Name: 骨細胞の解析とイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶ コンフォーカル顕微鏡とCFD解析を用いた骨細胞の3Dモデリング手法。ラクナ管網内の流体剪断応力を数値的に評価し、加齢や骨疾患による骨細胞の応答性変化を理解するのに役立ちます。

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<meta charset="utf8"></head><body>骨のメカニズムを研究するためのCFD解析のための骨細胞の3Dモデリング

<ol><li>Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+osteocytes-specific+molecular+mechanism+in+regulation+of+mechanotransduction+-+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Translat%22%5BJournal%5D)">The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review.</a> J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).</li>
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<li>Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+osteocytes+and+computational+modelling+in+mechanobiology%3A+insights+on+bone+development%2C+ageing%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease.</a> Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).</li>
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<li>Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+finite+element+analysis+for+the+prediction+of+load-induced+fluid+flow+and+mechanochemical+transduction+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone.</a> J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).</li>
<li>You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+strain+amplification+in+the+actin+cytoskeleton+of+osteocytes+due+to+fluid+drag+on+pericellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix.</a> J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).</li>
<li>Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+excitation+of+osteocytes+by+mechanical+loading-induced+bone+fluid+shear+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses.</a> J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).</li>
<li>Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+based+on+confocal+imaging+predicts+changes+in+osteocyte+and+dendrite+shear+stress+due+to+canalicular+loss+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging.</a> Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).</li>
<li>Dallas, S. L., Moore, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+confocal+imaging+approaches+to+understand+the+structure+and+function+of+osteocytes+and+the+lacunocanalicular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network.</a> Bone. 138, 115463(2020).</li>
<li>Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+confocal+microscopy+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Vital confocal microscopy in bone.</a> Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,200グリットサンドペーパー</td><td>Buehler</td><td>30-5170-012-100</td><td></td></tr><tr><td>3-Maticソフトウェア</td><td>Materialise</td><td>https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic</td><td>3Dデータ最適化ソフトウェア</td></tr><tr><td>600グリットサンドペーパー</td><td>Buehler</td><td>30-5118-600-100</td><td></td></tr><tr><td>800グリットサンドペーパー</td><td>Buehler</td><td>30-5170-800-100</td><td></td></tr><tr><td>ANSYSソフトウェア</td><td>ANSYS</td><td>https://www.ansys.com/</td> <td>シミュレーション ソフトウェア</td></tr><tr><td>フルオレセイン イソチオシアネート (FITC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/</td><td></td></tr> 顕<tr><td>微鏡用浸漬油</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>195371-10-9</td><td></td></tr><tr><td>ライカ TCS Sp5 II 共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>TCS Sp5 II&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ライツ 1600 インナーホール ダイヤモンド ソー</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIMICS Innovation Suiteソフトウェア</td><td>Materialise</td><td>https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite</td><td>3D画像ベースの処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>パーマウントマウント培地</td><td>Fisher scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit</td><td>Buehler</td><td>20-3560</td><td></td></tr><tr><td>Single Platform Laboratory Shaker</td><td>Reliable scientific INC</td><td>モデル55S</td><td></td></tr></tbody></table>

