Name: アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性に基づく卵巣癌細胞の層別化へのAlDeSenseの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶALDH1A1活性測定法：イソフォーム選択的蛍光プローブを用いて卵巣がん細胞の幹細胞性バイオマーカーを評価する手法。フローサイトメトリーと生細胞イメージングで高感度・高特異的に検出可能。

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この研究は、国立衛生研究所(R35GM133581からJC)およびイリノイ州がんセンター大学院奨学金(SGに授与)の支援を受けました。JCは、カミーユとヘンリー・ドレフュス財団の支援に感謝します。著者らは、AlDeSenseとAlDeSense AMの株式の準備に最初に貢献したThomas E. Bearrood博士に感謝しています。オリバー・D・ピチャルド・ペゲーロ氏とジョセフ・A・フォルツァーノ氏には、さまざまな合成前駆体の調製にご協力いただき、ありがとうございました。Caov-3、IGROV-1、およびPEO4細胞について、Erik Nelson教授(UIUC分子統合生理学部門)に感謝します。BG-1細胞を提供してくれたPaul Hergenrother教授(UIUC化学科)に感謝します。Zeiss LSM 700共焦点顕微鏡と対応するソフトウェアにアクセスしてくださったCarl R. Woese Institute for Genomic Biologyのコア施設に感謝します。BD LSR II CMtO Analyzerへのアクセスを提供してくださったフローサイトメトリー施設に感謝します。細胞培養培地の調製を支援してくれたサンドラ・マクマスターズ博士と細胞培地施設に感謝します。

