Name: クローズド半自動ワークフローを用いた臨床応用のためのヒト間葉系幹細胞処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぼう、逆流遠心システムを用いたヒト間葉系幹細胞のクローズド自動収穫法。多層培養フラスコから細胞回収率98％・生存率99％を達成し、cGMP準拠の臨床応用に適した効率的な細胞処理プロトコルを解説する。

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著者らは、シンガポールのA*STARからのインダストリー・アライメント・ファンド・プレポジショニング(IAF-PP)資金(H18/01/a0/021およびH18/AH/a0/001)からの支援に感謝の意を表したい。

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</ol>

P.J.、A.B.、R.L.、およびJ.N.はサーモフィッシャーサイエンティフィックの従業員です。A.L.とS.O.には利益相反はありません。

この研究では、向流遠心分離装置を使用して、hMSC解離を閉じ、半自動化し、ベンチで洗浄および回収する能力を示しました。ワークフロー全体の重要なステップの1つは、カウンターフロー遠心分離システムのプロトコルビルダーで定義されたプリセットプロトコルに従ってチューブが接続されていることを確認することです。セットアップと操作は簡単で、キットの組み立てから細胞回収までの10層フラスコからの約2Lの培養を処理するのにかかった時間は約60分でした。このワークフローの制限ステップの1つは、多層フラスコから向流遠心分離装置に接続されたトランスファーバッグへの流体移送です。高流量シングルユースキットは、最大流量165 mL/minでしか実行できず、40層フラスコなどの処理には困難な場合があります。流体移送のプロセスを迅速化するために、外部の高流量ポンプを使用して、最初にトリプシン処理された内容物をトランスファーバッグに移し、次に向流遠心分離システムを使用してトランスファーバッグから細胞を洗浄/濃縮および回収することができます。さらに、このプロトコルは、4層から10層多層フラスコへの継代細胞にも適用できます。さらに上流では、向流遠心分離システムは、解凍したhMSCの洗浄、およびシードトレインを開始するための多層フラスコへの直接収穫および培地製剤の最適化にも最適化できます。気流遠心分離チャンバ内の流動床を形成するのに必要な最小細胞数は約3000万細胞であり、バッチ当たりの処理に推奨される最大容量は20Lであることに留意すべきである。
現在、カスタムチューブアセンブリをバイオセーフティキャビネット内の多層フラスコに取り付け、コンポーネントのパーツをオートクレーブすることは、cGMP設定では望ましくありません。別の方法として、カスタムガンマ滅菌チューブアセンブリをサプライヤーにアウトソーシングすることもできます。多層フラスコを提供するサプライヤーは、0.2 μmフィルターを含む目的のチューブアセンブリをフラスコに事前取り付けし、衣装全体のガンマ滅菌を行うオプションも提供しています。これにより、多層フラスコと付属チューブが真に閉じられ、クラスCのクリーンルーム設定のベンチでプロセスを完了できるようになります。
向流遠心分離システムを利用するこのプロセスは、多層容器内の接着ベースの培養細胞に限定されず、動的(攪拌タンクまたはウェーブバイオリアクター)および静的(ガス透過性)懸濁液ベースの細胞増殖プラットフォームに適応できます。具体的には、3Dマイクロキャリア培養で増殖したhMSCの場合、マイクロキャリアから解離したhMSCを回収、洗浄、および製剤化するためのプロトコルをカウンターフロー遠心分離システムで最適化できます。 
全体として、プロセスの堅牢性と信頼性が向上したトランスレーショナル細胞療法の開発への関心の高まりにより、閉鎖型の自動化された細胞処理プラットフォームが開発されました。これらのシステムは、取り扱い工程の数を減らし、滅菌接続による潜在的な汚染を防ぎ、労力を削減し、クリーンルームスペースの有効利用を高めることによって製造コストを削減するため、不可欠です21。これに沿って、治療法を翻訳するための規制当局の承認を求めている細胞治療製品開発者の多くは、プロセス開発段階の早い段階でプロセスを閉じ、完全自動化または半自動化を実装することの重要性を認識しています14,31,32。
規制に配慮したSFM XF培地を使用し、21 CFR GMP Part 11および国際的な品質ガイドラインに準拠した補助試薬とともに、この半自動化されたプロセスは臨床製造に容易に適しています。我々は、クローズドプロセスの再現性とWJ-MSCの品質の維持を示しました。 多層フラスコで接着性細胞を培養する効率と安全性を向上させることは、hMSC治療分野だけでなく、細胞株バンキングや接着性ウイルス生産の企業にも利益をもたらすでしょう。

ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は、臨床的に関連する細胞の投与量を生成するために重要な、治療の可能性とin vitroで増殖する高い自己複製の可能性を考えると、組織工学と細胞治療の両方における臨床応用の優れた候補です1,2,3。ClinicalTrials.gov によると、現在、さまざまな病状について1,000を超える臨床試験が調査中です4。hMSCの使用への関心の高まりを背景に、近い将来、より多くの臨床試験と市場承認が差し迫っています5,6。ただし、hMSCの製造には、バッチ間のばらつき、リスクの高い原材料の使用、製造には複数のユニット操作、人件費の上昇、スケールアウトまたはスケールアップのコスト、および規制上のハードルが含まれるため、多くのオープンおよび手動プロセスによる汚染に関する懸念に関して、多くの固有の課題があります6,7,8,9,10、11,12。これらの問題は、現在および将来の市場アクセスに対する重大な障壁であり続けています。
クローズドでモジュール式の自動化された製造ソリューションを開発し、リスクの低い補助試薬を使用することで、これらの課題に対処できます。これにより、一貫した製品品質が確保され、人為的ミスによるバッチ障害の可能性が減少し、人件費が削減され、デジタルバッチ記録管理などの観点から、プロセスの標準化と規制コンプライアンスが向上します8、12、13、14。臨床的に関連する細胞の投与量を取得できるようにするには、自家または同種異系のいずれであっても、上流の細胞増殖と下流の処理を閉じた自動化された方法で含む合理化された製造が不可欠です。
上流のhMSC拡張では、現在採用されている2つの最も一般的な製造方法は、スケールアウト(2D単層)とスケールアップ(3Dマイクロキャリアベースのサスペンションシステム)です15,16,17,18。hMSC拡張のための最も伝統的で広く採用されている方法は、低い生産コストとセットアップの容易さのために、2D単層ベースの培養です19。
培養容器内に積み重ねられた平らな表面トレイで構成される多層フラスコは、hMSC生産のスケールアウトに一般的に利用されます。これらのシステムは、典型的には、1層〜40層の培養容器20 で提供され、バイオセーフティキャビネット内で手動で取り扱われる。細胞の継代および回収中の処理ステップでは、容器全体をピペッティングまたは物理的に傾けて、増殖培地、解離試薬、および洗浄バッファーを手動で分注およびデカントします。さらに、複数のユニットを扱うことは、そのサイズと重量のために困難で時間がかかります。
続いて、多層フラスコからのポストハーベスト、培地交換のための遠心分離、細胞洗浄、および体積減少は、細胞製造ワークフロー21全体にわたって不可欠なステップである。従来のベンチトップ遠心分離は、バイオセーフティキャビネット内のキャップ付きチューブまたはボトルへの細胞懸濁液の移し替え、細胞のスピンダウン、上清の手動吸引、バッファーによる細胞の再懸濁、細胞洗浄の繰り返しなど、多数のステップを含む、ほとんどオープンで手動のプロセスです。これにより、キャップの開閉による汚染のリスクと、手動吸引/ピペッティングプロセス中にセルペレットを失う可能性の両方が劇的に増加します22。hMSCなどの接着性細胞用の多層培養システムを扱う場合、オペレーターは遠心分離機とバイオセーフティキャビネットの間を繰り返し行き来し、同時に重いユニットを扱うという骨の折れるプロセスを経る必要があります。これらの手動ステップは面倒であり、人為的ミスや汚染の面でリスクをもたらし、コストがかかるクラスBのクリーンルーム環境で実施する必要があります23。さらに、従来の手動遠心分離プロセスはスケーラブルではなく、細胞のせん断やストレスを引き起こす可能性があります。したがって、細胞回収率、生存率、および残留不純物のウォッシュアウト効率を最大化することは、他の主要な課題22である。細胞治療の商用cGMPスケール製造には、汚染のリスクを低減し、一貫した製品品質を確保し、人件費と生産コストを削減し、プロセスの信頼性を高めるために、閉じたモジュール式の自動化ソリューションが必要です24,25。多層フラスコは、滅菌ガス交換を容易にするためにポートの1つに滅菌0.2μmフィルターを備え、2番目のポートをコネクタを介して無菌的に接続するか、細胞収穫用の自動細胞処理装置に直接チューブ溶接することで、クローズドシステムとして取り扱うことができます。私たちは、細胞、遺伝子、または組織ベースの製品の製造を目的とした革新的なクローズドカウンターフロー遠心分離機を評価することにより、WJ-hMSC継代および回収のほとんどのステップの閉鎖と自動化に取り組みました。この向流遠心分離機は、サイズに基づく細胞分離、培地/バッファー交換、濃縮、さまざまな細胞タイプの回収など、さまざまな細胞処理アプリケーションを実行する柔軟性も備えています8、26、27、28。この装置は、チューブ溶接または無菌コネクタを使用して滅菌接続してバッグを移送したり、選択した拡張プラットフォームに直接接続したりできるクローズドシングルユースキットを使用しています。
この研究では、シングルユース向流遠心分離キットと多層フラスコの間の閉じた滅菌接続を可能にするカスタムチューブアセンブリを設計しました。私たちは、WJ-MSCを多層フラスコから酵素的に分離、洗浄、回収するためのプロトコルを最適化しました。採取したWJ-hMSCは、純度(表面マーカー分析)と効力(CFU-F、三系統分化、サイトカイン分泌プロファイル)について特徴付け、最終製品がロット放出の重要な品質属性(CQA)を満たしていることを確認しました。

