Name: 損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぼう、低酸素損傷PC12細胞を治療するための2種類のハーブ組み合わせ戦略。このシンプルで信頼性の高いin vitroスクリーニング法は、神経細胞保護メカニズムの解明と漢方薬の最適化に貢献します。

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この研究は、四川省科学技術局の主要な研究開発プロジェクト(2020YFS0325)によって資金提供されました。

<ol><li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cerebral+ischemia%2C+and+dizziness%5BTitle%5D)+AND+%22Zhurnal+Nevrologii+i+Psikhiatrii+Imeni+SS+Korsakova%22%5BJournal%5D)">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li>
<li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Integrated+Traditional+and+Western+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li>
<li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Jilin+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li>
<li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method%5BTitle%5D)+AND+%22China+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2%2FHO-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li>
<li>Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> 924(2020).</li>
<li>Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> 1592(2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy%3A+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K%2FAKT%2FBcl-2%2FBAX+pathway+in+human+chondrosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li>
<li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Asarone+ameliorates+%CE%B2-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K%2FAkt%2FNrf2+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955(2021).</li>
<li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Xinjiang+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li>
<li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine+Modern+Distance+Education+of+China%22%5BJournal%5D)">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li>
<li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22China+Journal+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li>
<li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Clinical+Rational+Drug+Use%22%5BJournal%5D)">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li>
<li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hebei+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).</li>
<li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Guangdong+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li>
<li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164(2020).</li>
<li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress%2C+inflammation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619(2019).</li>
<li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K%2FAkt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Armed+Police+Logistics+College+%28Medical+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li>
<li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K%2FAkt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Transmission%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li>
<li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer%27s+disease+and+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo%3A+Involvement+of+dual+PI3K%2FAkt+and+Nrf2%2FHO-1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li>
<li>Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li>
<li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617(2021).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983(2021).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

現代の臨床診療では、脳虚血の治療に理想的な薬がまだ不足しています2。気を補い、血液循環法を活性化するという指導の下で、Ast、Eri、およびその他の製剤は、TCMの臨床診療で組み合わせて使用 され、優れた包括的な利点を達成しています13,14,15。多くの研究により、Astは血液脳関門の透過性を改善し、脳血流を増加させ、神経細胞が低酸素症に耐え、酸素フリーラジカル損傷に抵抗する能力を改善し、神経機能障害を大幅に改善できることが示されています16,17。老人性虚血性脳血管疾患に特に適しています16,17。Eriは血管を拡張し、脳への血液供給を増加させ、ROSを除去し、脂質過酸...

脳低灌流による慢性脳虚血は、中高年に多い疾患です1。長期潜血性疾患として、進行性または持続性の神経機能障害を引き起こす可能性があります。主な病理学的メカニズムには、細胞のアポトーシスおよび酸化的損傷が含まれ、進行性または持続性の神経学的機能障害を引き起こす。これは、アルツハイマー病、血管性認知症、およびその他の疾患の病理学的基盤であり、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします。しかし、現代医学では慢性脳虚血を治療するための理想的な薬がまだ不足しています2。同時に、 レン ゲ(Ast)と エリジェロンブレビスカプス (Eri)の組み合わせは、伝統的な漢方薬(TCM)の臨床診療で広く使用されています4。併用戦略は、脳虚血後の神経機能の回復を促進する上で著しく改善されており、これは単一の薬剤よりも優れています。しかしながら、2つの薬剤の組み合わせでは投与比に大きな違いがある4。有効な成分と作用機序は明確に定義されておらず、これが臨床応用を制限する重要な問題です。
以前の研究では、ラットの脳虚血の治療におけるAst注射とEri注射の製剤の組み合わせの相乗効果が実証されています。p-Aktタンパク質の発現をアップレギュレートし、Bリンパ芽腫2(Bcl-2)ファミリータンパク質の一つであり、アポトーシスを促進する効果を有するBcl-2関連死プロモーター(BAD)タンパク質5,6の発現をダウンレギュレートすることができる。しかし、その相乗効果の物質的根拠とメカニズムは明らかではありません。また、CoCl2複合グルコースフリー培地を用いてPC12細胞の傷害モデルを確立し、AstとEriにおける最適な成分の組み合わせをスクリーニングし、定義した7。
この研究では、AstとEriの有効用量を損傷したPC12細胞モデルを使用してスクリーニングします。2つの薬剤の最適な組み合わせは、均質設計法と組み合わせたこのモデルを使用してスクリーニングされます。細胞モデルは、損傷したPC12細胞における調製の組み合わせと成分の組み合わせの効果とメカニズムの違いをさらに評価するために使用されます。この戦略は、損傷したPC12細胞に対する2種類の組み合わせの保護効果と調節メカニズムをPI3K / Akt / Nrf2シグナル経路を介して調査し、最良の組み合わせモードを決定することを目的としています。この調査は、TCMの最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。