1 . 卵巣がん 細胞ホモジネート中のALDH1A1総活性を蛍光測定で測定
<ol><li>T25細胞培養フラスコ中の1×106 個の細胞を5 mL以下の細胞培養培地で解凍します。<ol><li>IGROV-1およびPEO4:10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地。</li>
		<li>BG-1およびCaov-3:10%FBSおよび1%P / Sのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。</li>
		<li>OVCAR-3:20%FBS、1%P / S、および0.01 mg / mLインスリンを含むRPMI 1640。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞をインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 で2〜3回継代維持する。継代する前に、細胞が80%〜90%のコンフルエントを超えないようにしてください。.</li>
	<li>細胞を0.25%トリプシンで10分間トリプシン処理し、自動セルカウンターを使用してカウントし、25°Cで5分間遠心分離(180 × g)を介して1×107細胞をペレット化します。</li>
	<li>吸引 によって 上清を注意深く除去し、1 mLの1x PBSに細胞を再懸濁してペレットを洗浄し、ステップ4に記載したのと同じ条件下で遠心分離 によって 細胞を再ペレット化します。</li>
	<li>細胞を1x PBS中の1xプロテアーゼ阻害剤の溶液に再懸濁します。2.5 ×10 6 細胞あたり1 mLのこの溶液を使用してください。.</li>
	<li>細胞ホモジナイザープローブで2分間(1秒パルス、40%振幅)氷上で細胞懸濁液を超音波処理する。</li>
	<li>不溶性/膜画分を25°Cで15分間遠心分離(3,200 × g) して ペレット化します。上清を除去して保持します, これは後続のステップで使用されるホモジネートであるため.ホモジネートを3つのキュベットに分けて、3連で実験を行います。</li>
	<li>プローブをホモジネートに加え、4 μMの最終プローブ濃度を得ます。 ピペットで上下に3回、溶液をよく混合します。</li>
	<li>蛍光計で、添加直後および希望のインキュベーション時間後に蛍光シグナルを測定します。インキュベーション時間は、最大倍率ターンオン(この実験では1時間)を確認するように最適化できます。インキュベーション時間は、比較するすべての細胞株にわたって一定でなければなりません。<ol><li>励起波長を496nmに設定します。</li>
		<li>発光を510〜600nmに設定します。</li>
		<li>スリット幅を0.5mmに設定します。</li>
		<li>溶液を1 mLの石英キュベットにピペットで入れ、蛍光計に入れてスキャンを押します。</li>
	</ol></li>
	<li>516 nm(最大蛍光波長)での最終蛍光強度を最初の読み取り値と同じ波長の強度で割って、アイソフォーム選択性色素のフォールド活性化を決定します。</li>
</ol>2. ALDH1A1活性の高い細胞をイメージングするための蛍光顕微鏡の使用
<ol><li>T25細胞培養フラスコ中の1×106 細胞を5mLの適切な細胞培養培地中で解凍する。</li>
	<li>細胞をインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 で2〜3回継代維持する。継代する前に、細胞が80%〜90%のコンフルエントを超えないようにしてください。.</li>
	<li>共焦点イメージングの前日に、プレート4×105 細胞を8ウェルチャンバースライドに入れた。<ol><li>各ウェルの底部をポリ-L-リジン(0.1 mg/mL、1ウェルあたり100 μL)で10分間コーティングし、その後吸引します。</li>
		<li>細胞培養グレードの水(ウェルあたり100 μL)を加えて吸引することにより、各ウェルを3回洗浄します。</li>
		<li>細胞を0.25%トリプシンで10分間トリプシン処理し、自動セルカウンターを使用してカウントし、ウェルあたり4 ×10 5 細胞で細胞をプレートします。</li>
		<li>細胞を落ち着かせ、一晩(12〜16時間)付着させます。</li>
	</ol></li>
	<li>増殖培地を吸引し、無血清培地(ウェルあたり500 μL)を添加し、2 μMのプローブまたはコントロールプローブを添加します。</li>
	<li>プローブを室温で30分間インキュベートし、細胞をすぐにイメージングします。</li>
	<li>共焦点顕微鏡の電源を入れ、サンプルに合わせて調整します。<ol><li>最低倍率でサンプルを慎重にロードします。適切な配置を確実にするためにセルを見つけます。</li>
		<li>対物レンズの倍率が10倍であることを確認し、セルを見つけます。</li>
	</ol></li>
	<li>この実験には、FITCチャネル(励起:488 nmレーザー、発光:516-521 nm)とT-PMT(透過光)チャネルが必要です。T-PMTを使用して細胞を見つけて焦点を合わせ、実験全体にわたって同じz平面に焦点を合わせ、バイアスを除去します。</li>