<table><tbody><tr><td>2L PVC転写バッグ</td><td>テルモBCT</td><td>BB*B200TM</td><td></td></tr><tr><td>アルシアンブルー溶液、pH 2.5</td><td>メルク</td><td>101647</td><td></td></tr><tr><td>アリザリン-レッド染色溶液</td><td>メルク</td><td>TMS-008-C</td><td></td></tr><tr><td>APC抗ヒトCD73抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>344015</td><td></td></tr><tr><td>APCマウスIgG1、&κ;アイソタイプ・コントロール (FC) 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>400121</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex MAGPIX マルチプレックスリーダー</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カウンターフロー遠心分離システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A47679</td><td>Gibco CTS ロテア カウンターフロー遠心分離システム</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>CTS (L-アラニル-L-グルタミン) GlutaMAX サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>CTS ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A1285601</td><td>カルシウム、マグネシウムなし</td></tr><tr><td>CTS 組換えヒトビトロネクチン(VTN-N)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>CTS TrypLE セレクト酵素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイ</td>エンティフィック サイエンティフィック A1285901 <td></td></tr><tr><td>カスタムチューブアセンブリ</td><td>サンゴバン・アンド・コールド・プロダクト・カンパニー(CPC)</td><td>N/A</td><td>ガンマ線滅菌済み3/32インチID PVCラインには、滅菌済みのオスMPC(1/8インチバーブ)が取り付けられ、もう一方の端に密封されています。オートクレーブは、一方の端に無菌のCell Factoryポートコネクタ、もう一方の端にメスMPC(3/8インチバーブ)が取り付けられた短いC-Flexラインです。バイオセーフティキャビネット内のPVCラインとC-Flexラインを接続</td></tr><tr><td>Emflon IIカプセル(0.2umフィルター)</td><td>ポール</td><td>KM5V002P2G100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12662029</td><td>間葉系幹細胞認定、USDA承認領域</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD105 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>323203</td><td></td></tr><tr><td>FITC抗ヒトCD45抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>304005</td><td></td></tr><tr><td>FITC抗ヒトCD90(Thy1)抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>FITCマウスIgG1、&κ;アイソタイプ・コントロール(FC)抗体</td><td>バイオレジェンド</td>・<td>400109</td><td></td></tr><tr><td>・ハイフロー・シングルユース・キット</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A46575</td><td>Gibco CTS ロテア・ハイフロー・シングルユース・キット、流速30 &ndash; 165 mL/分</td></tr><tr><td>多層システム&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140360 (4 層); 140410 (10 層)</td><td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-3000</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td></td></tr><tr><td>Oil red O staining solution</td><td>Merck</td><td>102419</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PerCP抗ヒトCD34抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>343519</td><td></td></tr><tr><td>PerCPマウスIgG1、&κ;アイソタイプ制御抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>400147</td><td></td></tr><tr><td>ProcartaPlex マルチプレックス免疫測定法</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>カスタム 19-プレックスパネル:FGF-2、HGF、IDO、IL-10、IL-1RA、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MCP-2、MIP-1、MIP-1、MIP-1、MIP-3、PDGF-BB、RANTES、SDF-1、TGF、TNF-α、VEGF-A&nbsp;</td></tr><tr><td>サンプルポート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A50111</td><td>ガンマ線滅菌ルールサンプルポート、2本のPVCラインを取り付けた</td></tr><tr><td>StemPro脂肪生成分化キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>StemPro軟骨細胞分化</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>StemProカスタムMSC SF XF ミディアムキット(SFM XFミディアム)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ME20236L1</td><td>には、StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)</td></tr><tr><td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10072-01</td><td></td></tr><tr><td>T175 Nunc EasYFlask</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T75 Nunc EasYFlask</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHG9204</td><td></td></tr><tr><td>WJ MSC&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>(#C12971;ドイツ)</td><td>ヒト間葉系幹細胞</td></tr><tr><td>&α;MEM培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12571063</td><td>ヌクレオシド付き</td></tr></tbody></table>

