Name: 生理学的または子宮頸部の文脈における常在細胞間のダイナミクスと相互作用を調査するためのヒト骨髄3Dモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぼう、ヒト骨髄の3Dマイクロ生理学的システム構築法。血管系と間葉系細胞を統合し、イメージングと分子解析で細胞動態を評価できる標準化モデルです。創薬研究や病態モデリングに応用可能です。

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CRCLサイトメトリープラットフォームのP.バティストンモンターニュとA.ジャンボン、レオンベラールセンターのトランスレーショナルリサーチアンドイノベーション部門の研究病理学プラットフォームのN.ガドットとC.レネーブに感謝します。著者は英語版のB.マンシップに感謝しています。この作業は、InsermとFI-LMCからV.M.S.に資金提供され、S.L.K.A.とL.B.はSociétéFrançaise d'Hématologieからの助成金によって支援されました。

注:骨髄様骨格構造を調製するために、このプロトコルは、二相性リン酸カルシウム(BCP)ビーズ上のHMEC-1内皮細胞およびHS27A間質細胞とビーズを組み合わせることに依存しています。BCPビーズは、特定の媒体で3D構造の形成を可能にする足場として機能します。
1.ビーズの準備と滅菌
<ol><li>各インサート(底部にポリカーボネート膜を備えた小さな円筒形のプラスチック皿)ごとに35〜40 mgのBCPビーズ(HA / β-TCP 60/40、45〜75 μm)を1.5 mLチューブで計量します( 材料の表を参照)。ビーズの重量を量った後、オートクレーブサイクル(121°Cで60分間)中に蓋が飛び出さないように、1.5 mLチューブの上部にきれいな針で小さな穴を開け、閉じた滅菌ボックスにチューブを垂直に置きます。</li>
</ol>2.3D滅菌フードの下で製剤を挿入します
<ol><li>滅菌ポリカーボネート細胞培養インサートを6ウェルプレートのウェル内に置きます。滅菌BCPビーズを1.5 mLチューブからインサートに注ぎます。インサート内に350 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を滴下してビーズを注意深く洗浄し、4.5 mLの1x PBSをウェルに追加します。PBSを取り出し、真空または5 mLピペットを使用してチップをウェルの隅に置いて廃棄します。洗浄手順を2回繰り返します。</li>
	<li>ビーズを洗浄したら、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1x PBSを使用してシステムをブロックします。ブロッキング溶液350 μLをインサートに、4.5 mLをウェルに注意深く加え、プレート全体を37°C、5%CO2 のインキュベーターに一晩置きます。 注:手順2.1および2.2は、細胞播種前のBCPビーズからのイオン放出を最小限に抑えるのに役立ちます。</li>
</ol>3. 細胞株採取と3D維持
注:このインキュベーションステップの後、微小環境細胞を加えて3D構造骨格を形成します。このシステムは、固体BM様構造を形成する能力と内皮細胞の含有との適合性により、SV40からの大きなT抗原で不死化されたヒト微小血管内皮細胞であるHMEC-1と、ヒトパピローマウイルスで不死化されたヒト骨髄間質細胞であるHS27Aの使用に基づいています。
<ol><li>細胞をシステムに加える前に、以下のインキュベーション培地を準備してください。<ol><li>50 mLの完全骨分化培地(ODM)に対して、45 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+ 5 mLのFBS + 0.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン+ 8 × 10-4 mg / Lのデキサメタゾン+ 2.16 g / Lのベータグリセロリン酸+ 44 mg / Lのアスコルビン酸を混合します。</li>
		<li>50 mLの完全HMEC-1培地に対して、45 mLのMCDB 131 + 5 mLのFBS + 0.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン+ 1%のグルタミン代替物+ 1 mg / Lのヒドロコルチゾン+ 10 μg / LのEGFを混合します。.</li>
