Name: 縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ固体培地を用いたC. elegansの長期培養法。個体の寿命と健康寿命を縦断的に追跡し、蛍光バイオマーカーの動態を観察できます。老化研究や環境ストレス応答の解析に有用です。

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この研究は、NIH R35GM133588からGLS、NIHT32GM008659トレーニング助成金、GLSへの米国医学アカデミー触媒賞、およびアリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金によってサポートされました。

<ol><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).</li>
<li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+%26+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li>
<li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormFarm%3A+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NemaLife+chip%3A+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+AS+%22Micro+and+Nano+Systems+for+Biophysical+Studies+of+Cells+and+Small+Organisms%22">Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms</a>. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).</li>
<li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li>
<li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).</li>
<li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30(2017).</li>
<li>Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li>
<li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li>
<li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li>
<li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li>
<li>Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).</li>
<li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormSizer%3A+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142(2013).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+track+of+worm+trackers%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li>
<li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoussel%2C+N+%22Worm%22">Worm</a>. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).</li>
<li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li>
<li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).</li>
<li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li>
<li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Medicine+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li>
</ol>

著者らは、開示すべき利益相反はないと述べています。

ここでは、もともとヒト白血球抗原組織タイピングアッセイ用に開発されたマイクロトレイを適応させ、C.エレガンス研究の標準である寒天ベースのNGMと文脈的に類似した固体培地環境で、単一のC.エレガンスの分離と特性評価を経時的に可能にする新しい培養システムについて説明します。このシステムは、食事制限、外因性薬物治療、化学的または環境的ストレッサーへの挑戦、RNAiなど、さまざまな介入と互換性があります。さらに、個々の動物におけるin vivoでの蛍光バイオマーカーの縦断的モニタリングを可能にします。集団内の個々の動物を追跡する能力により、行動、病因、ストレスの多い状態への反応、健康状態の低下など、明確な時間的要素を持つ表現型について、集団内の個体内変動性を評価できます。また、集団内で異なる幼少期の特徴を、寿命や健康などの晩年期の結果と結びつけることができます。他のシングルワームイメージング技術と同様に、このマイクロトレイベースの培養システムは、ワームが液体環境で培養されるときに発生するストレス応答経路の活性化などの潜在的な交絡因子を回避しながら、個々の動物を生涯を通じて複数の時点で監視する...