クローズド半自動ワークフローを用いた臨床応用のためのヒト間葉系幹細胞処理

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は現在、さまざまな疾患の有望な細胞ベースの治療法として探求されており、今後数年間で臨床使用のためのより多くの市場承認が見込まれています。この移行を促進するには、規模、ロット間の再現性、コスト、規制コンプライアンス、品質管理のボトルネックに対処することが重要です。これらの課題は、プロセスを終了し、自動化された製造プラットフォームを採用することで対処できます。本研究では、ウォートンゼリー(WJ)由来のhMSC(WJ-hMSC)を向流遠心分離を用いて多層フラスコから継代および回収するための閉鎖および半自動プロセスを開発しました。WJ-hMSCは、規制に準拠した無血清ゼノフリー(SFM XF)培地を使用して拡張され、従来の血清含有培地で拡張されたWJ-hMSCと同等の細胞増殖(集団倍増)および形態を示しました。当社のクローズド半自動ハーベスティングプロトコルは、高い細胞回収率(~98%)と生存率(~99%)を示しました。細胞を洗浄し、WJ-hMSC表面マーカー発現、コロニー形成単位(CFU-F)、三系統分化能、およびサイトカイン分泌プロファイルを維持したカウンターフロー遠心分離を用いて濃縮した。本研究で開発された半自動細胞採取プロトコルは、異なる細胞増殖プラットフォームに直接接続して、低出力量で減容、洗浄、および収穫を行うことにより、さまざまな接着細胞および浮遊細胞の小規模から中規模の処理に簡単に適用できます。