	</ol></li>
	<li>システムからブロッキングソリューションを削除します。1 × 106 HMEC-1細胞(血管コンパートメントを表す)と2 × 106 HS27A細胞(間葉系間質細胞コンパートメントを表す)を15 mLチューブで混合し、室温で1,575 × g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、175 μLのHMEC-1培地(HMEC-1細胞増殖のための特異的培地)と175 μLのODM(HS27A骨分化のための特異的培地)を加えます。</li>
	<li>各インサート内に合計3×10個の細胞を含むこの懸濁液を350 μL注ぎます。次に、細胞を含まない4.5 mLの混合培地(2.25 mLのHMEC-1培地+ 2.25 mLのODM)をプレートのウェルに注ぎます。混合物を穏やかに吸引し、1 mLマイクロピペットで数回分注して、インサート内の細胞とBCPビーズを均質化します。インサートの下部に落ち着くようにミックス全体を割り当てます。 注:複数のインサートを培養する場合は、デッドボリュームが1つのミックス調製をお勧めします。たとえば、4 つのインサートを培養する場合は、常に 5 つのインサートに必要なボリュームを準備します。</li>
	<li>内皮細胞と間葉系細胞がインサート内でホモジナイズされたら、6ウェルプレートをインキュベーター内で37°C、5%CO2 で3週間保持します。インサート内の培地とウェルを週に2回交換するには、1 mLのマイクロピペットを使用してインサートから培地を慎重に取り出し、チップをインサートの内側の壁に配置して、インサートの角を乱さないようにします。 注:回収された上清は、後でタンパク質を定量するために、任意のステップで-80°Cで保存できます。</li>
</ol>4.関心のあるセルのシステムへの追加
注:HMEC-1およびHS27A培養の3週間後、HS27A細胞の骨分化によりシステムの剛性が可能になりました。このステップでは、インサート内に目的の血液学的細胞を追加します(追加される細胞の数は、1×104 から1×106まで変化し得る)。追加された細胞は、 BCR-ABL 癌遺伝子を導入したTF1細胞と、急性骨髄性白血病患者または健康なドナーのいずれかに由来する初代単核CD34+ 細胞でした。
<ol><li>ODM化合物は血液細胞に対して毒性があり、システムの硬直化が完了したら添加を続ける必要がないため、このステップで培地組成を変更してください。たとえば、造血の維持をサポートするには、造血細胞株(10%のFBSと1%のペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI)または初代造血細胞をIMDMに置き換えます。3D培地(週2回)の変更用に、50%完了したHMEC-1培地と50%完了したRPMI/IMDM培地のバッチを準備します。</li>
	<li>目的の血液細胞をこのコンビネーション培地に再懸濁し、インサート内に追加します。薬物治療プロトコルが必要な場合は、目的の細胞を追加してから24時間待ってから治療し、骨のような構造に接着する時間を与えます。</li>
	<li>要件に応じて3D細胞培養の期間を調整します。培地(50%HMEC-1完全培地+ 50%RPMI完全培地)を週に2回リフレッシュします。 注:3D細胞培養の過程で、一部の接着細胞がインサートの外側からウェルの底に漏れ、培地消費量が増加する可能性があります。インサートを超えた細胞分散がないか顕微鏡で確認し、必要に応じて滅菌フードの下の新しい6ウェルプレートにインサートを交換します。</li>
</ol>5.3D骨髄様実験結果
注:3D培養後、実験の目的に応じていくつかの結果を得ることができます。
<ol><li>タンパク質分析 注:3D実験の過程で、骨髄様構造に存在する細胞によって分泌されるタンパク質を収集して、さらなる分析を行うことができます。<ol><li>培養液を週2回交換する場合は、インサート内から取り出した上清を-80°Cで保存し、系内で目的のタンパク質の産生を評価します。</li>
	</ol></li>