骨細胞の解析とイメージング

Analysis and Imaging of Osteocytes

このプロトコルでは、機械的負荷により骨細胞とその樹状突起が受ける流体の流れせん断応力の量を調査するために、共焦点由来の骨細胞モデルを開発する方法について説明します。老化したC57BL6マウスと若いC57BL6マウスを選択し、若くて老化した共焦点画像ベースの骨細胞モデルを作製しました。他の6つのシミュレートされた骨細胞モデルは、同じ若い骨細胞モデルからジオメトリ修正技術を使用して生成され、加齢または骨疾患によるLCN形態の変化を研究しました。ジオメトリ修正されたパラメータには、ラクナ-小管の厚さ、小管密度、および直径が含まれていました。改変骨細胞モデルは、一度に1つのパラメータを変更し、他のパラメータを同じにすることで開発されました。したがって、FFSSに対する各形態学的パラメータの影響は、単独で調べられます。その結果、これらの骨細胞モデルでは、骨細胞が経験するFFSSの量が異なることが明らかになり、FFSSがLCNの形態に依存していることが示されました。FFSS値は、骨細胞体や樹状膜など、骨細胞モデルのさまざまな部分で予測されました。すべてのモデルの樹状突起は、骨細胞体膜よりも大きなFFSS値を示しました。
図5は、共焦点FITC画像スタックから直接生成された若年骨細胞モデルと老化骨細胞モデルのFFSS輪郭と、ジオメトリ修正技術を使用してモデル1から開発された他の6つの骨細胞モデルのFFSS輪郭を示しています。若年骨細胞モデル(モデル1)の骨細胞および樹状膜上の平均FFSSは0.42Paであり、これは老化骨細胞モデル(モデル2)の平均FFSS0.13Paよりも有意であった。得られたデータは、ラクナ小管腔が大きい骨細胞(モデル7およびモデル8)で平均FFSSが増加し、小管密度が低い骨細胞(モデル3およびモデル4)でFFSSが減少するのに対し、モデル5およびモデル6では樹状突起径を変更してもFFSSは有意に変化しなかったことを示しています。モデル2とモデル4のFFSS値は、それぞれ0.19 Paと0.13 Paと最も低い値でした。モデル8のFFSSの大きさは、他の骨細胞モデルよりも大きいです。モデル8では、樹状突起のほとんどが赤色であるだけでなく、骨細胞体も他のモデルよりも高いFFSSを経験します。
また、ANSYS CFXでの後処理により得られたラクナ-小管腔の体積と表面積に基づいて、骨細胞が経験するFFSSが提示され、FFSSとLCNの構造変化との相関関係が明らかになりました。また、骨形成を引き起こすFFSSのレベルと考えられる0.8Paを超えるFFSSに曝露された各モデルの表面積を測定することもできた21,22。骨細胞モデリングは、表1に示すように、すべての骨細胞モデルについて、平均FFSSとラクナ-小管腔の体積または表面積との間に相関関係があることを示しました。老齢骨細胞(モデル2)と模擬中年骨細胞(モデル4)で小管密度が最も低いものは、ラクナ小管表面積が1372.7μm2と1122.6μm2と最も低かった。また、モデル2とモデル4は、ラクナ-小管腔の体積がそれぞれ229.4 μm3と203.5 μm3と最も低く、FFSSの量が少ないことと相関していると考えられる。樹状突起の直径が最大のモデル6は、ラクナ-小管表面積が最大でした。モデル8は、最大のラクナ-小管腔体積と最大のFFSS値を持っていました。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig01.jpg"> 
図1:5倍、20倍、100倍のオイル対物レンズで撮影されたFITC染色された大腿骨の横断面の単一Z平面共焦点画像。 Lacunar-canalicularネットワークは、100倍対物レンズで撮影した画像に写っています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig02.jpg"> 
図2:生後4ヶ月と22ヶ月齢のC57BL6マウスのFITC染色大腿骨から作製した若年骨細胞(モデル1)と老齢骨細胞(モデル2)の共焦点画像ベースモデル。 拡大画像は、若い骨細胞のラクナ-小管(LC)の厚さと、老化した骨細胞の同じ厚さを示しています。モデル1の画像は、Niroobakhsh et al.23の許可を得て変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig03.jpg"> 
図3:モデル1からジオメトリ修正技術を使用して開発された6つの骨細胞モデル。 小管密度を減少させてモデル3(シミュレートされた中年)とモデル4(シミュレートされた老化)を生成しましたが、樹状突起の直径とLCの厚さはモデル1と同じでした。モデル5とモデル6は、モデル1と同じ小管密度とLC厚さで開発されましたが、樹状突起の直径はモデル1の2倍と4倍大きかった。モデル7とモデル8は、それぞれ2倍と4倍のラクナ-小管の厚さを持っていましたが、小管密度と樹状突起の直径はモデル1と同じままでした。モデル1の画像は、Niroobakhsh et al.23の許可を得て変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig04.jpg"> 
図4:3Dビュー共焦点画像ベースの若い骨細胞モデル。 骨細胞と樹状突起の周囲の流体解析に使用されるラクナ-小管腔のモデリングを描いた共焦点画像ベースの若い骨細胞モデルの断面積の3Dビュー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig05.jpg"> 
図5:すべての骨細胞モデルのFFSS分布は、FFSSの大きさが骨細胞の形態に依存していることを示しています。 赤色の領域は、特に骨細胞体ではなく樹状膜で最も高いFFSS値を示しています。この画像は、Niroobakhsh et al.23の許可を得て変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>モデル</td>
			<td>腹膜小管表面積 (μm2)</td>
			<td>外堀小管腔容積 (μm3)</td>
			<td>アベニューFFSS(PA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">共焦点画像ベースの骨細胞モデル</td>
			<td>モデル1</td>
			<td rowspan="2">2652.9</td>
			<td rowspan="2">261</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヤング(生後4ヶ月)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モデル2</td>
			<td rowspan="2">1372.7</td>
			<td rowspan="2">229.4</td>
			<td rowspan="2">0.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>年齢(22ヶ月)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">ジオメトリ修正技術を使用して生成されたシミュレートされた骨細胞モデル</td>
			<td>モデル3</td>
			<td rowspan="2">1530.4</td>
			<td rowspan="2">242.6</td>
			<td rowspan="2">0.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(シミュレートされた中年)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モデル4</td>
			<td rowspan="2">1122.6</td>
			<td rowspan="2">203.5</td>
			<td rowspan="2">0.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(シミュレーションエイジング)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モデル5</td>
			<td rowspan="2">3724.9</td>
			<td rowspan="2">302.9</td>
			<td rowspan="2">0.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2 x 樹状突起直径)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モデル6</td>
			<td rowspan="2">4791</td>
			<td rowspan="2">337</td>
			<td rowspan="2">0.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4 x樹状突起直径)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モデル7</td>
			<td rowspan="2">3116.3</td>
			<td rowspan="2">440.6</td>
			<td rowspan="2">1.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2 x LC厚さ)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モデル8</td>
			<td rowspan="2">3542.2</td>
			<td rowspan="2">658.2</td>
			<td rowspan="2">1.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4 x LC厚さ)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:骨細胞モデルの比較。 2つの共焦点画像ベースのモデルと、ジオメトリ修正技術を使用してモデル1から生成された6つのシミュレーションモデルを含む、8つの異なる骨細胞モデルにおける平均FFSS、ラクナ-小管空間体積、および表面積の比較。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。...