融解後のWJ-hMSCマスターセルバンク(MCB)は、実験に十分な作業細胞バンク(WCB)を生成するために、古典的な血清含有培地で3回連続した継代(p1-p4)にわたって維持されました。p4 WCBを、血清含有培地およびSFM XF培地の両方で解凍し、T-175フラスコ内でさらに3回継代(p4-p7)増殖させた。WJ-MSCは、SFM XF培地で増殖した場合に良好に適応し、血清含有培地と同様の安定した増殖を維持することができました(図2A)。しかし、SFM XF培地で増殖した細胞は、わずかに長い線維芽細胞様の紡錘形の形態を示し、血清含有培地では~15 μmと比較して、平均~17 μmのわずかに大きな細胞サイズ(図2B)をもたらしました。3つの継代にわたる両方の培地条件において、WJ-hMSCは一貫して最大細胞密度~2.3 x 104 細胞/cm2 に達し、集団倍加時間は~34時間でした(図2C、D)。
閉鎖系での大規模なWJ-hMSC拡張のために、WJ-hMSCのシードトレイン拡張を最初に4層フラスコで行い、その後、10層多層フラスコで展開しました。培養4日後の約80%〜90%のコンフルエントで、4層スタックおよび10層スタックについて、それぞれ9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107および2.3 x 10 8 ± 0.2 x 108細胞を採取した。T-175フラスコと比較して、3.6 x 10 4-3.8 x 104細胞/cm2のより高い細胞密度に達し、スタックにより最大7倍の細胞増殖が可能になりました。
また、10層培養容器に展開したWJ-hMSCsを、向流遠心分離を用いて直接回収した。シングルユースキットへの滅菌接続は、装置の蠕動ポンプを使用して最大流量165 mL/minで直接流体移送するために簡単に確立できました。半自動細胞採取プロセスは、最初に酵素解離を使用して細胞を回収し、細胞を向流チャンバーにロードして体積を減らして濃縮し、次に向流遠心分離チャンバーの約3倍の体積の洗浄バッファーで洗浄することによって達成されました。さらに、洗浄した細胞を濃縮し、プロトコルに予め設定された所望の収穫量まで回収した。半自動細胞処理に使用される処理ステップは、手動収穫ワークフローをエミュレートするように設計されました。体積を10倍に低減し、530万細胞/mLもの細胞濃度を実現しました。このプロトコルは、3回の独立した実行すべてで一貫して~98%の高い細胞回収率と~99%の高い細胞生存率を達成することができました(図3A-C)。
手動遠心分離と比較した向流遠心分離を使用して、細胞採取の重要な品質属性を決定するために、広範な細胞特性評価アッセイを実施しました。WJ-hMSCの同一性を試験するために、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーにより分析した。 図4Aに示すように、両法を用いて採取したWJ-hMSCは、ISCT規則に従って特徴的な表面マーカープロファイル、CD73、CD90、およびCD105の陽性発現、ならびにCD34およびCD45の陰性発現を示した。次に、WJ-hMSCsのクローン形成能を評価するために、CFU-Fアッセイを実施した。 図4Bに示すように、向流遠心分離から採取された細胞は、手動遠心分離によって回収された細胞と比較して同様のCFU-F電位を示した(それぞれ21%±1%対20%±1%)。さらに、 図4Cに示すように、向流遠心後に回収した細胞は、手動遠心分離法の細胞と同様の脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞への分化能を保持していた。最後に、マルチプレックスイムノアッセイを用いて、細胞の18種類のサイトカイン分泌プロファイルを調査しました。 図4Dに示すように、逆流遠心分離後の細胞洗浄・濃縮はサイトカイン分泌プロファイルを維持し、細胞洗浄/濃縮前(向流前遠心分離)のサンプルと同程度であった。
全体として、SFM XF培養システムで効率的なhMSC増殖が実証されており、閉じた自動向流遠心分離システムを使用して細胞を洗浄および濃縮すると、洗浄後の高い細胞回収率と生存率が得られ、表現型と機能を維持することができました。この研究で開発されたクローズド半自動プロセスは、3回の独立した実行から証明されるように、最終的なWJ-MSC回収に関して製品品質の一貫性を提供できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg"> 図1:hMSCの収穫、洗浄、濃縮のための高流量シングルユースキットの構成と組み立て 。 (A)バッグをそれぞれのチューブに沿って接続した後のキット図。(B)カスタムチューブアセンブリを備えた高流量シングルユースキットに接続された10層多層フラスコ。(C)向流遠心分離ソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェイスで有効になるカメラ機能 を介して 、向流チャンバー内に形成された安定した流動細胞床の視覚化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg"> 図2:血清含有培地とSFM XF培地におけるhMSCの細胞形態と増殖の比較。 (A)古典血清培地およびSFM XF培地におけるhMSCsの代表的な細胞形態。SFM XF増殖細胞は、より長い紡錘形の特徴的な線維芽細胞様形態を示したが、血清含有培地で増殖した細胞はより平坦な形態を示した。(b)血清含有培地とSFM XF培地との間の平均MSCサイズを、自動セルカウンター(n=3)により測定する。SFM XF増殖細胞は、異なる継代にわたって血清増殖細胞よりも一般的に大きかったことは明らかである。異なる継代における総細胞収量(n=3)(C)培養表面積当たりの細胞換算および(D)集団倍加レベル。SFM XF培地と血清含有培地との間で、異なる継代にわたって同様のレベルの細胞収量が得られた。データは、標準偏差±平均値として表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg"> 図3:向流遠心分離システムを使用して処理された細胞の特性評価 。 (a)洗浄および濃縮前後の全生細胞。(B)向流遠心分離処理後により10倍の体積減少を達成した。(C)細胞の全回収率および生存率。データは、洗浄および濃縮実行の3つの生物学的反復(n = 3)にわたって平均化されます。データは、平均値±標準偏差で表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg"> 図4:重要な品質属性分析 。 (A)フローサイトメトリーからの代表的なデータ。(B)CFUの合計を示す代表的な画像。(C)三系統分化の代表的な顕微鏡像。(d)細胞をカウンターフロー遠心分離システムで処理する前後のサイトカイン発現解析結果(n=3)。データは、平均値±標準偏差で表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:初期プライミングステップを含む、向流遠心分離システムでのトリプシン処理、洗浄、および濃縮プロトコルによるhMSC回収の順序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、向流遠心分離システムを使用して、多層フラスコから接着細胞を密閉半自動方式で回収するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、既存のステップにほとんど変更を加えることなく、他の細胞増殖プラットフォームから接着細胞と浮遊細胞の両方を回収するために適用できます。