	<li>3D構造からの細胞の解離(細胞を選別する必要がある場合は滅菌フードの下) 注:3D骨髄様システムで培養された細胞は、検索、選別、およびさらなる分析が可能です。<ol><li>実験の最後に、15 mLチューブで、4.5 mLのRPMIと0.4 mg/mLのコラゲナーゼを添加した0.5 mLのFBSを混合し、溶液を37°Cで10分間温めます。</li>
		<li>インサートを逆さま(白いメンブレン側を上に)滅菌済みの6ウェルプレートカバーに置き、メンブレンを適切に切り取ります。滅菌メスを使用して膜を側面から切断し、白い固体ディスクを取り出します。手順5.2.1で準備した温かい15mLチューブの中にディスクを置きます。</li>
		<li>チューブを37°Cのインキュベーター内のアクティブホイールに入れ、10分間インキュベートして消化します(コラゲナーゼと接触)。すべてのメンブレンに同じインキュベーション時間を適用して、歪んだ分析を回避します。</li>
		<li>10分後、15 mLチューブを室温で1,575 × g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを5 mLの温かい1x PBSに再懸濁します。注:このステップでは、ポリカーボネート膜は通常上清画分に浮遊するため、滅菌ピペットチップを使用して廃棄できます。膜がまだペレットに含まれている場合は、そのままにして、次のステップの最後に取り除きます。</li>
		<li>ペレットを300 μLの温かいトリプシンに再懸濁し、チューブを10秒間ボルテックスし、37°Cの水浴に1分間入れます。</li>
		<li>1 mLの温かい純粋なFBSを加えて酵素消化を停止します。1 mLマイクロピペットを使用して、培地を機械的に吸引して分注し、ディスクを完全に解離させます。 注意: 吸引/分注ステップは非常に速くなければなりません、さもなければビーズは先端の中に沈殿します。</li>
		<li>チューブを1,575 × gで5分間遠心分離します。ペレットを10%FBSを添加した1x PBSの3 mLに再懸濁します。</li>
		<li>ビーズを5秒間沈殿させてから上清を採取し、収集チューブに置いた35 μmのセルストレーナーでろ過します。回収したろ液を1,575 × gで5分間遠心分離します。トリパンブルーで細胞をカウントして生存率を評価し、フローサイトメトリー分析に進みます。 注:トリパンブルーインキュベーション後に回収される生細胞の数は、消化されたインサートごとに~1-2×105 細胞です。</li>
	</ol></li>
	<li>検索した細胞のフローサイトメトリー標識 注:3D骨髄様構造から回収された細胞は、フローサイトメトリーによって標識し、さらに分析することができます。抗体を組み合わせて使用し、3D解離後のさまざまなコンパートメントを検出します。ここでは、CD45(目的の血液学的細胞を染色する)、CD31(血管区画を染色する)、およびCD73(骨芽細胞コンパートメントを染色する)を、50μLのPBS+2%FBS中に1μLで使用した。準備したすべての細胞と抗体を、プロセス全体を通して光から離して氷上(4°C)に保管してください。<ol><li>ペレットを抗体ミックスに再懸濁し、光を避けて氷上で30〜40分間インキュベートします。</li>
		<li>1 mLのPBS + 2%FBSを加えて細胞を洗浄し、1,575 × gで5分間遠心分離します。</li>
		<li>回収したペレットを、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1:2,000希釈)を添加した1x PBS + 10%FBSの200 μLに再懸濁します。</li>
		<li>次のパラメータを使用してサイトメーターでチューブを分析します: FSC 297 PnV;SSC 220 PnV;ダピ 400 PnV;CD45 APC 505 PnV.FSC-H対FSC-Wグラフプロットを使用して、一重項母集団をゲートします。一重項画分では、DAPI-A対FSC-Aのグラフプロットを使用して、生細胞集団(DAPI陰性)を決定します。DAPI陰性集団を以前にゲートした状態で、APC-A対FSC-Aグラフプロットを使用して、CD45陽性集団を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>3次元骨髄様構造の固定 注:3D BM様構造の固定は、一般に、免疫組織化学または免疫蛍光法のために行われ、細胞を in situで 視覚化し、さらに特異的に染色します。<ol><li>BM様構造を固定するには、インサート(ステップ4.3)を古いプレートから1x PBSで満たされた新しい6ウェルプレートに移します。次に、インサート内の培地を1x PBSで慎重に交換します。 注意: 形成された構造をPBSで洗い流さないでください。液体の圧力は3D構造を損なう可能性があります。</li>
