Name: グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶコンカナバリンAベースの沈降アッセイを用いて、グルカンホスファターゼの基質結合親和性を定量化する方法です。ミリモル範囲の弱い糖タンパク質相互作用を検出でき、SEX4変異体の解析にも応用可能です。

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この研究は、国立科学財団賞MCB-2012074によってサポートされました。著者らは、貴重な議論と支援を提供してくれたフロリダ大学生化学分子生物学部のクレイグW.ヴァンダークーイ博士に感謝します。著者らはまた、フロリダ大学生化学・分子生物学部のマシュー・S・ジェントリー博士の支援に感謝している。スキッドモア大学神経科学プログラムの議長であるサラ・ラガルワー博士に、ウェスタンブロットイメージングにLICORC桁ブロットスキャナーの使用を許可してくださったことに感謝します。

1. ConA-セファロースビーズの調製
<ol><li>67 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl 2、および 0.2 mM CaCl2 を含む結合バッファー 250 mL を作製します。1 M NaOH溶液を使用してpHを調整します。</li>
	<li>250 μLのConA-セファロースビーズ懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。内容物を10,000 x g で4°Cで30秒間遠心分離します。 上清を捨てる。 注:アッセイに使用するアミロペクチン濃度ごとに、1.5 mLマイクロ遠心チューブに250 μLのConA-セファロースビーズが必要です。</li>
	<li>250 μLのConA-セファロースビーズを含む各チューブに750 μLの結合バッファーを追加します。チューブを10,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。 上清を除去する。このステップを2回繰り返して、ビーズが適切に洗浄され、結合バッファーで平衡化されていることを確認します。</li>
</ol>2.アミロペクチン溶液の調製
<ol><li>10 mg/mLポテトアミロペクチンの原液を作ります。アミロペクチンは水不溶性であり、熱によって可溶化することができる。可溶化するには、0.1 gのジャガイモアミロペクチンを10 mLの蒸留水に加えます。懸濁液を水浴中で80°Cで1時間、または溶液が濁らなくなるまで加熱する。</li>
	<li>溶液を室温(RT)に戻して、凝集を避けるためにボルテックスを繰り返します。</li>
	<li>アルコールアルカリ処理は、アミロペクチン基質を可溶化するための代替方法です。この方法を使用して可溶化するには、以下の手順に従います。<ol><li>0.5 gのアミロペクチン基質を5 mLの20%エタノールおよび5 mLの2 M NaOHに懸濁します。内容物をRTで15〜20分間激しく攪拌します。</li>
		<li>次に、10 mLの水を加え、2 M HClを加えて溶液のpHを6.5に調整し、得られた溶液の容量を蒸留水で50 mLにして、10 mg/mLのアミロペクチン溶液を作ります。</li>
	</ol></li>
	<li>10 mg/mLの可溶化アミロペクチン溶液を希釈して、一連の2 mLの希釈アミロペクチン溶液を作ります。例えば、10 mg/mLの半希釈を行い、一連のアミロペクチン濃度(5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.156 mg/mL、0.078 mg/mL、0.039 mg/mL、0.019 mg/mL、0 mg/mL)を調製します。</li>
</ol>3. ConA-セファロースの調製:アミロペクチンビーズ
<ol><li>希釈した各アミロペクチン溶液250 μLを、結合バッファーで事前に平衡化した250 μLのConA-セファロースビーズを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。内容をよく混ぜます。対応するアミロペクチン濃度でチューブにラベルを付けます。</li>
	<li>内容物を回転ホイール上で4°Cで30分間インキュベートします。 注:ConA-セファロース:アミロペクチン結合複合体は、20分後に経時的に変化はありません。.30分のインキュベーション時間は、平衡に達することを保証するために、インキュベーション時間を10分から1時間に変更することによって選択されました。</li>
	<li>チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。新しくラベル付けした1.5 mLマイクロ遠心チューブに上清を収集します。これらの上清画分を保存して、D−グルコースアッセイ12 (アミロペクチンの酸加水分解とそれに続く酵素アッセイ による グルコースのUV定量)を行う。このステップは、すべてのアミロペクチンがビーズに結合していることを確認するために必要です。</li>
	<li>750 μLの結合バッファーをConA-セファロース:アミロペクチンビーズに加えます。チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。上清を捨てて、結合していないアミロペクチン分子を除去します。</li>
	<li>手順3.4を繰り返して、十分に洗浄します。各チューブには、さまざまな量のアミロペクチン基質に結合したConA-セファロースビーズが含まれています。</li>
</ol>4. SEX4をConA-セファロース:アミロペクチンビーズでインキュベートする
<ol><li>250 μLのConA-セファロース:アミロペクチンビーズを、10 μgのSEX4タンパク質、10 mMジチオスレイトール(DTT)、および10 μMのプロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)を含む100 μLの結合バッファーと混合します。各チューブの総容量は350μLであることに注意してください。 注:プロテアーゼ阻害剤カクテルは、不必要なSEX4分解を回避するための予防措置として追加されます。これはオプションの手順です。このアッセイでは、組換えタンパク質シロイヌナズナSEX4(AtSEX4)が使用される。精製されたタンパク質は、化学発光を介してタンパク質を検出するために必要なN末端ヒスチジンタグを含有する。グルカンホスファターゼ精製に関する詳細な情報は、以前の刊行物14、20、24に記載されている。</li>
