Name: 熱ショックタンパク質90阻害剤の発見のためのマラカイトグリーンアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶマラカイトグリーンアッセイを用いたHsp90阻害剤の発見法。ATP加水分解による遊離リン酸を測定し、がん研究における高スループットスクリーニングと自動化に対応する簡便で高感度な手法です。

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この研究は、科学情報通信部(NRF-2019H1D3A1A01102952)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)のポスドクフェローである韓国研究フェローシップ(KRF)プログラムの支援を受けました。著者らは、KISTの壁内助成金と海洋水産省の助成金番号2MRB130に、このプロジェクトに財政支援を提供してくれたことに感謝しています。

1.ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイ
<ol><li>アッセイバッファーの調製<ol><li>アッセイバッファーを調製し、 表1に示す組成および調製物に従って調製する。</li>
	</ol></li>
	<li>リン酸塩標準物質の作成<ol><li>マラカイトグリーンアッセイリン酸塩アッセイキットで提供される1 mMリン酸標準を使用してください(4°Cで保存)。</li>
		<li>960 μLの超純水に1 mMリン酸標準物質40 μLをピペットで入れ、40 μMリン酸溶液(プレミックス溶液)を得た。製造元の指示に従って、プレミックス溶液を超純水を加えて、0〜40μMのリン酸塩の段階希釈を形成します。</li>
	</ol></li>
	<li>酵母Hsp90の調製<ol><li>グリセロールストック濃度が0.66 mg / mLの酵母Hsp90を使用してください。使用直前に氷上で解凍してください。</li>
		<li>測定可能なATPアーゼ活性を得るには、8 μL(5.98 μg、0.80 μM)の酵母Hsp90を使用してください。ブランクとポジティブコントロールの間のマラカイトグリーン試薬添加後の光学濃度差が0.5以上1.0未満であることを確認してください。ここで、ブランク(Hsp90なし)とポジティブコントロール(Hsp90あり)の吸光度差は0.510であることがわかった。</li>
	</ol></li>
	<li>ATPの準備<ol><li>453.39 μLの超純水を含むバイアルに1 mgのATPを移し、4 mMのストック溶液を得た。無水ATPに基づいて重量計算を実行します(分子量[m.w.] = 551.14)。ATPは時間の経過とともに自然に加水分解する可能性があるため、新鮮に準備します。</li>
		<li>各ウェルに4 μLのATPストック溶液を加え、最終ウェル濃度0.2 mM(最終総アッセイウェル容量80 μL)を得た。マルチチャンネルピペットを使用して、反応の最後の成分としてATPを追加し、すべての反応が同時に開始されるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲルダナマイシン(GA)の調製<ol><li>1 mgを178.37 μLのDMSOに溶解して、10 mMのGAストックを調製します(m.w. = 560.64)。ストック溶液を使用して、連続希釈によりDMSO中の4 mM、0.8 mM、0.16 mM、0.032 mM、0.0064 mM、および0.00128 mM溶液を調製します。</li>
		<li>これらのストック溶液を各ウェルに2 μL添加し、それぞれ0.1 mM、0.02 mM、0.004 mM、0.0008 mM、0.00016 mM、および0.000032 mMの最終ウェル濃度を得ます。</li>
		<li>表 2 および 表3に記載のようにウェルを準備し、ブランク(緩衝液+水+DMSO)および陰性対照(Hsp90緩衝液+水+DMSO)を含むウェルを調製する。GA(緩衝液+水+GA中のHsp90)を含むウェルは、ポジティブコントロールとして機能します。</li>
	</ol></li>
	<li>ウェルプレートの調製と添加順序<ol><li>表2に示すレイアウトで96ウェルプレートを準備します。620nmで吸光度を示す化合物については、この波長の吸光度を記録するための別のウェルを調製する。GAはアッセイで使用された濃度に対して620 nmの吸光度を示さないため、GA用に別のウェルを調製しないでください。</li>
		<li>表3に示すように、各成分の総体積で各成分を準備します。</li>
		<li>各ウェルに超純水を添加してアッセイウェルを設置します。これに続いて、必要量のアッセイバッファーと化合物溶液(GA溶液など)を追加します。</li>
		<li>次に、Hsp90を適切なウェルに加え、プレートシェーカーで室温で2分間プレートを振とうします。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して4 μLのATP溶液を追加します。プレートをアルミホイルで包み、プレートシェーカー(200 rpm)で室温で2分間振とうします。プレートを37°Cで3時間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>マラカイトグリーン試薬の調製と添加<ol><li>マラカイトグリーン試薬は、試薬A(3M HCl中のモリブデン酸アンモニウム)およびB(マラカイトグリーンおよびポリビニルアルコール)からなる。使用前に試薬を室温に戻してください。試薬AとBを100:1の比率(1,000 μL:10 μL)で混合します。不安定で3時間後に分解が始まるため、使用前3時間以内に準備してください。</li>
		<li>ステップ1.6.5の3時間後、マルチチャンネルピペットを使用して、ATPと同じ順序で添加した20 μLのマラカイトグリーン試薬を加えて反応を停止します。</li>
		<li>室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620 nmにおけるプレートの吸光度を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. マラカイトグリーンアッセイによるHsp90阻害剤のハイスループットスクリーニング