<table><tbody><tr><td>1300シリーズクラスIIバイオセーフティキャビネット</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>カンパニー1374</td><td></td></tr><tr><td>3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド</td>広<td>州saiguoバイオテクノロジー</td><td>カンパニー1334GR001</td><td></td></tr><tr><td>MTT ACEA NovoExpress&nbsp;1.4.0</td><td>ACEA Biosciences,</td> <td>Inc-Akt</td><td></td></tr> <tr><td>Wuhan</td><td>Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>10176-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>分析フローサイトメトリー</td><td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td><td>62-2-1810-1027-0</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>C1062L</td><td></td></tr><tr><td>Astragalus injection</td><td>Heilongjiang Zhenbaoアイランドファーマシューティカルカンパニー</td><td>A03190612144</td><td>アストインジェクション</td></tr><tr><td>アストラガロシドA</td><td>重慶ガオレンバイオテクノロジー</td><td>カンパニー84687-43-4</td><td></td></tr><tr><td>Bax</td><td>武漢スリーイーグルスプロテインテックグループ、株式会社</td><td>60267-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>BCAタンパク質定量キット</td><td>Beyotimeバイオテクノロジー会社</td><td>P0012</td><td></td></tr><tr><td>BCL-2</td><td>武漢スリーイーグルスプロテインテックグループ株式会社</td><td>26593-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックインスツルメンツカンパニー</td><td>0816-2014</td><td></td></tr><tr><td>カスパーゼ-3</td><td>武漢スリーイーグルス プロテインテックグループ株式会社</td><td>19677-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>クロロゲン酸</td><td>重慶高レンバイオテクノロジーカンパニー</td><td>327-97-9</td><td></td></tr><tr><td>塩化コバルト六水和物</td><td>メルクバイオテクノロジー株式会社</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td>広<td>州saiguoバイオテクノロジー会社</td><td>2020112701</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>二ナトリウムリン酸二ナトリウムdodecahydrate</td><td>成都Kolon化学会社</td><td>2020090101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖媒体</td><td>サーモサイエンティフィックHyclone</td><td>2110050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM無糖媒体</td><td>北京Solarbioライフサイエンス会社</td><td></td><td></td>2029548</tr><tr><td>ECL 発光流体</td><td>Lianshuo Biological Company</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>電子天秤</td><td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,</td><td>China FA1204</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動装置</td><td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td><td>1658026</td><td></td></tr><tr><td>Erigeron breviscapus capsule</td><td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td><td>Z53021671</td><td>Eri capsule Fetal</td></tr><tr><td>Uvine serum</td><td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td><td>20210402</td><td>FBS</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Olympms Corporation</td><td>IX71-F32PH</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージャー</td><td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse secondary antibody</td><td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td><td>.SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ二次抗体</td><td>武漢スリーイーグルス Proteintech Group, Inc</td><td>SA00001- 2</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td><td>International Business Machines Corporation, USA-ImageJ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.8.0</td><td>National Institutes of Health, USA-imaging</td><td></td> <td>software</td></tr><tr><td>Immunol&nbsp;蛍光&nbsp;染色キット</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2021070901</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marker Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td><td></td><td></td>HH35L2018296</tr><tr><td>Motic 倒立顕微鏡</td><td>Nanda Scientific Instruments Co.</td><td></td><td></td>AE2000LED</tr><tr><td>NaCl</td><td>成都Kolon化学会社</td><td>2014081301</td><td></td></tr><tr><td>無脂肪牛乳</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0216</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2</td><td>武漢スリーイーグルス プロテインテックグループ株式会社</td><td>16396-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>P-Akt</td><td>武漢スリーイーグルス プロテインテックグループ株式会社</td><td>66444-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>PC12細胞</td><td>中国科学院</td><td></td><td></td>CBP60430</tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>サーモサイエンティフィック ハイクロン</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ プロテアーゼ阻害剤混合物</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P1045</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>Chengdu Kolon Chemical Company</td><td>2015082901</td><td></td></tr><tr><td>活性酸素種アッセイキット</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>RI-PA溶解液</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>Scutellarin</td><td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td><td>27740-01-8</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGEサンプルローディングバッファー、5x</td><td>Beyotime Biotechnology Company</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターチップ(0.22 &micro;m)</td><td>メルク・バイオテクノロジー・インク</td><td></td><td></td>SLGP033RB</tr><tr><td>トリスベース</td><td>広州西国生物科技会社</td><td>1115GR500&nbsp;</td><td>TBS系</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>サーモサイエンティフィックHyclone</td><td>J190013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>成都Kolon化学会社</td><td>2021051301</td><td></td></tr><tr><td>渦発振器</td><td>OHAUSインターナショナル株式会社、上海、中国</td><td>VXMNAL</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-アクチン</td><td>武漢スリーイーグルスプロテインテックグループ、株式会社</td><td>66009-1-IG</td><td></td></tr></tbody></table>