	<li>タンパク質とConA-セファロース:アミロペクチンビーズ懸濁液を4°Cで45分間、穏やかな回転でインキュベートします。 注:45分のインキュベーション時間は、複合体の平衡に達することを確実にするために選択されます。</li>
	<li>チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。ゲルローディングチップを使用して上清50 μLを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに注意深くピペットで入れます。20 μLの4x SDS-PAGE色素と10 μLの水を、50 μLの上清画分を含む各チューブに加えます。サンプルを95°Cで10分間加熱します。SDS-PAGEゲルを実行するためにこれらのサンプルを保存してください。「上清(S)」とラベル付けされた10本の新しいチューブが対応する基質濃度を持っていることを確認してください。</li>
	<li>750 μLの結合バッファーをConA-セファロース:アミロペクチン:SEX4ビーズに加えて、ビーズから未結合タンパク質を除去します。チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。この手順をもう一度繰り返して、適切に洗浄します。上清を捨てる。</li>
	<li>洗浄したConA-セファロース:アミロペクチン:SEX4ビーズを含むチューブに20 μLの4x SDS-PAGE色素と80 μLの蒸留水を加えます。サンプルを95°Cで10分間加熱し、10,000 x g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを廃棄し、SDS-PAGEゲルを実行するための上清を保存します。上清80 μLを新しいチューブにピペットで入れ、「ペレット(P)」とラベル付けします。</li>
</ol>5. SDS-PAGEゲルの実行
<ol><li>40 μLの未結合タンパク質サンプル(ステップ2.3で作成、ラベルS)を4%〜12%のプレキャストポリアクリルアミドゲルウェルに最低基質濃度から最高濃度までロードしますが、最初のレーンはタンパク質分子量マーカーをロードするために自由に保ちます。2番目のゲルを使用して、ステップ2.5で作成した10個の結合タンパク質サンプル(Pとラベル付け)をロードします。</li>
	<li>新たに調製した1x SDS-PAGEランニングバッファーを装置の両方のチャンバーに追加します。ゲルを150 Vで35分間、または色素前面がゲルの底に達するまで実行します。</li>
	<li>装置からランゲルを取り外し、スペーサーとガラス板を取り外します。分離したゲルを使用して、ウェスタンブロット分析を実行します。</li>
</ol>6. 化学発光検出のためのウェスタンブロッティング14,15
注:この方法は、ユーザーがラボで使用しているウェスタンブロッティング装置に応じて簡単に変更/適合できます。
<ol><li>5.8 gのトリス塩基、2.9 gのグリシン、0.37 gのSDS、および200 mLのメタノールを含む1 Lの転写バッファーを作成します。</li>
	<li>サイズ分離したタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に移します。スポンジ、ろ紙、ゲル、およびニトロセルロース膜をウェスタン転写プロトコル14,15に従って簡単に組み立てます。70 Vで1時間運転します。</li>
	<li>非特異的タンパク質結合を防ぐために、1%〜5%ウシ血清アルブミン(BSA)または乳タンパク質のタンパク質溶液を含むニトロセルロース膜を50 mLのTBSTバッファー(20 mM Tris [pH 7.5]、150 mM NaCl、0.1%トゥイーン20)中で1時間インキュベートします。TBSTバッファーを使用してメンブレンを3回洗浄し、未結合のブロッキング溶液を除去します。</li>
	<li>Hisタグ付きタンパク質に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体でメンブレンを1時間インキュベートします。メンブレンをTBSTバッファーで3倍洗浄し、未結合の抗体を除去します。最適な再現性と感度を得るために、TBSTに対する抗体の1:2,000希釈を使用してください。</li>
	<li>HRP酵素結合抗体は、SEX4タンパク質のヒスチジンタグに特異的に結合し、化学発光試薬の存在下でバンドを生成します。デジタルイメージングの場合は、等量の化学発光基質溶液(各750 μL)を1.5 mLチューブに入れた溶液を作ります。メンブレンを溶液中で少なくとも5分間インキュベートします。</li>
	<li>膜タンパク質面を下にしてブロットスキャナーに置き、取得ソフトウェアを実行して、ペレット画分と上清画分の両方のタンパク質を定量します。</li>
</ol>7.データ分析
<ol><li>ブロットスキャナーで取得ソフトウェアを使用して定量信号測定を実行します。上清およびペレット画分中のすべての定量的測定値を、負荷された総タンパク質に正規化します。 注:このソフトウェアでは、上清およびペレット画分中の各タンパク質バンドの強度を定量化することができます。</li>
	<li>飽和結合実験において、タンパク質結合対アミロペクチン濃度のパーセンテージをプロットする。データ分析ソフトウェアを使用してKDを計算し、データをY = Bmax x X/(KD + X)に適合させます。 注:Bmaxは最大特異的結合であり、Y軸は結合したタンパク質の割合であり、X軸はアミロペクチン濃度である。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64700/64700fig01.jpg"> 図1:ConA-セファロース沈降アッセイワークフローの概要 。 (A)ConA-セファロースビーズの調製。(B)アミロペクチン基質とのインキュベーション。(C)SEX4タンパク質とのインキュベーション。(D)遠心分離による結合タンパク質画分と非結合タンパク質画分の分離。(E)SDS-PAGEによるタンパク質の分離。(F)ウェスタンブロット分析。(g)Hisタグ付きSEX4タンパク質の化学発光検出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64700/64700fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