	<li>レーザー出力とFITCゲインを適切な設定に調整し、Ctrl-AlDeSense AMサンプルからの信号が最小限に検出可能でありながら、AlDeSense AMサンプルの信号が見えるようにします。各パラメータは、対応するバーをスライドさせることで調整できます。正しいパラメータを識別するために、設定を数回調整する必要がある場合があります。最適化が完了したら、同じパラメーターを使用して、その細胞株内で残りの実験を完了します。</li>
	<li>1ウェルあたり3枚の画像をスナップし、処理条件ごとに合計3枚のウェルをスナップします(合計9枚)。蛍光チャンネルや合成画像を使用するのではなく、バイアスを避けるためにT-PMTを使用して適切な平面に焦点を合わせます。</li>
	<li>画像を処理して、ALDH1A1+細胞の割合を決定します。<ol><li>画像処理ソフトウェアを使用して、cziファイルを異なるチャネルに分割します。</li>
		<li>細胞の総数と蛍光細胞の総数を数えます。</li>
		<li>ALDH1A1+細胞の割合を決定するには、蛍光細胞の数を各画像内の細胞の総数で割ります。たとえば、明るさを調整すると交絡変数が追加される可能性があるため、画像を操作せずに各画像について同じ方法でカウントすることが不可欠です。</li>
	</ol></li>
</ol>3. フローサイトメトリーによるALDH1A1活性の高い細胞の同定
<ol><li>T25細胞培養フラスコ中の1×106 細胞を5mLの適切な細胞培養培地中で解凍する。</li>
	<li>細胞をインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 で2〜3回継代維持する。継代する前に、細胞が80%〜90%のコンフルエントを超えないようにしてください。.</li>
	<li>細胞をトリプシン処理、カウント、および15 mL遠沈管で25°Cで5分間遠心分離(180 × g) して ペレット化します。</li>
	<li>細胞をPBS中の1 mLの2 μMプローブ/コントロールプローブ溶液に再懸濁します。細胞を室温で60分間揺り動かして、色素への曝露が均一になるようにします。</li>
	<li>インキュベーション期間の後、25°Cで5分間の遠心分離(180 × g) を介して 細胞をペレット化します。細胞を0.5 mLのPBSに再懸濁します。細胞をセルストレーナー(35 μmナイロンメッシュ)に通し、フローサイトメーターを詰まらせる可能性のある細胞塊を取り除きます。すぐに細胞を氷の上に置きます。</li>
	<li>機器の電源を入れ、起動プロトコルを実行します。</li>
	<li>シース液と空の廃棄物がないか確認してください。</li>
	<li>10%の漂白剤と水でそれぞれ5分間ラインを実行します。</li>
	<li>品質管理ビーズを実行して、適切な機能を確保します。</li>
	<li>設定タブで、蛍光フィルターに FSC(前方散乱)、SSC(側方散乱)、およびFITC(フルオレセインイソチオシアネート) を選択します。</li>
	<li>次のグラフを描画して、生存率、一重項、および蛍光をゲートします。レーザー出力(ユーザーの機器に固有)を最適化して、細胞集団がさらなる分析のために指定されたパラメータ内に収まるようにします。<ol><li>FSC-A対SSC-A散布図:メインセル集団はグラフの中央近くにあります。</li>
		<li>FSC-A対FSC-W散布図:(細胞塊ではなく)一重項を示す狭い水平バンド。</li>
		<li>FITC-A対FSC-A散布図:アイソフォーム選択蛍光発生ターンオンプローブでソートされた細胞の分布を観察します。</li>
		<li>FITC-Aヒストグラム:FITCに基づいて集団の変化を観察し、ALDH1A1+細胞の割合を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>FITCレーザー出力を最適化するには、ヒストグラム曲線の右裾が最大FITC-A信号に近づくようにプローブでサンプルを実行します。続いて、コントロールプローブでサンプルを実行します。最大ダイナミックレンジを明らかにするために、ポピュレーションシフトを観察できる必要があります。レーザー出力の最適化ステップを複数回繰り返す必要がある場合がありますが、実験の設定が指定された後は、サンプル間でレーザー出力を変更しないでください。</li>
	<li>各サンプルを10,000カウント実行します(3回で行います)。</li>
	<li>細胞株ごとにステップ3.12を繰り返しますが、取り込みとALDH1A1活性にはばらつきがあります。</li>
	<li>サンプル収集が完了したら、10%漂白剤と水でラインをそれぞれ5分間実行し、機器のシャットダウンを開始します。</li>
	<li>フローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを処理し、目的の細胞集団をゲートします。すべてのイベントが ALDH1A1- ゲートまたは ALDH1A1+ ゲートのいずれかに入るようにゲートを設定します。矩形ゲート選択を使用して、コントロールプローブサンプルのイベントの>99.5%がこのゲート内で発生するようにALDH1A1-ゲートを設定します。残りのセルはALDH1A1+と見なされます。次に、これらの同じゲートをプローブサンプルに適用して、ALDH1A1-およびALDH1A1+と見なされるイベントの数を定量化できます。</li>
</ol>