C. elegansは、実験室での培養が容易で、世代時間と寿命が短く、哺乳類と高度なタンパク質相同性を共有し、蛍光タンパク質や色素のin vivo可視化を可能にする透明な体構造を持っているため、遺伝学、細胞生物学、分子生物学の研究のための強力なモデル生物です1。発生生物学や老化を含むさまざまな分野で主要なモデルシステムとしてC.エレガンスが長年使用されてきた結果、その成長と発達はよく理解され、ゲノムは完全に配列決定され、ゲノムワイドRNAiフィードライブラリや数千の変異株やトランスジェニック株など、多くの強力な遺伝ツールが作成されています。歴史的に、C.エレガンスは固体寒天線虫増殖培地(NGM)上の集団として培養され、表現型は直接観察またはイメージングとダウンストリーム分析のいずれかによって手動で評価されています。蛍光顕微鏡は、個々のC.エレガンスの色素または遺伝子組み換え発現蛍光タグを使用して、さまざまな分子表現型をキャプチャするために使用されます。蛍光イメージングは通常、薄いアガロースパッドを含むスライド上で動物を固定または麻痺させることを含み、これは侵襲的であり、しばしば致命的です。また、レバミゾールやアジ化ナトリウムなどの化学物質の使用も含まれており、目的の分子プロセスを妨害する可能性があります2,3。これらのアプローチを組み合わせることで、広範囲の表現型にわたって横断的な集団レベルのデータを収集できますが、個々の動物を経時的に追跡することはできません。
近年、単離されたC.エレガンスを培養するためのいくつかのアプローチが登場し、研究者は新しいイメージング技術を利用して動物の生理学的および分子表現型の動的な変化を経時的に捉えることができます。C.エレガンス培養アプローチの1つのカテゴリは、WormFarm4、Nemalifeチップ5、およびChronisらによる「挙動」チップ6を含むマイクロ流体デバイスであり、とりわけ様々なもの7,8,9である。これらに関連する液体ベースの培養法は、マルチウェルプレートを使用して個々のワームまたは小さな集団を経時的に特徴付けます10,11。マイクロフルイディクスとマイクロプレートシステムは、C.エレガンスから1匹までの表現型応答の優れた定量的測定を提供しますが、培養環境には重要な制限があります。 C. elegansの過去の研究の大部分は、特に老化の分野で、固体寒天ベースの培地で完了しています。液体培養は、C.エレガンスを連続的に泳がせ、基礎となる生物学を変える可能性のある明確な環境状況を表しています。例えば、液体培地で培養された動物は、寒天ベースの固体NGM12,13で培養された動物と比較して、脂肪含有量と遺伝子発現(特にストレス応答に関与する遺伝子)が大幅に変化しました。単一動物イメージング法の代替カテゴリには、ペトリプレート上のグループ培養で固体NGMで培養されたワームが経験する標準的な環境をより厳密に模倣するために、固体培地上で個々の動物を分離するポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスが含まれます。WorMotelは、固体培地上で個々の動物を培養するために設計された240ウェルPDMS装置です。各ウェルは、寒天の代わりに低融点アガロースを使用した修飾NGMで満たされ、バクテリアフードが播種され、ペトリプレートを使用した最も一般的な培養システムと同様の固体培地環境が作成されます。ウェルの壁は丸いため、ウェル内の場所に関係なく各動物を画像化できます(マルチウェルプレートの壁の近くに動物によって引き起こされる視覚的な不明瞭さを回避します)。各ウェルを囲む狭い堀の硫酸銅は、動物をウェルに留めておくための抑止力として使用されます14,15。このアプローチの限界は、硫酸銅は、食事制限、病原菌、または細胞ストレスを誘発する化学物質(パラコートなど)を含む嫌悪的な環境条件が存在する場合に、ワームが逃げるのを防ぐのに効果がないことです。
固体培地を使用する2番目のシステムは、ヒドロゲルを使用してスライド上の各ワームの小さな密閉環境を作成し、個別に分離された動物の長期モニタリングを可能にするWorm Corralです16。主な制限は、動物を卵として環境に密封する必要があり、繁殖を防ぐために無菌動物を使用する必要があり、薬物治療を単一の用途に制限することです。複数回投与の薬物試験は、ワームをデバイスに移す前に複数回の曝露を実施するか、実験中にウェルに局所的に薬物を追加することによって、WorMotelで達成できます。しかしながら、後者の場合、既存のウェルに追加の薬物を添加した後の実際の曝露量は正確に定量することは困難であり、そして薬物がどれだけ急速に分解するかに依存する。WorMotelとWorm Corralはどちらも、活動や動物の生理学(成長や発達など)に関連する情報をキャプチャするための明視野または暗視野イメージングに最適です。これらのシステムは蛍光のモニタリングに使用できますが、私たちの経験では、他のシングルワームイメージング技術の作成に使用されるPDMSは、マイクロバブルを形成したり、粒子を捕捉したり、不規則な蛍光アーチファクトを生成したりするその他の小さな異常が発生しやすく、特に C.elegans 研究で使用される最も一般的な蛍光色素であるGFPの発光範囲で、一貫した蛍光の視覚化と定量を妨げます。今日まで、縦方向の 様式でのC.エレガンス 個々の動物のライブ蛍光イメージングは、主にマイクロ流体デバイス17に依存している。
ここでは、嫌悪的介入と直接蛍光イメージングの両方に適合する固体培地上で個々のC.elegansを培養するための新しい方法について説明します。このアプローチは、カスタム成形されたPDMSチップが、マイクロ細胞毒性アッセイ用に開発された市販のポリスチレンマイクロトレイ(一般にテラサキトレイとも呼ばれる)に置き換えられることを除いて、他のシングルワームイメージング技術と概念が似ています18。これらのマイクロトレイは、固体培地を充填し、細菌性食品を播種できるウェルを備えており、標準的な固体NGM培養方法論の下で動物が経験する環境を厳密に模倣しています。各ウェルは、硫酸銅ではなくパルミチン酸の嫌悪バリアに囲まれています。パルミチン酸は、食事制限や化学的ストレッサーへの曝露などの嫌悪的な環境でワームが挑戦される実験で、ペトリプレート上の標準的なグループ培養を使用して、ワームが固体培地から逃げるのを防ぐために一般的に使用されます。また、マイクロトレイは最小限の一貫した蛍光バックグラウンドを生成し、培養環境で直接動物の蛍光イメージングを可能にします。この新しい単一動物の固体寒天ベースの培養システムは、生涯を通じて個々の動物を追跡し、成長、発達、活動、および寿命を監視できるだけでなく、直接蛍光顕微鏡法とも互換性があります。麻痺や固定なしに線虫を画像化できるため、培養液上に残っている個々の動物においてin vivo蛍光バイオマーカーを縦方向に定量することができ、各動物の生涯にわたる動的変化を観察することができます。この培養システムは、寿命およびその他の健康指標を追跡するための現世代の自動化システムとも互換性がある14,19。このマイクロトレイベースのシステムで個々のC.エレガンスを培養するための詳細なプロトコルを提供し、潜在的な落とし穴とトラブルシューティングについて説明し、他のシステム、特に更新および最適化されたWorMotelプロトコル15と比較した利点と制限について説明します。
各シングルワーム培養環境は、カスタム3Dプリントアダプターを使用して標準のシングルウェルトレイ内に取り付けられたマイクロトレイで構成されています(図1A)。ウェルは低融点アガロース線虫増殖培地(lmNGM)で満たされ、食物源として濃縮細菌が播種され、ワームが逃げるのを防ぐためにパルミチン酸コーティングで囲まれています(図1B)。マイクロトレイとシングルウェルプレートの壁の間のスペースは、湿度を維持するために飽和水結晶で満たされています(図1B)。結露を防ぐために、トレイの蓋には洗剤コーティングが施されています。各ウェルに1つのワームを追加し、1つのウェルトレイをパラフィルムで密封して水分を維持し、酸素交換を可能にします。最大6つのマイクロトレイは、1人の実践的な研究者によって合理的に並行して準備することができます。