この研究は、グルカン-グルカンホスファターゼ相互作用の結合親和性の決定を可能にする新しい in vitro 沈降アッセイの開発に成功したことを示しています。アッセイデザインでは、グルコースのヒドロキシル残基 を介した グルカンへのレクチンConAの特異的結合を利用して、可溶化された炭水化物基質をセファロースビーズ上に間接的に捕捉します。これにより、遠心分離 による 結合タンパク質画分と非結合タンパク質画分の分離、および可溶化グルカン基質とグルカンホスファターゼの結合親和性の決定が可能になります。試験したすべてのグルカンホスファターゼは、アミロペクチンに特異的に結合することがわかりましたが、アミロペクチンがない場合、ConA-Sepharoseビーズへの結合は検出できませんでした。 
実験は、ConA-セファロースビーズに結合した少量の一定量のSEX4タンパク質および範囲のアミロペクチン濃度との結合親和性を測定するために実施された。ビーズへの結合が最も高いアミロペクチン濃度を確保するために、過剰のConA-セファロースビーズが使用...

グルカンホスファターゼは、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)スーパーファミリー1内の二重特異性ホスファターゼ(DSP)の機能的に多様なサブファミリーのメンバーです。それらは、広く異なる光合成生物、人間、脊椎動物、および一部の無脊椎動物や原生生物を含むほとんどの生命体で発見されています2,3,4。植物には、デンプン過剰4(SEX4)、ライクセックスフォー1(LSF1)、およびライクセックスフォー2(LSF2)5,6,7の3つの既知のグルカンホスファターゼが含まれています。グルカンホスファターゼを欠く植物は、一時的なデンプンの分解と葉のデンプンの蓄積の速度が低下します8,9。ラフォリンは、脊椎動物およびヒトのグリコーゲンを脱リン酸化するグルカンホスファターゼファミリーの創設メンバーです3,10。ラフォリンの変異は、てんかんの致命的な常染色体劣性形態である神経変性ラフォラ病をもたらします11。グルカンホスファターゼはグリコーゲンとデンプンの代謝に必要であり、植物のデンプン含有量を調節し、神経変性ラフォラ病を治療するための重要な酵素として浮上しています12,13。モデルグルカン基質を用いたグルカンホスファターゼに関する最近のX線結晶構造解析研究は、基質結合とグルカン脱リン酸化の触媒機構を明らかにしています14,15,16,17。しかし、グルカンホスファターゼがそれらの生理学的基質にどのように結合するかについての現在の理解は不完全である。
デンプンは、80%〜90%のアミロペクチンと10%〜20%のアミロースからなるグルコースの不溶性ポリマーです18。植物グルカンホスファターゼの基質は、グリコーゲンやデンプン顆粒などのリン酸化炭水化物分子です。リン酸化グルコシル残基は、1:600のリン酸:グルコシル残基比で存在します。興味深いことに、リン酸塩はアミロペクチン分子19上にのみ存在する。主な植物グルカンホスファターゼSEX4は、デンプン顆粒に作用してアミロペクチン分子を脱リン酸化します。構造誘導突然変異誘発研究と組み合わせたSEX4のX線結晶構造は、グルカン構造内のさまざまな位置に対するSEX4のユニークな基質特異性を実証しました15。我々は最近、SEX4の生物学的に関連する活性は、その可溶化アミロペクチン基質20に作用するときにのみ観察できることを示した。しかし、グルカン-SEX4相互作用を理解することは、基質の構造の複雑さ、より広い結合特異性、およびタンパク質とその基質間の結合親和性が低いため、困難であることが証明されています。これらの問題により、等温滴定熱量測定(ITC)、核磁気共鳴(NMR)分光法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースのアッセイなど、タンパク質-リガンド相互作用で一般的に使用される方法を利用する能力が妨げられてきました。
興味深いことに、炭水化物とタンパク質の相互作用に関する私たちの理解の多くは、レクチンの研究から来ています。コンカナバリンA(ConA)は、もともとジャックビーンから抽出されたタンパク質のマメ科レクチンファミリーです。ConAは炭水化物に高い特異性で結合するため、薬物の標的化および送達用途での使用に有利です。非還元性α-D-マンノシルおよびα-D-グルコシルを含む様々な基質へのConAの結合は、広く研究されている19,20。市販のConA結合セファロースビーズは、糖タンパク質および糖脂質を精製するために一般的に使用されている21。ConAは、グルコース残基のC3、C4、およびC6ヒドロキシル基を介してこれらのグルカンに結合します。ConA-セファロースビーズは、グリコーゲン-タンパク質およびデンプン-タンパク質相互作用の結合を測定するためにも成功裏に使用されています22,23。本研究では、ConA-Sepharoseビーズを用いて、グルカンホスファターゼ-アミロペクチン相互作用の結合特異性を測定するための結合アッセイを開発しました。
以前は、グルカンホスファターゼ基質結合能を評価するためにConAベースの沈降アッセイが使用されていました14、20、24。この研究では、同じ戦略を使用して、グルカン-グルカンホスファターゼと炭水化物相互作用の結合親和性を決定するための新しい方法を開発しました。この方法は、様々な可溶化糖質-タンパク質相互作用を調べるための利点もある。

<table><tbody><tr><td>6x-Hisタグモノクローナル抗体(HIS.H8)、HRP</td><td>Therm Fisher Scientific</td><td>MA1-21315-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Bioradゲル電気泳動およびウェスタンブロットキット</td><td>Biorad&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr>塩化<tr><td>カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208291</td><td></td></tr><tr><td>C-Digit ブロットスキャナー</td><td>LICOR</td><td>3600-00</td><td>ブロットスキャナー</td></tr><tr><td>コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A-セファロースビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9017</td><td>この製品には&nbsp;1 M NaCl、1 mM CaCl2、1 mM MnCl2、および1 mM MgCl2を含む0.1 M酢酸緩衝液、pH 6 中、20%エタノール&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0 ソフトウェア</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td>バージョン8.0</td><td>データ解析ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8651</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>3600-501</td><td>取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28312</td><td></td></tr><tr><td>ジャガイモ アミロペクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>プレキャスト SDSPAGE ゲル</td><td>ジェンスクリプト</td><td>M00653S</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>MP1TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>ウエスタンシュアプレミアム化学発光基質&nbsp;</td><td>LI-COR&</td><td>nbsp;〒926-95000</td><td></td></tr></tbody></table>