		<li>インサートを洗浄したら、新しい6ウェルプレートに入れ、ウェルとインサートの両方に開封したてのパラホルムアルデヒド(PFA)4%(1x PBSで16%希釈)を充填します。</li>
		<li>固定プロセスを光から離れた室温で4時間進めます。</li>
		<li>固定プロセスの最後に、インサートを1x PBSで1回洗浄し、光を避けて4°Cで保管します。</li>
		<li>手順5.2.2の説明に従って、インサートの下部にあるメンブレンをカットして、ソリッドディスクを取り出します。</li>
		<li>構造を脱灰するために、EDTA(0.5 M、pH 8)中でディスクを48時間インキュベートします。</li>
		<li>構造をパラフィンに埋め込み、厚さ4μmの切片をスライスします。</li>
		<li>自動免疫染色剤を使用して、抗CD45、抗CD73、およびKi67抗体で切片をインキュベートします。抗ウサギまたはマウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)および発色基質としての3,3'-ジアミノベンジジンによる染色を視覚化し、ギルヘマトキシリンで対比染色します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は競合する利益を宣言しません。

人間の生理学的および関連する病理学的問題に関する研究が直面している現在の課題の1つは、人間の臓器の複雑な機能を正確に模倣するモデルがないことです。ヒトBM 3Dモデルの場合、多くのモデルはヒドロゲルを使用し、BMを部分的に再現し、例えば、より良い骨芽細胞分化を確実にする上で、古典的な2D培養と比較した3D培養条件の力を示しています27,28。それにもかかわらず、優れた再現性と使いやすさにもかかわらず、これらのシステムは人間のBM 3D構造とアーキテクチャを模倣していないため、さらなる分析に大きな影響を与える可能性があります。技術の進歩により、科学者は、灌流ベースのバイオリアクターシステムを使用して、いくつかのHSC特性を維持しながら、ネイティブのヒト骨芽細胞ニッチ環境をよりよく再現できるようになりました29。マイクロ流体デバイスの開発は、関連する骨髄様構造を再現するための新しいアプローチをもたらしたが、これまでのところ骨髄の限られた特徴しか達成していないため、用途が制限されている30,31,32,33。
材料科学の進歩は、関連する3D骨培養システムの開発に使用できる幅広い天然または合成生体材料の開発に貢献しています。しかし、このようなシステムは、生物物理学の社内スキルを持たない標準的な生物学研究所では開発が困難な場合があります。さらに、ほとんどの場合、これらのシステムは、BM微小環境を含むヒト骨の3D構造を模倣する限られた能力を達成し、大量のサイトカインおよび成長因子を使用して、人工的に豊富な培養培地34を作り出している。
脂肪細胞分化ではなく骨芽細胞分化を誘導するという選択は、前骨芽細胞および骨芽細胞が内骨ニッチの一部として記載されているという事実に基づいていた35。これにより、骨芽細胞が骨と骨髄の両方の要求された成分として特定されました。骨髄の細胞成分の中で、内皮細胞および間質細胞が微小環境の大部分を占める。さらに、これら2つの細胞型は、恒常性および分化の制御に関与する細胞外マトリックスおよびサイトカインの構造的非細胞成分を産生し、石灰化構造を生成するためにここで要求される。したがって、これは内皮細胞と間質細胞の使用、およびラボ間の容易なアクセスと再現性の向上を可能にする細胞株の選択を正当化します。HMEC-1株の培養は時間の経過とともにより安定しているため、この細胞株は3Dシステムの開発のために保持されました。間質細胞について、正常骨髄由来の間質細胞株の骨芽細胞分化能を2D培養で比較した:HS5およびHS27A。HS5株は、どちらの細胞株でも生成された3DシステムのHS27A株ほど分化しないことがわかりました。これに関して、HS27A細胞をHS5系統で置き換えようとする試みは、より剛性の低い構造の生成をもたらし、HS27Aがより適していることを示唆している。