高スループットコルティカル骨サンプルの採取と分析のための断面化、スコアリング、画像処理ガイド

このプロトコルでは、蛍光活性化細胞選別(FACS)のための骨細胞調製に加えて、新生児dmp1-topazマウス頭蓋冠の解剖と、細胞消化と分画による緑色蛍光タンパク質を発現する骨細胞の単離について説明します。...

GFP発現骨細胞のマウス頭蓋骨分画による初代骨細胞の取得

本稿では、マウス第3中足骨の組織レベルの機械的負荷に応答して、 in vivo...

マウス骨細胞における負荷誘発カルシウムシグナル伝達ダイナミクスを研究するための蛍光生体内イメージングアプローチ

このプロトコルはヘマトキシリンEosin (HE)の汚損およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)の技術の結合によって骨粗しょう症のマウス...

骨粗鬆症マウスモデルにおける海綿骨マイクロアーキテクチャ評価

骨再生をさまざまな階層レベルで評価するためのプロトコルを提案します。このマルチモーダル手法により、異なる長さスケールでの構造解析が可能となり、試料準備の課題に効果的に対処できます。また、骨再生促進におけるバイオマテリアルの効果を評価する信頼性の高いワークフローも提供しています。...

骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

学ぶ コンフォーカル顕微鏡とCFD解析を用いた骨細胞の3Dモデリング手法。ラクナ管網内の流体剪断応力を数値的に評価し、加齢や骨疾患による骨細胞の応答性変化を理解するのに役立ちます。

骨細胞の解析とイメージング

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