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンaベースの沈降アッセイ

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

グルカンホスファターゼは、動物のグリコーゲンや植物のデンプンなどのグルカン基質を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼ(DSP)のより大きなファミリーに属します。モデルグルカン基質を有するグルカンホスファターゼの結晶構造は、DSPと糖鎖結合ドメインからなる明確なグルカン結合界面を明らかにする。しかし、グルカン-グルカンホスファターゼと生理学的に関連する基質との相互作用の定量的測定は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素の生物学的理解とエネルギー代謝の調節にとって基本的なものです。この原稿は、異なるグルカン基質に対するグルカンホスファターゼの基質結合親和性を検出するために設計されたConcanavalin A(ConA)ベースのin vitro沈降アッセイを報告しています。概念実証として、グルカンホスファターゼシロイヌナズナデンプン過剰4(SEX4)とアミロペクチンの解離定数(KD)を測定しました。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質-炭水化物相互作用の差次的結合を評価するためのこのアッセイの有用性をさらに実証しています。これらのデータは、広範囲のデンプンおよびグリコーゲン相互作用タンパク質の特性評価に対するこのアッセイの適合性を実証する。

グルカンホスファターゼファミリーのタンパク質の重要な特徴の1つは、グルカン基質に結合する能力です。まず、SEX4のConA-セファロース:アミロペクチンビーズへの結合能をSDS-PAGEを用いて分析した(図2A)。ウシ血清アルブミン(BSA)は、ConA-Sepharose:アミロペクチンビーズへのタンパク質の非特異的結合を検出するためのネガティブコントロールとして機能しました。タンパク質のSDS-PAGE分析では、ペレット画分にSEX4タンパク質、上清画分にBSAが存在することが示されました。グルカン結合能が有意に低下した既知のSEX4変異体であるW278Aもアッセイに含まれました。W278A変異体は上清画分に現れ、SEX4タンパク質のグルカン結合能を検出するためのこのアッセイの有用性と特異性を示しています。SDS-PAGEはSEX4タンパク質を可視化しましたが、小さなグルカンホスファターゼの感度と使用について懸念がありました。たとえば、ConAレクチンタンパク質は、LSF2などの小さなタンパク質の検出を妨げる可能性があります。この方法がグルカンホスファターゼのみを検出できる...

この方法は、グルカンホスファターゼとアミロペクチンの結合親和性を定量化するためのレクチンベースの in vitro 沈降アッセイを記載する。この共沈降アッセイは、グルカンホスファターゼ基質結合の測定に信頼性が高く、さまざまな可溶化グルカン基質に適用できます。