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</ol>

AlDeSense技術に関する出願中の特許(US20200199092A1)を開示します。

汎選択性は、多くのALDHプローブの主要な制限です。しかしながら、いくつかのアイソフォーム選択的例が最近報告されている32、33、34、35、36、37、38、39、40、41。この研究で使用されたアイソフォーム選択蛍光発生プローブは、大量に存在する競合酵素の存在下でも、ALDH1A1アイソフォームとのみ反応する最初の合理的に設計されたプローブを表しています<sup cl...

がん幹細胞(CSC)は、幹細胞のような特性を示す腫瘍細胞の亜集団です1。非癌性の対応物と同様に、CSCは自己再生および増殖する並外れた能力を持っています。ATP結合カセットトランスポーターのアップレギュレーションなどの他の組み込みメカニズムとともに、CSCは、最初の外科的デバルキング作業やその後の補助療法から免れることがよくあります2。CSCは、治療抵抗性3、再発4、および転移5において重要な役割を果たすため、がん研究の優先事項となっています。CSCの同定に使用できる細胞表面抗原(CD133など)はさまざまですが6、細胞質に見られるアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の酵素活性を活用することは、魅力的な代替手段として浮上しています7。ALDHは、対応するカルボン酸生成物8への反応性内因性および生体異物アルデヒドの酸化を触媒する19の酵素のスーパーファミリーである。
一般に、アルデヒド解毒は、幹細胞の完全性を損なう可能性のある望ましくない架橋事象や酸化ストレスから細胞を保護する上で非常に重要です9。さらに、1A1アイソフォームはレチノイン酸代謝を制御し、レチノイン酸代謝はレチンアルデヒドシグナル伝達を介してステムネスに影響を与えます10。AlDeSense 11,12は、ALDH1A1活性を選択的に検出するための低分子活性ベースのセンシング(ABS)プローブであり、最近開発されました。ABS設計は、結合イベントではなく化学変化によって分析物検出を実現し、高い選択性とオフターゲット応答の減少を可能にします13,14,15,16。アイソフォーム選択的蛍光発生プローブの設計原理は、プローブ18の蛍光シグネチャを抑制するのに役立つアルデヒド官能基に由来するドナー光誘起電子移動(d-PeT)消光機構17に依存しています。ALDH1A1を介したカルボン酸への変換時に、放射緩和が解除され、蛍光性の高い生成物が得られます。d-PeT消光は100%効率的ではないため、このアッセイを確立する際には、細胞内で一致する光物理的特性(量子収率など)と同一の細胞質染色パターンを備えた非応答試薬であるCtrl-AlDeSenseの開発を通じて、偽陽性の結果につながる可能性のある残留蛍光が考慮されました。このユニークなペアリングを併用することで、蛍光測定、分子イメージング、フローサイトメトリーにより、ALDH1A1活性の高い細胞と低レベルを示す細胞を確実に区別することができます。いくつかの重要な利点は、従来の免疫組織化学的方法よりもアイソフォーム選択的活性化可能な色素を使用することに関連しています。たとえば、CSCは腫瘍の奥深くに埋もれていると仮定されているため、大きな抗体に比べて小分子にアクセスしやすくなります19。さらに、ターンオーバーした蛍光産物は細胞成分を共有結合的に修飾しないため、洗浄サイクルで容易に除去し、CSCを未修飾の状態のままにすることができます。最後に、ターンオン応答は、NAD+補因子に依存しているため、MTTアッセイと同様に、生細胞と機能のみを識別します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig01.jpg"> 図1:AlDeSenseの蛍光ターンオンを示す回路図。 アイソフォーム選択的色素はALDH1A1によって活性化され、蛍光測定、分子イメージング、およびフローサイトメトリー を介して 卵巣癌細胞におけるALDH1A1活性の上昇を特定するために使用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64713/64713fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
過去の研究では、アイソフォーム選択的蛍光発生プローブアッセイは、K562ヒト慢性白血病細胞、MDA-MB-231ヒト乳がん細胞、およびB16F0マウス黒色腫細胞において、ALDH低(ALDH-)細胞からALDH高(ALDH+)細胞を層別化することに成功しました。多くの種類のがんにとって、ALDH1A1タンパク質の発現が高いことは臨床予後が悪いことを意味するため、これは重要です20。これは、ALDH1A1のレベルの上昇が、治療を回避し、耐性を発達させ、全身に広がる可能性のあるCSCを示していると想定しています。しかし、卵巣がんの場合、反対の所見(ALDH1A1の高発現は患者の生存率の改善につながる)を報告する研究があります21,22,23,24。これは一見矛盾しているように見えるかもしれませんが、発現は必ずしも酵素活性と相関しているわけではなく、腫瘍微小環境の変化(pHフラックス、酸素勾配など)、NAD+補因子またはアルデヒド基質の利用可能性、カルボン酸のレベル(生成物阻害)、および酵素活性を変化させる可能性のある翻訳後修飾によって影響を受ける可能性があります25.さらに、卵巣がんは5つの主要な組織型(高悪性度漿液性、低悪性度漿液性、子宮内膜症、明細胞性、粘液性)に分けられ、ALDH1A1活性のさまざまなレベルを特徴とすると仮定します26。