注:ハイスループットスクリーニングのプロトコルは、ラボスケールの方法論に似ています。いずれの場合も最終的なウェル容量は80μLです。ただし、試薬の添加順序には若干の違いがあります。ラボスケールベースの方法では、溶液添加の5段階があります(34 μLの水、32 μLのバッファー、2 μLのDMSO溶液中の化合物、8 μLのHsp90、そして最後に4 μLのATP溶液)。対照的に、HTSでは、3段階の添加があります(酵母Hsp90を含む緩衝液40 μL、化合物を含む18 μLの水に2 μLのDMSO、最後に水に溶解した20 μLのATP)。HTSセットアップで正確にピペッティングできる溶液の最小量は20μLです。 したがって、ラボスケールとHTSスケールの間でピペッティングの違いが観察されます。
<ol><li>アッセイバッファー(pH 7.4)の調製<ol><li>HTSでは、ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイと同じバッファーを使用します(表1)。</li>
	</ol></li>
	<li>酵母Hsp90の調製<ol><li>グリセロールストック濃度が0.66 mg / mLのタンパク質を使用してください。.使用直前に氷上で解凍してください。</li>
		<li>測定可能なATPアーゼ活性を提供する酵母Hsp90を各ウェルに8 μL(5.98 μg、0.80 μM)使用します。</li>
		<li>各ウェルのバッファー(32 μL)でタンパク質(8 μL)を希釈します。各ウェルの最終的な総作業量は、総アッセイ容量80 μLで40 μLです。</li>
	</ol></li>
	<li>0.8 mM ATPの調製<ol><li>1 mgのATPを2,267 μLの蒸留水に溶解し、0.8 mMの溶液を得る。各ウェルの総作業量は、80 μLの総アッセイ容量で20 μLです。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲルダナマイシン(GA)/試験化合物の調製<ol><li>ステップ1.5のように、DMSOで0.8 mMのGAストックを準備します。GAストック10 μLを90 μLの水で希釈し、最終濃度80 μMにします。</li>
		<li>20 μLの80 μM GA溶液を適切なアッセイウェル(最終総アッセイウェル容量=80 μL)で使用し、最終ウェル濃度を20 μMにします。これはポジティブコントロールとして機能します。</li>
		<li>試験化合物については、評価に必要な濃度に従ってDMSO溶液を準備します。</li>
		<li>ブランク(バッファー+水+DMSO)およびネガティブコントロールウェル(Hsp90バッファー+水+DMSO)に添加するために、90 μLの水中に10 μLのDMSOを調製します。同様の方法で、100 μMの最終ウェル濃度で試験化合物を調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>アッセイプレートの設計と添加順序<ol><li>4つのメインプレート、1つのコンパウンドプレート、および試薬ストックを含む4つの添加プレートを使用してアッセイをセットアップします(図2 および 表4)。</li>
		<li>さらに、プレートAに、各ウェルに90 μLのアッセイバッファーを加える;プレートBを加えて、各ウェルにHsp90を含む90 μLのバッファーを追加します。プレートCおよびDを添加し、各ウェルにそれぞれ90μLのATPおよび90μLのマラカイトグリーン試薬を添加する(表5 および 表6)。</li>
		<li>添加プレートAとプレートBから、自動マルチチャンネル分注システムを使用して、各ウェルからそれぞれメインプレート1と2、および3と4に40 μLの溶液を移します。ここでは、Biomek(R) FXP ラボラトリーオートメーションワークステーションを使用しました(図2 および 表6)。</li>
		<li>コンパウンドプレートの各ウェルから、20 μLの溶液をメインプレート1、2、3、および4に移します(図2)。プレートをシェーカー(200 rpm)で1分間振とうします。</li>
		<li>添加プレートC(ATP)の各ウェルから、20 μLの溶液をメインプレート1、2、3、および4に移します(図2)。プレートをシェーカー(200 rpm)で1分間振とうします。</li>
		<li>プレートを37°Cで3時間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ1.7に従ってマラカイトグリーン試薬を準備します。3時間後、20 μLのマラカイトグリーン試薬を追加プレートDからメインプレート1、2、3、4のウェルに移します(図2)。</li>
		<li>室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620nmであるプレートの吸光度を測定する。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
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Hsp90は、新規抗がん剤分子の発見のための重要な標的である。1994年に創薬性が確立されて以来、10、18分子が臨床試験に達しています。現在、7つの分子が単独で、または組み合わせて、臨床試験のさまざまな段階にあります22。このような小分子はすべてN末端ATP結合阻害剤である。シャペロンを阻害する他の手段(C末端阻害剤、ミドルドメイン阻害剤)は、N末端阻害剤ほど速くは進んでいない。したがって、N末端ATP結合阻害剤化合物は、臨床的に市場性のある分子への進行を依然として有望である。さらに、2022年6月に承認された唯一のHsp90阻害剤(日本におけるGIST治療薬ピミテスピブ)は、N末端ATP結合分子9です。しかしながら、単一分子は、今日まで、世界の他の地域では市場性のある段階に達していない23,24。この失敗には、製剤の問題、耳毒性などの毒性に加えて分子を製造するコスト、少数の化...

ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、癌の発症と進行に関与するタンパク質の安定性を維持する分子シャペロンです。さらに、抗悪性腫瘍剤に対する耐性の発達に関与するタンパク質もHsp901のクライアントである。Hsp90は、全タンパク質の2%未満を占める可能性のある正常細胞と比較して、すべての癌細胞タイプ(細胞タンパク質の>90%)に遍在的に過剰発現しています。さらに、がん細胞のHsp90はコシャペロンとの複合体に存在しますが、正常細胞では、主に遊離で複合体のない状態で存在します2,3。近年、いくつかのHsp90阻害剤が、インビトロおよびインビボ研究において老化細胞除去効果を有することが実証されており、マウスの寿命を有意に改善している4,5,6。前述のすべての発見は、Hsp90阻害剤が複数の種類の癌に有効であり、副作用が少なく、耐性を発症する可能性が低いという事実を実証しています。Hsp90のシャペロン機能は、Hsp90のN末端ドメインにATPを結合し、それをADPと遊離リン酸に加水分解することによって達成されます7。Hsp90のATP結合ポケットに競合的に結合する低分子は、タンパク質のシャペロン化効果を抑制することに成功した。今日まで、これはHsp90阻害のための最良の戦略であり、そのような阻害剤が臨床試験に達したという事実によって裏付けられています8。そのうちの1つであるピミテスピブは、2022年6月に消化管間質腫瘍(GIST)の治療薬として日本で承認されました9。これは、シャペロンの創薬性が1994年に確立されて以来、承認された最初のHsp90阻害剤です10。
マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順であり、目的のターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています11。このアッセイは、小規模なラボスケールのセットアップやHTS 12、13、14、15、16、17でのHsp90阻害剤のスクリーニングに成功しています。このアッセイは、Hsp90のATPアーゼ活性により形成される遊離無機リン酸を測定する比色法を使用します。この定量の基礎は、遊離リン酸とモリブデンの間にリンモリブデン酸錯体が形成され、その後マラカイトグリーンと反応して緑色を生成することです(図1)。この急速な発色は、分光光度計またはプレートリーダー上で、600〜660nmの間で測定される18,19。
本プロトコールでは、酵母Hsp90を用いたマラカイトグリーンアッセイを実施する手順およびその後のシャペロンに対する阻害剤の同定が記載されている。Hsp90の創薬性が最初に確立された天然物分子であるゲルダナマイシン(GA)は、本物の阻害剤として摂取されました10。HTSは、テスト用の多数の分子が利用可能であるため、現在の創薬プログラムの不可欠な部分になっています。この技術は、Covid-19感染症を治療するための薬物の転用が緊急に必要であるため、過去2年間でより重要性を増しています20,21。そこで、マラカイトグリーンアッセイ法を採用した酵母Hsp90タンパク質に対するHTSの分子について詳細な概要が提示される。