<table><tbody><tr><td>3Dプリントテラサキインサート</td><td>カスタム印刷会社</td><td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL</td><td>FDM印刷、ノズルサイズ0.6 mm、標準PLAプラスフィラメントを使用</td></tr><tr><td>AirCleanシステムAC624LF垂直層流ヒュームフード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>36-100-4376</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros organics</td><td>349615000</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>N2</td><td>野生型株</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>Goldbio</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>101380</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>C. elegans</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ミリポア</td>のための標準的な実験室食品 <td>ex0276-4</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>FUdR&nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>F10705-1.0</td><td></td></tr><tr><td>ハイドレーティングウォータークリスタル&nbsp;</td><td>M2 Polymer Technologies</td><td>Type S</td><td>Type S 高吸水性ポリマー</td></tr><tr><td>Isopropyl &szlig;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>GoldBio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>Task</td></tr><tr><td>wipes LB Broth, Lennox</td><td>BD Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>ライカ K5 sCMOS モノクロカメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>11547112</td><td></td></tr><tr><td>ライカ M205 FCA 蛍光体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>低溶融アガロース</td><td>研究製品 国際</td><td>A20070-250.0</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>M-8900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray シングルウェルプレート</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>264728</td><td></td></tr><tr><td>ナイスタチン</td><td>シグマ</td><td>N1538</td><td></td></tr><tr><td>パルミチン酸</td><td>アクロス有機物</td><td>129700010</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>コーストワイドプロフェッショナル</td><td>365374</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムM</td><td>パラフィルム</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>UV 架橋機</td></tr><tr><td>寺崎トレー(ラムダ)</td><td>ラムダ</td><td>151431</td><td></td></tr><tr><td>1個 サーモリン Dri-bath</td><td>サーモリン</td><td>DB28125</td><td></td></tr><tr><td>Tween&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr></tbody></table>