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

このコンカナバリンAベースのin vitro沈降アッセイは、異なるSTA基質に対するグルカンホスファターゼの結合親和性を測定するように設計されています。このメソッドから得られる情報は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素を理解するための基本です。炭水化物タンパク質の相互作用は比較的弱いため、現在の方法ではグルカンホスファターゼとグルカン相互作用を検出できません。当社のレクチンベースの沈降アッセイは、ミリモル範囲の結合親和性を検出できます。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質の糖鎖相互作用を定量化するこのアッセイの能力を実証しています。アッセイの最も困難な部分の1つは、基質の濃度範囲を最適化することです。アイデアを得るためにより広い範囲から始めて、次に特定の範囲に絞り込むことをお勧めします。まず、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。内容物を10, 000 Gで4°Cで30秒間遠心分離します。上清を廃棄した後、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズを含む各チューブに750マイクロリットルの結合バッファーを追加します。チューブを10, 000 Gで4°Cで1分間遠心分離し、上清を取り除きます。次に、可溶化アミロペクチン溶液の2倍希釈液を調製して、一連の2ミリリットルの希釈アミロペクチン溶液を作る。ConA-セファロースアミロペクチンビーズを調製するには、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズを事前に平衡化し結合バッファーを含むチューブに、希釈した各アミロペクチン溶液250マイクロリットルを加えます。内容物をよく混合し、対応するアミロペクチン濃度でチューブにラベルを付けます。.チューブの内容物を回転ホイール上で4°Cで30分間インキュベートし、チューブを10, 000 Gで1分間遠心分離します。250マイクロリットルのConA-セファロースアミロペクチンビーズを、10マイクログラムのデンプン過剰の4個またはSEX4タンパク質、10ミリモルのジチオスレイトール、および10マイクロモルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む100マイクロリットルの結合バッファーと混合します。内容物を摂氏4度で45分間、穏やかな回転でインキュベートします。次に、チューブを10, 000 Gで1分間遠心分離し、50マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに慎重にピペットで入れます。回収した上清画分50マイクロリットルを含む各チューブに20マイクロリットルの4X SDSページ染料と10マイクロリットルの蒸留水を加え、Sとラベル付けします。染料と水を加えた後、すべてのサンプルを摂氏95度で10分間加熱します。ConA-セファロースアミロペクチンSEX4ビーズを10, 000Gで1分間遠心分離したら、上清を保存し、P.Loadとして標識しますSとラベル付けされた40マイクロリットルの未結合タンパク質サンプルを、最低基質濃度から最高濃度まで4〜12%のプレキャストポリアクリルアミドゲルウェルに入れ、タンパク質分子量マーカー用の最初のレーンを確保します。2番目のゲルを使用して、P.Addとラベル付けされたグルカン結合タンパク質サンプルを装置の両チャンバーにロードし、ゲルを150ボルトで35分間、または色素前面がゲルの底に達するまで流します。次に、装置からゲルカセットを取り出し、スペーサーとガラスプレートを取り外して、ウェスタンブロット分析用のゲルを分離します。5.8グラムのトリス塩基、2.9グラムのグリシン、0.37グラムのSDS、および200ミリリットルのメタノールを含む1リットルの転写バッファーを作ります。