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

ベンチトップ遠心分離はオープンで手動のプロセスであり、拡張が困難です。私たちのプロトコルは、間葉系幹細胞(MSC)の解離、洗浄、および収穫を1回の実行で閉じて自動化する方法を示しています。セットアップは簡単です。プロセス全体は、クラスcGMP施設のバイオセーフティキャビネットの外で実行できます。クローズド自動セル処理により、リスクが発生しやすい手動処理ステップが削減され、cGMPコンプライアンスが可能になります。この方法は、多層培養系で増殖した他の細胞種にも適用できます。カウンターフロー遠心分離システムにより、さまざまなアプリケーションに合わせて任意のプロトコルステップを変更できます。この手順を実演するのは、シンガポールのスターであるバイオプロセシングテクノロジーインスティテュートの幹細胞バイオプロセシンググループのスタッフサイエンティストであるアランラム博士です。シングルユース向流遠心分離キットの組み立てを開始するには、図に示すように、シングルユースキットをシングルユースPVCトランスファーバッグにチューブ溶接で接続します。次に、バイオセーフティキャビネット内で、コンフルエント、ウォートンゼリー由来のヒト間葉系幹細胞またはウォートンゼリーHMSCを含む10層の多層フラスコをカスタムチューブアセンブリに取り付けます。付属のカスタムチューブアセンブリを備えた10層培養容器をベンチに移し、シングルユースキットのラインEに溶接します。また。無菌サンプルポートを高流量シングルユースキットのラインGに溶接します。次に、収穫ラインHを50ミリリットルの注射器を取り付けた滅菌ルアーに接続します。機器の実行を設定するには、機器の背面にあるトグルスイッチを使用して機器のスイッチを入れ、付属のUSBCケーブルを使用してラップトップを機器のUSBCポートに接続します。デスクトップまたはスタートメニューからカウンターフロー遠心分離機のグラフィカルユーザーインターフェイスまたはGUIソフトウェアを実行し、サインインします。次に、メインのウェルカム ページの [プロトコルの選択] ボタンをクリックしてプロトコルを読み込みます。次に、装置の青いロック解除ボタンを押してガラスドアを開き、組み立てられたシングルユースキットをカウンターフロー遠心分離システムにロードします。まず、10層の多層フラスコを斜めに配置した状態で、バブルセンサーストリップのチューブポートと最もよく一致する順序でバッグをハンガーフックに掛けることから始めます。キットを2つのキット位置ボタンに合わせます。蠕動ポンプの周りにポンプチューブを引き伸ばし、白い電球型のコネクタを所定の位置に押し込みます。向流遠心室キャリアの銀色のレバーを持ち上げて遠心分離室を取り付け、レバーを直立位置に戻して固定します。キットの各ポートからのチューブをバブルセンサーストリップに沿ってトラックに押し込みます。ドアラッチを押してドアを閉じます。GUIの[開始]ボタンを押します。チェックリストが表示されます。最初の4つの項目は機器チェックで、最後の2つはユーザーチェックです。この時点で、バッグと接続がキットの画像と一致し、手動クランプが開いていることを確認してください。確認を押して、プロトコル入力画面を表示します。データ入力または収穫量ダイアログボックスの値を45ミリリットルに設定し、[確認]を押します。機器の緑色のスタートボタンを押して、プロトコルの実行を開始します。最初のプライミングが完了したら、使用済み培地が廃棄物バッグに完全にポンプで排出されていることを確認してください。ワークフロー表に示されている一時停止ステップで、多層フラスコを持ち上げて振とうし、バッファーをすべてのトレイに均等に分配します。完了したら、次のステップのために10層多層フラスコを元の描画位置に戻します。