュベートする前に混合します。2時間後、1マイクロリットルのDNAseを加え、よく混ぜて、さらに15分間インキュベートします。30マイクロリットルの塩化リチウム沈殿溶液を加えて反応を停止します。マイナス20°Cで一晩混ぜて冷やします。翌日、溶液を遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引してからペレットを1ミリリットルの80%エタノールで洗浄する。ペレットを風乾し、20マイクロリットルのRNAseフリー水に再懸濁します。蛍光光度計を使用してmRNA濃度を測定し、単回使用のためにチューブあたり100ナノグラムのmRNAを分注し、摂氏マイナス80度で保存します。反応を行うには、P5E、PME、およびP3Eのフェムトモールをそれぞれ10フェムトロール、および宛先ベクターPDESTのフェムトモールを20フェムトモールに集める。プラスミドソースから4つのベクターと塩基対すべてのサイズを特定します。DNAの重量をモルあたり660グラム、プラスミドサイズと塩基対を使用して、4つのベクターすべての濃度を決定した後、エントリーベクターの場合は10フェムトモール、宛先ベクターの場合は20フェムトモールに到達するために必要なプラスミドの合計ナノグラムを計算します。次に、原稿に記載されているコンポーネントを使用して、コンストラクトsox17:EGFP-CAAXを生成します。プラスミド濃度を使用して、10フェムトモールまたは20フェムトモールのいずれかに到達するために必要な各プラスミドの合計マイクロリットルを計算し、これを2で割って5マイクロリットルのハーフLR反応に使用します。P5E SOX17、PME EGFP-CAAX、P3E Poly(A)のフェムトロールを10個、デスティネーションベクターを20フェムトロール生成します。500マイクロリットルのチューブにP5E、PME、P3E、およびPDESTの容量を組み合わせて、5マイクロリットルのハーフLR反応を設定します。それから容量を4マイクロリットルにするために滅菌水を加えなさい。LR酵素混合物をそれぞれ1分間2回ボルテックスしてから、反応に1マイクロリットルを加え、摂氏25度でインキュベートする前に完全に混合します。翌日、0.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えてLR反応を停止し、摂氏37度で10分間インキュベートした後、室温まで冷却します。次に、プラスミドを添加し、細胞を氷上に25〜30分間放置することにより、3〜4マイクロリットルのプラスミドを解凍した化学的にコンピテントな細胞に変換します。次に、摂氏42度の水浴中で細胞を30秒間ヒートショックします。ヒートショック後、250マイクロリットルの抗生物質を含まないリッチ液体培地を細胞に加え、摂氏37度で1.5時間振とうしながらインキュベートします。300マイクロリットルの細菌懸濁液を1つのアンピシリンLuria-Bertaniプレートに広げ、一晩インキュベートします。翌日、コロニーの2つの表現型(透明と不透明)の存在をスクリーニングします。透明なコロニーを一度に1つずつピックし、液体培養液を接種し、摂氏37度で一晩振とうします。150ナノグラムのプラスミド、100ナノグラムのトランスポザーゼmRNA、および2%フェノールレッドを氷上で組み合わせます。次に、RNAを含まない水を加えて容量を3マイクロリットルにします。寒天を完全に覆うEMで満たされた注射プレートにトランスファーピペットを使用して1細胞期の胚を移し、注入プレートのスロットあたり約50〜75個の胚を静かに押します。mRNAプラスミドフェノールレッド混合物をキャピラリー注射針の開放端に追加します。キャピラリーニードルをインジェクションリグアーマチュアに配置し、インジェクションリグをオンにします。針を射出プレートに下げ、鉗子を使用して先端を折って、射出リグによって少量の混合物のみを排出できるようにします。mRNAプラスミドフェノールレッド混合物の3ナノリットルのボーラスを胚の細胞体に注入します。終了したら、スロットから胚をそっと飛び出して注入プレートから取り出し、新鮮なEMを入れた100ミリメートルのペトリ皿に移します。摂氏28.5度でインキュベートします。蛍光導入遺伝子発現に適した発生段階を選択し、蛍光解剖顕微鏡でスクリーニングします。遺伝子Cmlc2の心臓特異的プロモーターによって駆動されるGFPなどの蛍光トランスジェニックマーカーのスクリーニングによる非蛍光導入遺伝子のスクリーニング。遺伝子導入陽性の胚が成虫に発達して繁殖年齢に達したら、野生型ゼブラフィッシュに交配させて、生殖細胞系列の伝達と導入遺伝子の発現能を個別にスクリーニングします。LR組換えの形質転換から得られた細菌コロニーの例が示されている。透明なコロニーには85%以上の確率で正しいLR組換え産物が含まれていましたが、不透明なコロニーには正しい組換え産物が含まれていませんでした。LR組換え産物の形質転換からの3つのコロニーの診断消化は、単一の不透明なコロニーにはプラスミドを含まないことを示したが、2つの透明なコロニーは9,544塩基対の単一バンドを含んでいた。1,950塩基対のトランスポザーゼmRNAがここに示されている。モザイク内胚葉EGFP-CAAX発現は、注入された胚の75%で観察された。発達中の心臓におけるCmlc2 EGFPのトランスジェニックマーカー発現は、受精後24時間で観察された。成体ゼブラフィッシュはsox17:EGFP-CAAXの生殖細胞系列伝達を有し、内胚葉がEGFP-CAAXで完全に標識された蛍光胚が生成した。内胚葉の前後の長さと、パウチ1から5までの各パウチの背腹長の両方を、対照およびエタノール処理した野生型BMP変異胚で測定しました。内胚葉の全長は、遺伝子型や治療の影響を受けなかった。しかし、パウチ1および3は、未処理およびエタノール処理された野生型胚の間でパウチ長の有意な増加を示したが、未処理およびエタノール処理されたBMP変異体の間では長さの有意な減少を示した。パウチ2は、未処理およびエタノール処理された野生型およびBMP変異体群の間でそれぞれパウチサイズの有意な増加を示した。この手順を試みるときは、Tol2システムのピペッティングと希釈、および胚注入中の細胞体への打撃を正確に行うことが重要です。

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス

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Tol2トランスポゾン媒介ゼブラフィッシュトランスジェネシス:受精ゼブラフィッシュ胚へのTol2系共注入後のトランスジェニックゼブラフィッシュ作製法

このプロトコルは、ゼブラフィッシュにおける二次レポーターとして、第一次報告およびGFP / RFPとしてのGal4-VP16を用いた遺伝子トラップ挿入変異誘発方法が記載されている。 GFPおよびRFPを共発現が約1 10人に高発現F0魚の歩留まり遺伝子トラップ子孫。スクリーニング手順は、容易に挿入突然変異画面を行なう研究室のサイズに適合するようにスケーリングすることができる。...

ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

繁殖や生体内研究に適したゼブラフィッシュ施設は、簡単で手頃な価格で建設されています。メンテナンスは最小限で済みます。この施設は、学生の参加と独立した研究に最適です。...

手ごろな価格で簡単に構築ゼブラフィッシュ施設の建設

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ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos...

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

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ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

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ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

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