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

カエノラブディティスエレガンスは 、老化生物学の研究に広く使用されています。 C. elegans 老化研究の標準的な方法は、固体線虫増殖培地(NGM)上で線虫のグループを培養し、生存およびその他の生理学的表現型に関する集団レベルのデータの効率的な収集を可能にし、蛍光バイオマーカー定量のための亜集団の定期的なサンプリングを可能にします。このアプローチの限界は、(1)個々の線虫を経時的に追跡して、関心のある表現型の年齢軌跡を開発することができないこと、および(2)培養環境のコンテキストで蛍光バイオマーカーを直接監視できないことです。代替培養アプローチでは、液体培養またはマイクロフルイディクスを使用して、個々の動物を経時的にモニタリングし、場合によっては蛍光定量を含め、培養環境が固体NGMとは文脈的に異なるというトレードオフがあります。WorMotelは、固体NGM上で単離されたワームを培養するための前述の微細加工マルチウェルデバイスです。各ワームは、 C. elegansの接触忌避剤である硫酸銅で満たされた堀に囲まれた固体NGMを含むウェルに維持され、個々の動物の縦方向のモニタリングを可能にします。硫酸銅は、食事制限、病原菌、細胞ストレスを誘発する化学物質など、老化研究で一般的な嫌悪的な介入を受けた場合、ワームの逃げを防ぐには不十分であることがわかりました。マルチウェルデバイスもポリジメチルシロキサンから成形されているため、蛍光イメージングで高いバックグラウンドアーチファクトが発生します。このプロトコルは、もともとヒト白血球抗原(HLA)タイピング用に設計された市販のポリスチレンマイクロトレイを使用して、固形NGM上で単離された回虫を培養するための新しいアプローチを説明し、寿命全体にわたる生存、生理学的表現型、および蛍光の測定を可能にします。パルミチン酸バリアは、嫌悪条件が存在する場合でも、ワームが逃げるのを防ぎます。各プレートは最大96匹の動物を培養でき、食事制限、RNAi、化学添加物などのさまざまな条件に簡単に適応でき、寿命と活動データを収集するための自動システムと互換性があります。

ここで説明するマイクロトレイベースのシングルワーム培養環境は、寿命と健康寿命、活動と動き、体型とクロール形状、個々の動物におけるトランスジェニック発現蛍光バイオマーカーの発現など、さまざまな表現型を経時的に監視するために使用できます。マイクロトレイ培養システムは、手動スコアリングまたは画像収集およびダウンストリームイメージング分析のいずれかによる寿命分析と互換性があります。ペトリプレート21上の標準的な培養と同様に、ワームは、刺激(例えば、プレートを叩くか、または青色光への曝露)に続く動きに基づいて、死んでいるか生きているかを手動でスコアリングすることができる。画像ベースの寿命分析では、刺激が適用された後に撮影された画像間のフレーム間の違いの比較を使用して、各ワームがいつ動きを停止するかを決定します。これは、自動画像収集および分析システムと互換性があり、各時点での個々の動物の活動レベルの形で追加データを提供します。この情報は、寿命(運動の停止)だけでなく、健康寿命(活動の低下の閾値、複数の定義が提案されている)を推定するためにも使用できます。これらの画像から、追加のパラメータ(体のサイズ、...