<table><tbody><tr><td>水中の1M塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M 水中の塩化カリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>アデノシン 5&prime;-三リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FXラボオートメーションワークステーション</td><td>ベックマン・コールター</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>化合物 3-96</td><td>該当</td><td>なし</td> ヒ<td>スチジンタグ付き酵母Hsp90は、英国サセックス大学生命科学部のChrisostomos Prodromou博士から入手し、タンパク質はKIST江陵天然物研究所で発現しました。特許権侵害の問題により、詳細は開示できません。</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>ゲルダナマイシン 99% (HPLC)</td> 粉末 <td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green Phosphate Assay&nbsp;アッセイキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>マルチ検出マイクロプレートリーダー Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>Synergy HT マルチプレートリーダー</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>Trizma 塩酸塩緩衝液、pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>酵母 Hsp90</td><td>該当なし</td> 該当<td>なし</td><td>英国サセックス大学生命科学部 でタンパク質を発現させ、タンパク質は KIST Gangneung Institute of Natural Products で発現しました。プライマリアクセッション番号:P02829</td></tr></tbody></table>

熱ショックタンパク質90阻害剤の発見のためのマラカイトグリーンアッセイ

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、複数の発癌性タンパク質に対するシャペロン効果があるため、有望な抗がん標的です。Hsp90の活性は、アデノシン三リン酸(ATP)をアデノシン二リン酸(ADP)および遊離リン酸に加水分解する能力に依存します。Hsp90のATPアーゼ活性は、そのシャペロン機能に関連しています。ATPはHsp90のN末端ドメインに結合し、その結合を破壊することがHsp90の機能を抑制する上で最も成功した戦略であることがわかった。ATPアーゼ活性は、ATP加水分解によって形成される遊離リン酸の量を決定する比色マラカイトグリーンアッセイによって測定することができる。ここでは、マラカイトグリーンリン酸測定キットを用いて酵母Hsp90のATPase活性を測定する手順について説明する。さらに、ゲルダナマイシンを真正な阻害剤として服用することによるHsp90阻害剤の発見のための詳細な指示書が提供される。最後に、酵母Hsp90に対する阻害剤分子のハイスループットスクリーニング(HTS)を介したこのアッセイプロトコルの適用について説明します。

アッセイの結果は、遊離リン酸イオン濃度による吸光度の観点から解釈される。620 nmでの酵母Hsp90によるATP加水分解による遊離リン酸による吸光度は、100%ATPase活性、またはゼロパーセントタンパク質阻害と見なされます。タンパク質の阻害はATP加水分解の停止をもたらす(遊離リン酸が少ない)。これは、620nmでの吸光度の低下という点で反映されます。
ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイの結果 リン酸塩標準の標準グラフを 図3に示します。Hsp90の活性は、ATPをADPおよび無機リン酸(Pi)に加水分解する能力の観点から測定されます。遊離リン酸濃度が高くなると、マラカイトグリーンとの複合体形成が増加し、620 nmで検出可能な強い緑色になります(図4)。
阻害率は、次の式で計算されます。
%阻害 <i...

マラカイトグリーンアッセイプロトコルは、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)サプレッサー、およびATP依存性酵素に対する他の阻害剤化合物を発見するための簡単で費用効果の高い方法です。