サイズ分離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に移すには、ウエスタン転写プロトコルに従ってスポンジ、ろ紙、ゲル、ニトロセルロース膜を組み立て、70ボルトで1時間実行します。ゲルを実行した後、ニトロセルロース膜を50ミリリットルのTBSTバッファー中の1〜5%ウシ血清アルブミンまたは乳タンパク質のタンパク質溶液中で1時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合を防ぎます。TBSTバッファーを使用してメンブレンを3回洗浄し、結合していないブロッキング溶液を除去します。次に、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体をヒスチジンタグ付きタンパク質に特異的にインキュベートし、メンブレンを1時間インキュベートします。その後、メンブレンをTBSTバッファーで3回洗浄し、未結合の抗体を除去しました。デジタルイメージングの場合は、等量の化学発光基質溶液(1.5ミリリットルのチューブにそれぞれ750マイクロリットル)の溶液を作り、その溶液中でメンブレンを少なくとも5分間インキュベートします。膜タンパク質側を下にしてブロットスキャナーに置き、取得ソフトウェアを実行して、ペレット画分と上清画分の両方のタンパク質を定量します。データを取得するには、ブロットスキャナーで取得ソフトウェアを使用して定量信号測定を開始します。上清およびペレット画分中のすべての定量的測定値を、負荷された総タンパク質に正規化します。飽和結合実験では、アミロペクチン濃度に対する結合タンパク質の割合をプロットし、データ解析ソフトウェアを使用してデータを適合させ、解離定数Kd.ConA-セファロースアミロペクチンビーズへのSEX4の結合能をSDSページを用いて分析した。ペレット画分中のSEX4タンパク質および上清画分中のウシ血清アルブミンの存在が注目された。グルカン結合能が有意に低下した既知のSEX4変異体であるW278Aが上清画分に出現し、このアッセイの有用性と特異性を示しています。ウェスタンブロッティング分析により、SEX4の検出が大幅に増加し、この方法は末端にヒスチジンタグを持つグルカンリン酸の検出に特異的です。共沈降アッセイを3つの異なるSEX4濃度で試験した。化学発光検出で可視化するには2マイクログラムのSEX4で十分ですが、5マイクログラムまたは10マイクログラムのSEX4を使用すると、より正確な検出が可能になります。また、アミロペクチン濃度の増加に伴うSEX4結合の増加が認められた。異なる濃度でのアミロペクチンとSEX4野生型タンパク質の結合親和性を決定し、特定の1部位結合モデルに結合したタンパク質データの割合は、ミリリットルあたり約1.03ミリグラムのKdを与えた。ジャガイモアミロペクチンに対するラフォリン、LSF2、トウモロコシSEX4、およびジャガイモSEX4の結合を測定するためのこの方法の適用性を評価しました。結果は、農学的に重要な作物からの試験されたタンパク質もアミロペクチンに差動的に結合していることを実証した。ペレットおよび上清画分におけるすべての定量的測定値の、負荷された総タンパク質に対する正規化を覚えておくことが重要です。すべてのアミロペクチンがビーズに結合していることを確認するには、上清画分を保存して、後でディープグルコースアッセイを実行します。グルカンホスファターゼは、炭水化物に結合、位置特定、および脱リン酸化するために異なるメカニズムを採用しています。この方法では、位置特異的な脱リン酸化のために、大きなポリマー複合体内の異なる構造ドメインへのグルカンホスファターゼの結合を探索することができます。

concanavalin-based-sedimentation-assay-to-measure-substrate-binding

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

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