卵巣腫瘍におけるALDH1A1活性を調査することを目的として、アイソフォーム選択的蛍光発生プローブアッセイを使用して、上記の異なる組織型に属する5つの卵巣癌細胞株のパネルにおけるALDH1A1+集団を同定しました。この研究でテストされた細胞株には、BG-1、Caov-3、IGROV-1、OVCAR-3、およびPEO4細胞が含まれ、明細胞および漿液性組織型をカバーしています。ここでは、プローブの汎用性と一般化可能性が強調され、他の不死化癌細胞株および患者サンプルで同様の研究を実施しようとする研究者のためにCSCを同定しました。AlDeSenseの使用は、複雑な組織微小環境におけるCSC維持に関与する生化学的経路に光を当て、予後を決定し、癌の攻撃性を測定するための臨床ツールとして役立つ可能性があります。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;0.25%トリプシン、0.1%EDTA含有HBSS含有、カルシウム、マグネシウム、重炭酸ナトリウム</td>コー<td>ニング</td><td>なし&nbsp;&nbsp;25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffer Saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CMX12</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Synthesized in-house</td></tr><tr><td>BG-1</td><td></td><td></td><td>イリノイ大学 Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>BioLite 25cm2フラスコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>130189</tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット 1300シリーズ A2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caov-3</td><td></td><td></td><td>イリノイ大学エリック・ネルソン研究室からの寄贈品 アーバナ・シャンペーン</td></tr><tr><td>細胞ホモジナイザー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック<tr><td>・遠心分離機 5180R</td><td>エッペンドルフ</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>Contrl-AlDeSense</td><td></td><td></td><td>合成された社内</td></tr><tr><td>DMEM、10% FBS、1% P/S</td><td></td><td></td><td>UIUC細胞により調製メディア施設</td></tr><tr><td>ファルコン 丸底ポリスチレン試験管 セルストレーナー スナップキャップ付き 5mL</td><td>コーニング</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td></td><td></td><td>UIUC CMtO</td></tr><tr><td>FL顕微鏡</td><td>EVOS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II Water-Jacketed CO2&nbsp;インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>IGROV-1</td><td></td><td></td><td>イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校エリック・ネルソン研究室からの寄贈</td></tr>品 <tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 42R インキュベーションシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek チャンバー #1.0 ホウ酸コーティングガラス システム</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155383</tr><tr><td>OVCAR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>PEO4</td><td></td><td></td><td>イリノイ大学エリック・ネルソン教授研究室からの贈り物 アーバナ・シャンペーン</td></tr>・<tr><td>ピアス・プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>・カルトレックス</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>ロッカーVWR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI、10% FBS、1% P/S</td><td></td><td></td><td>UIUC 細胞培地施設で調製</td></tr><tr><td>RPMI、20% FBS、1% P/S、0.01 mg/mL インスリン</td><td></td><td></td><td>UIUC 細胞培地施設で調製</td></tr></tbody></table>