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

このプロトコルは、タンパク質によるATP加水分解から生じる遊離リン酸を測定することにより、ATPアーゼタンパク質の活性の決定に役立ちます。マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順です。ターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニングに適しています。この技術は、重要な抗がん標的であるHsp90タンパク質に対する阻害剤の迅速な発見において重要な役割を果たします。まず、40マイクロリットルの1ミリモルリン酸標準物質を960マイクロリットルの超純水にピペットで入れ、40マイクロモルのリン酸溶液を得た。製造元の指示に従ってこの溶液を追加して、0〜40マイクロモルのリン酸塩の段階希釈を形成します。次に、測定可能なATPアーゼ活性のために8マイクロリットルの酵母Hsp90を使用します。ブランクとポジティブコントロールにマラカイトグリーン試薬を追加し、添加後のブランクとポジティブコントロールの光学濃度差が0.5以上1未満であることを確認します。ATPを調製するには、453.39マイクロリットルの超純水を含むバイアルに1ミリグラムのATPを移し、4ミリモルのストック溶液を得る。ATPは時間の経過とともに自然に加水分解する可能性があるため、新鮮に準備します。各ウェルに4マイクロリットルのATPストック溶液を加えて、0.2ミリモルの最終ウェル濃度を得ます。マルチチャンネルピペットを使用して反応の最後の成分としてATPを追加し、すべての反応が同時に開始されるようにします。次に、1ミリグラムを178.37マイクロリットルのDMSOに溶解することにより、10ミリモルのゲルダナマイシンストックを調製します。ストック溶液を使用して、段階希釈によりDMSO中の4ミリモル、0.8ミリモル、0.16ミリモル、0.032ミリモル、0.0064ミリモル、および0.00128ミリモル溶液を調製します。これらのストック溶液を2マイクロリットル各ウェルに追加して、0.1ミリモル、0.02ミリモル、0.04ミリモル、0.0008ミリモル、0.00016ミリモル、および0.000032ミリモルの最終ウェル濃度を得ます。次に、ブランクおよびネガティブコントロールを含むウェルと共にウェルを調製する。ゲルダナマイシンを含有するウェルは、ポジティブコントロールとして機能する。96ウェルプレートを準備し、この波長での吸光度を記録するために、620ナノメートルの吸光度を示す化合物用に別のウェルを準備します。ゲルダナマイシンは、このアッセイで使用される濃度に対して620ナノメートルの吸光度を示さないため、ゲルダナマイシンについては別のウェルを表示しないでください。各ウェルに超純水を添加してアッセイウェルを設置します。次いで、必要量のアッセイバッファー

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。...

細胞内のリフォールディングアッセイ

私たちは、真と偽のタンパク質 -...

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

このビデオでは、ビーズベースの近接アッセイである増幅発光近接均質アッセイを実演します。これは、均質なサイズのアクセプタービーズとドナービーズを利用し、相互作用する傾向がある2つのタンパク質で固定化され、タンパク質相互作用を阻害する可能性のある小分子をスクリーニングします。...

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay:タンパク質間相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのビーズベースの近接アッセイ

生物がその有効期間中に発生する最も困難なストレス条件の 1 つは酸化物質の蓄積を含みます。酸化ストレス時に細胞は分子シャペロンに大きく依存します。HDX MS...

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、低分子ミオシン阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合した。この運動アッセイは、384ウェルマイクロプレートフォーマットで実行され、総反応量はウェルあたりわずか20μLです。プラットフォームは、事実上すべてのADP産生酵素に適用可能でなければなりません。...

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。...

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

SAMHD1は、ヒトの健康と疾患に重要な役割を果たすデオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼです。ここでは、低分子およびヌクレオチド類似体をSAMHD1基質、活性化剤、および阻害剤として評価できる、384ウェルマイクロプレートフォーマットで展開された汎用性の高い酵素共役SAMHD1活性アッセイを紹介します。...

低分子とdNTPase SAMHD1の相互作用を調べるためのハイスループット酵素共役活性アッセイ

このプロトコルは、グルタチオン結合ドナービーズとGST融合TPR-モチーフコシャペロンおよびアクセプタービーズとHsp90由来ペプチドを結合してタンパク質とタンパク質相互作用を調べるための技術を提示する。この技術を用いて、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FkbP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。...

均質ビーズベースアッセイを用いたシャペロンコカペロン相互作用の研究

このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756...

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

このプロトコルは、タンパク質合成における天然産物/小分子阻害剤の特定に最適化されたフルオロメトリックスクリーニング手法を導入します。その実用性から、学部生向けの創薬技術教育や医薬品化学キャンペーンへの応用に適しています。...

天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル

学ぶマラカイトグリーンアッセイを用いたHsp90阻害剤の発見法。ATP加水分解による遊離リン酸を測定し、がん研究における高スループットスクリーニングと自動化に対応する簡便で高感度な手法です。

熱ショックタンパク質90阻害剤の発見のためのマラカイトグリーンアッセイ

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