損傷したpc12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略の探索

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

脳虚血の治療における伝統的な漢方薬(TCM)の組み合わせの利点を考慮して、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を探索するために、製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムの違いを研究しました。グルコースフリー培地と組み合わせた塩化コバルト(CoCl2)は、PC12細胞の酸化的損傷を誘発するために使用されました。次に、 レン ゲ(Ast)注射と エリジェロンブレビスカプス (Eri)注射の最適な組み合わせを選択し、PC12細胞に対する安全で効果的な濃度をスクリーニングした後、統一された設計方法に従って組み合わせました。さらに、スクリーニングされた成分の組み合わせは、2つのハーブに10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸を含みます。次に、MTT、アネキシンV-FITC/PI、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析を使用して、損傷したPC12細胞に対する製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムを評価しました。結果は、細胞生存促進のための最適な調製の組み合わせが、濃度6:1.8(μM)のAst注射とEriカプセルであることを示しました。成分の組み合わせ(10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)は、製剤の組み合わせよりも効果的でした。どちらの組み合わせも、アポトーシス速度、カスパーゼ-3の蛍光強度、および細胞内活性酸素種(ROS)レベルを著しく低下させました。一方、彼らはp-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、およびNrf2の発現レベルをアップレギュレートしました。これらの効果は、コンポーネントの組み合わせでより明白でした。結論として、両方の組み合わせは、PC12細胞上のグルコースフリー培地と組み合わせたCoCl2 によって誘発される傷害を阻害し、したがって細胞の生存を促進することができる。ただし、調製の組み合わせに対する成分の組み合わせの効率は、酸化ストレスとアポトーシスに関連するPI3K / Akt / Nrf2シグナル伝達経路のより強力な制御による可能性があります。

Ast注射とEriカプセルの最適な組み合わせのスクリーニングを図1に示す。正常PC12細胞に対するAst注射およびエリカプセルの細胞生存率を図1Aに示す。細胞生存率は、12 μMを超える濃度のAst注射(図1A)および5 μMを超える濃度のEriカプセル(図1A)で95%未満であり、最大非毒性濃度がそれぞれ12 μMおよび5 μMであることを示しています。それらの細胞毒性は、単独で使用されたアストラガロシドAおよびスクテラリンのそれよりも大きかった。CoCl2によって誘導された損傷したPC12細胞に対するAst注射およびEriカプセルの生存率を図1B、Cに示す。モデル群と比較して、Ast注射は6〜12μM(p &lt; 0.05またはp &lt; 0.01)の濃度範囲で損傷したPC12細...