ステップ20および23では、トリプシン処理された細胞が中間バッグに完全に移されることを確認する。ステップ25で中間バッグを手動でよく混ぜます。ステップ26では、2ミリリットルのルアーシリンジを使用して、サンプリングポートからサンプリングします。ステップ29および30では、流動細胞床の安定した形成を確認する。ここに示す流動細胞床のようになるはずです。ランプから停止ステップへの実行が完了し、向流遠心分離システムのすべてのピンチ値が自動的に閉じます。プロトコルの実行が完了したら、機器の青いロック解除ボタンを押して、ガラスのドアを開きます。ハンドキャリーチューブシーラーを使用して収穫ラインを無菌的に密封し、濃縮細胞収穫物で満たされた密封されたシリンジを細胞計数と凍結保存のために生物学的安全キャビネットに慎重に移します。レバーを使用してチャンバーを再度取り外します。電球コネクタをフィッティングから引き出し、キットを慎重に持ち上げてバイオハザードバッグに廃棄します。エタノールワイプを使用して機器を清掃し、ドアを閉めます。最後に、機器の背面にあるスイッチをオフにする前に、まずGUIアプリケーションを閉じます。ウォートンゼリーMSCは、血清含有培地と無血清、異種剤フリー培地の両方で増殖した場合によく増殖しました。しかし、無血清、ゼノフリー培地のものは、血清培地の15ミクロンと比較して、わずかに長い線維芽細胞様の紡錘形の形態を示し、平均細胞サイズは17ミクロンと大きくなりました。3つの継代にわたる両方の培地において、ウォートンゼリーHMSCは一貫して平方センチメートルあたり約23, 000細胞の最大細胞密度および34時間の集団倍増時間に達した。実証された向流遠心分離を使用してウォートンのゼリーHMSCを10層培養容器で展開すると、10倍の体積減少が達成され、ミリリットルあたり530万細胞もの細胞濃度が生成されました。このプロトコルは、3回の独立した実行で、一貫して約98%の高い細胞回収率と約99%の高い細胞生存率を達成しました。両方の方法を使用して収穫されたウォートンゼリーHMSCは、CD73、CD90、およびCD105陽性、ならびにCD34およびCD45陰性の特徴的な表面マーカープロファイルを示しました。向流遠心分離から採取された細胞は、手動遠心分離によって回収されたものと比較して、同様のコロニー形成単位線維芽細胞アッセイまたはCFU電位を示した。どちらの方法でも、細胞は脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞に分化する能力を保持していました。逆流遠心分離後の細胞のサイトカイン分泌プロファイルは、逆流遠心分離前に匹敵した。ベッドのセットアップを参照して使い捨てキットを組み立て、この向流遠心システムプロトコルビルダーで置き換えてください。最終製品から残留不純物を洗浄するためのプロトコルは、ユーザーがロットリリース基準を満たすのをサポートするために臨床アプリケーションで使用できます。大規模な処理のための流体移送のプロセスを迅速化するために、多層フラスコから直接収穫するのではなく、外部ポンプを使用してトリプシン処理内容物を最初に移送バッグに移すことができる。

human-mesenchymal-stem-cell-processing-for-clinical-applications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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クローズド半自動ワークフローを用いた臨床応用のためのヒト間葉系幹細胞処理

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