アルデヒドデヒドロゲナーゼ1a1活性に基づく卵巣癌細胞の層別化へのaldesenseの応用

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

がん治療後の再発は、がん幹細胞(CSC)として知られる腫瘍細胞の亜集団の持続に起因することが多く、顕著な腫瘍開始能力と自己複製能力が特徴です。腫瘍の起源(卵巣など)に応じて、CSC表面バイオマーカープロファイルは劇的に異なる可能性があるため、免疫組織化学染色 による そのような細胞の同定は困難な作業になります。それどころか、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1(ALDH1A1)は、CSCを含むほぼすべての前駆細胞で発現プロファイルが保存されているため、CSCを同定するための優れたマーカーとして浮上しています。ALDH1A1アイソフォームは、対応するカルボン酸生成物への様々な内因性および生体異物アルデヒドの酸化に関与する19の酵素のスーパーファミリーに属する。Chanらは最近、ALDH1A1活性を検出するためのアイソフォーム選択的「ターンオン」プローブであるAlDeSenseと、オフターゲット染色を説明するための非反応性マッチング制御試薬(Ctrl-AlDeSense)を開発しました。このアイソフォーム選択ツールは、K562骨髄性白血病細胞、マンモスフェア、および黒色腫由来のCSC異種移植片におけるALDH1A1活性の検出を通じて、汎用性の高い化学ツールであることがすでに実証されています。この記事では、プローブの有用性を、追加の蛍光測定、共焦点顕微鏡、およびフローサイトメトリー実験を通じて紹介し、5つの卵巣癌細胞株のパネルで相対的なALDH1A1活性を測定しました。