このプロトコルは、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を提供します。このプロトコルは、漢方薬(TCM)の最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。

損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略の探索

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

この研究のプロトコルは、低酸素症で損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略と、ハーブの最良の組み合わせモードを最適化するためのリファレンスを提供します。この技術は、低酸素細胞に対して、ハーブからの有効な成分の組み合わせをスクリーニングするための、簡単で信頼性が高く、効率的なin vitro実験方法を提供できます。この戦略は、他のハーブ調製物の組み合わせからの低酸素細胞に対する成分の組み合わせをスクリーニングし、それらの保護メカニズムを説明するためにも適用できます。まず、PC12細胞を5%二酸化炭素を添加したインキュベーターで摂氏37度で2〜3日ごとに継代培養し、その後のすべての実験で4〜8の継代を取得します。70〜80%コンフルエントなPC12細胞を1ミリリットルの0.25%トリプシンで処理し、細胞剥離について顕微鏡下で観察します。次に、3ミリリットルの完全培地を加えてトリプシン消化を停止します。移した細胞を15ミリリットルの遠沈管で840 x gで5分間スピンダウンします。上清を廃棄した後、細胞ペレットを完全培地で再懸濁し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞をカウントするには、フローサイトメトリーソフトウェアを起動し、カウント設定で細胞溶液の対応する希釈倍数を選択します。細胞サンプルをロードした後、密度チャートをクリックします。細胞集団を x 軸と y 軸から離して丸で囲みます。図の下のデータ テーブルを右クリックし、[X]、[Y]、[カウント]、および [腹筋] を選択します。カウント: Abs.Count のデータ テーブルの下にあるセル カウント結果を取得します。完全培地で細胞濃度を1ミリリットルあたり10〜5細胞分の約1倍に調整した後、1ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートに加え、摂氏37度、5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。翌日、上清廃棄プレートに1ミリリットル当たり1ミリグラムのMTT溶液を各ウェルに120マイクロリットル加え、摂氏37度で4時間インキュベートする。インキュベーション後、上清が廃棄されたら、各ウェルに150マイクロリットルのDMSOを追加します。プレートをボルテックスオシレーターで10分間、毎分240回の速度で振とうしたままにします。次に、マイクロプレートリーダーで490ナノメートルの吸光度を測定します。均質な設計法によって薬物の最適な組み合わせをスクリーニングするには、前述のように細胞を培養し、損傷したPC12細胞を6つの異なる比率濃度のレンゲ注射とブレビスカプスカプセルで処理します。2つの最適な組み合わせの保護効果を評価するには、損傷したPC12細胞を2種類の薬物の組み合わせで治療します。細胞を24時間インキュベートし、前に示したように細胞生存率を計算します。PC12細胞を12ウェルプレートに播種し、摂氏37度で24時間インキュベートします。薬物処理後、細胞をウェルあたり250マイクロリットルのトリプシンで処理し、細胞を840 x gで室温で5分間遠心分離します。次いで、細胞ペレットを500マイクロリットルの結合緩衝液で再懸濁する。各グループのアネキシンV-FITC5マイクロリットル、ヨウ化プロピジウム10マイクロリットルをトリプリケートで加え、暗所で室温で15分間インキュベートして、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスを確認します。フローサイトメーターソフトウェアで、[スタート]メニューの[自動補正]をクリックし、[チャンネルの選択]で[FITC]、[PE]、[PERCP]、および[APC]を選択し、[高さでの補正]を選択します。次に、統計項目:中央値でOKをクリックします。[密度マップ] をクリックし、前に示した細胞カウント方法で有効細胞集団を丸で囲みます。FITC蛍光をx軸パラメータとして、その他の蛍光をy軸パラメータとして使用して、密度マップを作成します。[スタート]メニューの[補正マトリックス]をクリックし、オーバーフローマトリックスの[係数]をクリックします。