ここでは、生涯にわたる生理学的パラメータの追跡と蛍光定量のために、単離された個々の線虫を固体培地上で培養するためのプロトコルを紹介します。この培養システムには、動物が逃げるのを防ぐために、シングルワームウェルの周りにパルミチン酸バリアが含まれており、病原菌や化学的ストレッサーなどの嫌悪的介入を使用できます。

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

他の固体培養方法も存在しますが、これは、個々の動物の生命と健康寿命の縦断的追跡と蛍光バイオマーカーの縦方向イメージングを1つのシステムで自動的に可能にする最初の固体培養システムです。このプロトコルは、固体NGMに関する標準的なC.elegans実験に匹敵する結果を提供し、嫌悪的介入と直接ライブ蛍光イメージングの両方と互換性があります。このシステムは、特に環境ストレス要因への長期暴露や遺伝子やタンパク質の動態の長期観察など、老化研究にとって非常に貴重です。汚染の回避とウェル全体で一貫した乾燥を得ることは、どちらも困難です。これらの問題を最小限に抑えるために、書面によるプロトコルの重要なポイントを強調しました。はじめに、乳鉢と乳棒で500ミリグラムの固形パルミチン酸を挽きます。50ミリリットルの円錐バイアルに入った15ミリリットルのTWEEN 20と混ぜ合わせ、ボルテックスで混合して結晶を溶解します。17.5ミリリットルの100%エタノールを加え、溶液をボルテックスしてできるだけ多くのパルミチン酸を溶解します。次に、17.5ミリリットルの超純水を加え、激しく渦巻きます。パルミチン酸が完全に溶解するまで、摂氏80度のビーズバスで溶液を静かに加熱します。ビーズバスを摂氏80度に再加熱します。使用直前に、マイクロトレイあたり1ミリリットルのパルミチン酸作業溶液を別の滅菌容器に分注し、加熱する前にパルミチン酸溶液1ミリリットルあたり4マイクロリットルのナイスタチンを加えます。次に、マイクロトレイの内側と外側にエタノールを飽和状態になるまでスプレーし、余分なエタノールを振り落とします。マイクロトレイを滅菌するには、プレートと蓋をUV架橋剤に別々に配置します。20分後、プレートと蓋を裏返します。次に、パルミチン酸作業溶液を含む15ミリリットルの円錐形バイアルをビーズ浴に入れ、目に見える結晶を完全に溶解させてから使用します。マイクロトレイをビーズバスを囲む棚に2分間蓋をして温めます。マイクロトレイの蓋を外し、マイクロトレイの後壁に200マイクロリットルのパルミチン酸作動溶液をゆっくりと加えます。蓋を元に戻し、マイクロトレイをビーズバスに2〜3分間置いて、パルミチン酸溶液がマイクロトレイの底部に沈殿するようにします。マイクロトレイを180度回転させ、前に示したようにパルミチン酸作業溶液を追加します。原稿に記載されているコンポーネントを追加してlmNGMを準備します。次に、20マイクロリットルのlmNGMをベンチに置かれた各マイクロトレイにピペットで入れます。汚染を最小限に抑えるために、ピペットを補充するときは必ずマイクロトレイを覆ってください。マイクロトレイウェルにバクテリアフードを播種するには、3, 500 Gで一晩増殖させた培養物を20分間遠心分離します。上清を除去し、85ミリモル塩化ナトリウム溶液で10倍の濃度で菌培養物を再懸濁した。次に、5マイクロリットルの10倍濃縮細菌培養物を各ウェルのlmNGMの表面に注意深くピペッティングします。バクテリア培養物を井戸の側面を越えてパルミチン酸に流すことは避けてください、これはワームを引き付けて井戸を離れるからです。滅菌3Dプリントインサートを滅菌シングルウェルプレートに入れます。マイクロトレイをシングルウェルプレートの3Dプリントアダプターに入れます。マイクロトレイの外側ウェルとシングルウェルプレートの内壁の間の3Dプリントインサートの上に水結晶を自由に分配します。ワームがすぐに追加されない場合は、翌日使用するためにマイクロトレイを密封します。トレイの蓋を閉め、1枚のパラフィルムを使用して4つの側面すべてを包み、マイクロトレイを密封します。3層に対して、パラフィルムでシールステップをさらに2回繰り返します。目的のライフステージに達したら、ウェルごとに1つのワームを追加します。シングルウェルプレートの蓋に40マイクロリットルの洗剤溶液を加え、タスクワイプを使用して蓋を均一にコーティングします。追加のタスクワイプを使用して、蓋からの視界が歪まなくなるまで洗剤溶液を広げます。パラフィルムの最初の部分を少し伸ばして、トレイの両側を覆います。トレイの上部をタスクワイプで拭き、70%エタノールで湿らせて指紋を取り除きます。プレートの側面または上部を軽くたたくか、プレートに明るい青色の光を当てて、各動物を観察して寿命を測定します。数秒以内に動かない場合は、動物を死に至らしめます。すべてのワームが死ぬまで、1〜3日ごとにこのタスクを繰り返します。単一ウェルで蛍光イメージングを実行します。硫酸銅とジチオスレイトールへの曝露は、ワームの寿命と健康寿命を大幅に短縮しました。対照的に、硫酸銅は健康で過ごす人生の割合を減らしましたが、ジチオスレイトールは減少しませんでした。硫酸銅は、すべての年齢でジチオスレイトールよりも集団内の個人全体の平均活性を大幅に低下させました。.生涯活動曲線下の個々の動物面積の集団平均は、硫酸銅またはジチオスレイトールによって実質的に損なわれる。10日目までの個々の動物の累積活動は、ジチオスレイトールに挑戦した動物の寿命と相関しますが、未処理の対照または硫酸銅に挑戦した動物の寿命と相関しません。.KYNU-1発現の劇的な増加は、成人期の3日目から8日目の間に観察され、その後は年齢とともに徐々に低下します。成人期14日目までの累積KYNU-1 mScarlet発現は、動物の寿命と相関しています。KYNU-1の発現は生涯を通じて動的であるため、個々の動物のさまざまな年齢でのKYNU-1の発現を全生存期間と比較しました。単一の時点で、KYNU-1発現が生存と有意に相関していませんでした。この手順を試みる場合、最も重要なステップは、パルミチン酸の添加、寒天のピペッティング、およびワームの導入です。この技術により、寿命と健康寿命の縦断的追跡、およびNGMアッセイに直接匹敵する方法で個々のワームの蛍光バイオマーカーが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、UV殺菌細菌食品を固体培地上で維持線虫の寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。...