卵巣癌細胞ホモジネートの総ALDH1A1活性 このアッセイから得られた各細胞株の平均倍率ターンオンは、BG-1(1.12±0.01)である。IGROV-1 (1.30 ± 0.03);Caov-3 (1.72 ± 0.06);PEO4 (2.51 ± 0.29);およびOVCAR-3(10.25 ± 1.46)(図2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig02.jpg"> 図2:蛍光測定で測定した各卵巣癌細胞株のホモジネート中のアイソフォーム選択的色素のフォールド蛍光ターンオン(平均±標準偏差)(n = 3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_...

生細胞におけるALDH1A1活性を測定する方法は、幹細胞性のバイオマーカーとしての地位から、がん研究において極めて重要です。この研究では、アイソフォーム選択的蛍光発生プローブを使用して、5つの卵巣癌細胞株のパネルにおけるALDH1A1活性の相対レベルを決定しました。

アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性に基づく卵巣癌細胞の層別化へのAlDeSenseの応用

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...

当社のプロトコルにより、ユーザーはフローサイトメトリーから生細胞分子イメージングに至るまでの多様なモダリティを使用して、幹細胞バイオマーカーであるALDH1A1活性を測定できます。このアプローチの主な利点は、プローブの活性化には、高いシグナル対バックグラウンド比を特徴とするターンアラウンド応答と、選択的なALDH1A1アイソフォーム検出が含まれることです。この手順を実演するのは、私の研究室のマイケル・リー、サラ・ガードナー、ロドリゴ・タピア・ヘルナンデスの大学院生です。はじめに、目的の培養細胞から増殖培地を8ウェルチャンバースライドに吸引する。2マイクロモルアイソフォーム選択蛍光発生プローブまたは非反応性コントロールプローブを添加した無血清培地をウェルあたり500マイクロリットル加えます。スライドを室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、すぐに共焦点顕微鏡イメージングに進みます。10倍の倍率でセルを見つけます。この実験には、FITCチャネルと透過光チャネルが必要です。透過光チャンネルを使用してセルを見つけて焦点を合わせ、実験全体にわたって同じZ平面に焦点を合わせ、バイアスを除去します。レーザー出力とFITCゲインを、コントロールAlDeSense AMサンプルからの信号が最小限に抑えられる適切な設定に調整し、AlDeSense AMサンプルの信号は引き続き表示されます。対応するバーをスライドさせて、各パラメータを調整します。正しいパラメータを識別するために、設定を数回調整する必要がある場合があります。最適化が完了したら、同じパラメーターを使用して、その細胞株内で残りの実験を完了します。1ウェルにつき3枚、処理条件ごとに合計3ウェルの画像をスナップし、画像を保存します。バイアスを避けるために、平面とウェルを切り替える間のみ、透過光チャネルを使用して焦点を合わせるようにしてください。次に、画像処理ソフトウェアを使用して、CZIファイルを異なるチャンネルに分割し、細胞と蛍光細胞の総数をカウントします。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合を決定するために、蛍光細胞の数を各画像中の細胞の総数で割る。交絡変数を避けるために、各画像に対して同じ方法でカウントします。インキュベーター内に維持された細胞を含むT25細胞培養フラスコを取り出す。細胞剥離のためにトリプシンを加え、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。次に、15ミリリットルの遠沈管に細胞をペレット化し、摂氏25度で5分間180Gで遠心分離します。細胞を1ミリリットルの2マイクロモルプローブまたはコントロールプローブ溶液にPBSで再懸濁します。細胞を室温で60分間揺り動かして、色素に均一にさらされるようにします。インキュベーション期間の後、摂氏25度で5分間180Gで遠心分離することにより細胞をペレット化する。次に、細胞を0.5ミリリットルのPBSに再懸濁します。35マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、氷の上に置かれたチューブに細胞を走らせ、フローサイトメーターを詰まらせる可能性のある細胞塊を取り除きます。フローサイトメーター機器の電源を入れ、起動プロトコルを実行します。シース液と空のウエストを確認してください。10%の漂白剤と水でそれぞれ5分間ラインを実行します。次に、品質管理ビーズを実行して、適切な機能を確認します。設定タブで、蛍光フィルターの前方散乱側方散乱とFITCを選択します。グラフの中心付近のメインセル集団の前方散乱領域と側方散乱領域プロットを描画します。次に、シングレットを示す狭い水平バンドの前方散布幅プロットではなく、前方散乱領域を描画します。次に、FITC領域と前方散乱領域プロットを描画して、アイソフォーム選択的蛍光発生ターンオンプローブでソートされた細胞の分布を観察します。次に、FITC面積ヒストグラムを描画して、FITCに基づく集団の変化を観察し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合を決定します。FITCレーザー出力を最適化するには、ヒストグラム曲線の右裾が最大FITCエリア信号に近づくようにプローブでサンプルを実行します。レーザー出力の最適化ステップを複数回繰り返す必要がある場合がありますが、実験の設定が指定されたら、サンプル間でレーザー出力を変更しないでください。続いて、サンプルをふるいに追加し、コントロールプローブで実行します。最大ダイナミックレンジを明らかにするために、ポピュレーションシフトを観察できる必要があります。各サンプルを3連で行われた10, 000カウントに対して実行します。サンプル収集が完了したら、10%漂白剤と水でラインをそれぞれ5分間実行し、機器をシャットダウンします。フローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを処理し、目的の細胞集団を歩きます。長方形のゲート選択を使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陰性歩行を設定し、コントロールプローブサンプルのイベントの99.5%以上がこのゲート内で発生するようにします。残りの細胞はアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性とみなされる。同じゲートをプローブサンプルに適用します。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陰性および1A1陽性と考えられる事象の数を定量した。各細胞株の平均倍率ターンオンを測定し、総アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性を定量化した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合は、レーザー出力およびゲインを同調することによって各細胞株において決定した。コントロールAlDeSense AM処理サンプル中のシグナルを最小化するために、蛍光シグナルをAlDeSense AM処理細胞において最適化した。アルデヒドデヒドロゲナーゼA1A陽性細胞の数をカウントすることにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼA1A陽性細胞の割合を求めた。アイソフォーム選択的蛍光発生プローブの適用により、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞集団を、対照AlDeSense AM処理集団内の最も明るい細胞の上位0.5%をゲーティングすることにより、各細胞株内で定量しました。卵巣癌細胞のパネルの分析により、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合が明らかになりました。得られた癌細胞株の結果から、BG-1は最も低いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性を有し、最も低いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性集団を有すると結論付けることができる。さらに、共焦点イメージングとフローサイトメトリーにより、Caov-3細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合が最も大きいことが明らかになりました。しかし、細胞株の全体的な活性は3番目に高かった。あるいは、OVCAR-3細胞は、3番目に高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性集団を含んでいたが、最も高い全体的な活性を示した。AlDeSenseは、不死化細胞株および患者サンプル中のCSCを同定するための汎用性が高く一般化可能なプローブです。臨床現場での予後予測ツールとして期待しています。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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同系免疫担当宿主において評価された癌幹細胞(CSC)ベース樹状細胞(DC)ワクチンは、異種バルク腫瘍細胞でパルスされた従来のDCワクチンよりも有意に高い抗腫瘍免疫を示した。...

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卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。...

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

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新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

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LncRNAノックダウン骨肉腫細胞の増殖能力を検出するコロニー形成アッセイ

学ぶALDH1A1活性測定法：イソフォーム選択的蛍光プローブを用いて卵巣がん細胞の幹細胞性バイオマーカーを評価する手法。フローサイトメトリーと生細胞イメージングで高感度・高特異的に検出可能。

アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性に基づく卵巣癌細胞の層別化へのAlDeSenseの応用

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