PC12細胞を24ウェルプレートウェルに置かれたカバーガラスに三重に播種し、摂氏37度で24時間インキュベートします。薬物処理後、カバーガラスをPBSでそれぞれ5分間2回すすぎ、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.5%Triton X-100で室温で20分間透過処理します。細胞をすすいだ後、室温で1時間10%ヤギ血清でそれらをブロックします。200マイクロリットルの希釈一次抗体カスパーゼ-3を各カバーガラスに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、TBSTバッファーでそれぞれ3分間3回洗浄し、200マイクロリットルの二次抗体とともに室温、暗所で1時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーガラスをDAPI1ミリリットルあたり0.5マイクログラムの300マイクロリットルで10分間インキュベートし、細胞をTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。カバーガラス画像を蛍光顕微鏡で撮影し、イメージングソフトウェアで蛍光強度を統計的に解析します。薬物処理したPC12細胞カバーガラスをPBSでそれぞれ3分間3回洗浄し、400マイクロリットルの10マイクロモルジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテートを摂氏37度で20分間インキュベートします。無血清DMEMで細胞を2回、それぞれ3分間再度洗浄します。蛍光消光剤を添加し、すぐに蛍光顕微鏡でカバーガラス画像をキャプチャして、イメージングソフトウェアで相対蛍光強度を計算します。薬物処理したPC12細胞を6ウェルプレートでPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、ウェルあたり100マイクロリットルの調製溶解バッファー中で氷上で30分間インキュベートします。溶解後、細胞を摂氏4度で20分間16, 000 x gで遠心分離し、上清を回収します。ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を検出した後、各レーンに25マイクログラムのタンパク質を含む12%SDS-PAGE電気泳動を実行し、ゲルをPVDFメンブレンに移します。メンブレンを5%無脂肪乳で室温で1.5時間ブロックし、5ミリリットルの対応する一次抗体とともに摂氏4度で24時間インキュベートします。メンブレンをTBSTで3回、それぞれ10分間インキュベートおよび洗浄した後、5ミリリットルの二次HRP結合抗体とともに室温で2時間インキュベートします。最後に、TBST洗浄メンブレンに、製造元の指示に従ってタンパク質バンド検出用の化学発光HRP基質を追加します。次に、化学発光イメージングシステムを使用して画像をキャプチャし、ベータアクチンを内部コントロールとしてタンパク質のグレー値を定量します。正常なPC12細胞の細胞生存率は、レンゲを12マイクロモルを超える濃度で注射すると95%未満であり、ブレビスカプスカプセルでは5マイクロモルを超えました。.レンゲ注射は、6〜12マイクロモルの濃度範囲で損傷したPC12細胞の生存率を改善し、2〜5マイクロモルでブレビスカプスカプセルを改善する可能性があります。一方、6〜1.8マイクロモルの比率での薬物の組み合わせは、最も高い細胞生存率を示した。損傷したPC12細胞に対する2つの組み合わせの細胞生存率は有意に促進され、成分の組み合わせは調製の組み合わせよりも優れていました。アポトーシス率は、初期、後期、および総アポトーシス細胞の割合が正常群よりもモデル群で有意に高いことを示しました。モデル群と比較して、各段階のアポトーシス細胞の割合は、治療群で有意に低かった。カスパーゼ-3の蛍光強度は、モデル群と比較して各処理群で有意に低く、成分併用群では比較的低かった。Akt遺伝子、Bcl-2遺伝子、Bax遺伝子の相対発現により、細胞生存の促進において成分の組み合わせが製剤の組み合わせよりも優れていることが明らかになり、より強い抗アポトーシス効果に関連しています。成分併用は、製剤併用よりも優れた抗酸化損傷効果を示し、Nrf2タンパク質の発現が有意に高かった。この方法は、抗炎症、抗菌など、ハーブの組み合わせから他の潜在的な薬理学的活性との成分の組み合わせをスクリーニングおよび評価するために使用できます。

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損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略の探索

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