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

液体ベースの培養および調剤のための手順...

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

動物を固定化せずに長期間にわたって行動と神経活動をイメージングすることは、行動を理解するための前提条件です。アガロースマイクロ流体チャンバーイメージング(AMI)は、線虫のすべてのライフステージの神経活動と行動をイメージングするために使用できます。...

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト...

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

このプロトコルでは、線虫みみずの動作における神経活動の変更を記録する遺伝子にエンコードされた Ca2...

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

この記事では、カスタム マイクロ流体デバイスを用いた個々 のワームのライブ...

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。...

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。...

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

腸内微生物は、特定のまたは保存されたメカニズム を介して 宿主の健康にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります。 カエノラブディティスエレガンスは 、そのような微生物をスクリーニングするための便利なプラットフォームです。本プロトコルは、線虫の健康状態の代理として使用される、線虫ストレス耐性への影響についての48の細菌分離株のハイスループットスクリーニングを記載している。...

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

ここには、微細加工されたマルチウェルデバイスの固体培地上で単離された個々の線虫を培養するための最適化されたプロトコルが提示されます。このアプローチにより、個々の動物を生涯を通じて監視して、活動、体のサイズと形状、運動の形状、生存など、老化と健康に関連するさまざまな表現型を確認できます。...

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

学ぶ固体培地を用いたC. elegansの長期培養法。個体の寿命と健康寿命を縦断的に追跡し、蛍光バイオマーカーの動態を観察できます。老化研究や環境ストレス応答の解析に有用です。

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々のカエノラブディティスエレガンスの長期培養

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