HS27A細胞株とHMEC-1細胞株の両方を異なる培地の組み合わせで培養し、細胞外マトリックスの産生が基本構造に相対的な剛性をもたらすように、骨芽細胞構造に沿ってHMEC-1の最良の剛性構造と整列を引き出しました。D14での分化の進行を解析したところ、D21(BSP、後期骨芽細胞マーカーの測定)では分化が進み、HMEC-1:HS27Aの比率は1:2で、2×106 HS27Aを導入した場合により良い結果が得られました。内皮細胞はまた、恒常性および分化を調節する上で重要な役割を果たす(とりわけ、サイトカインの供給を通じて)。HMEC-1細胞がこのシステムで維持されているという事実は、それらが少なくともこの役割を果たすことができることを示しており、これは我々のモデルの正当性に寄与する。HMEC-1内皮ラインについては、構造に適切に統合できるように、またこれらの細胞が構造内にアライメントまたはチューブを形成できることを期待して、十分に早期に導入することが重要でした。HS27AおよびHMEC-1の共培養試験は、後者を異なる段階で導入することによって実施した:D0、D7、D14;間質細胞の分化においても、内皮細胞の維持または位置決めにおいても、顕著な差は観察されなかった。したがって、これらの細胞はプロセスの開始時に導入された。造血細胞は、骨芽細胞の分化が細胞間相互作用を促進するのに十分に進行する時期に導入されました。この選択はまた、この骨芽細胞分化が培地の使用によって条件付けられるという事実によって条件付けられたが、それは我々の試験によれば、造血細胞の維持を完全には支持しない。血液学的細胞は、細胞株または初代BM CD45造血細胞のいずれかであり得る。
この3Dモデルから、各細胞タイプを正常または病理学的の初代細胞に置き換えること、または免疫細胞、脂肪細胞、線維芽細胞などの生体模倣特性を高めるために他の細胞タイプを追加することを想定できます26。実際、HS27A細胞株は、継代の低い初代BM MSCに置き換えられています。同様に、血液細胞株を初代BM造血細胞に置換した。しかしながら、初代内皮細胞によるHMEC-1細胞の置換はまだ試験されていない。現在、内皮細胞が存在し、微小環境からの他の細胞(例えば、造血細胞)と正しく相互作用するにもかかわらず、それらは構造化された血管を形成しないため、機能的な血管を模倣するためのフロー灌流を妨げるため、このモデルは血管系表現の観点からまだ改善される可能性があります。全体として、これにより、現在の最小限の3Dモデルの複雑さと代表性が徐々に増加する可能性があります。他の細胞型を追加することで、局所的なBM炎症や免疫療法に対する耐性の重要性など、他の問題を調査する研究が容易になる可能性があります。
しかし、この3Dシステムは、目的の細胞、血液細胞、または上皮癌細胞が評価されれば、3週間前に、添加することができる。週に2回培地を交換すると培地が汚染される可能性があるため、無菌状態を維持する必要があります。さらに、一部の細胞はインサートの細孔を通って移動し、ウェルに分散し始め、培地消費量の増加につながる可能性があるため、定期的なモニタリングが推奨されます。
ここでは、骨芽細胞分化を可能にする3D足場について説明し、関連する in vitroの 3DヒトBM様微小環境を開発しました。このシステムは、 in situ 分析と究極の生細胞回収を可能にします。このシステムは、再現性とユーザーフレンドリーな新しい柔軟性の高いツールを提供し、人間のBM微小環境内の相互作用とメカニズムを研究するための幅広いアプリケーションを提供します。

骨髄(BM)は、軸骨と長骨の中心空洞と小柱扁平骨の両方に見られ、さまざまな異なる細胞成分と非細胞成分を含んでいます。構造レベルでは、造血組織の島(「ヘマトン」とも呼ばれます)1,2と、線維柱帯内に点在する血管洞に囲まれた脂肪細胞で構成されています3。長骨および平坦骨では、骨および骨髄への血液供給は、血管4の骨内ネットワークを介して相互接続されている。この固体保護ネットワークに隠れているBMは、海綿状間質に浸された非常に未熟な細胞を宿主とし、常在間葉系幹細胞(MSC)と造血幹細胞(HSC)の分化場所を構成します5。実際、骨芽細胞の産生による骨組織の再生は別として、BMの主な既知の機能の1つは造血発達にあります6。
BM造血組織には、さまざまな細胞型、すなわちHSC、前駆体、およびリンパ球、好中球、赤血球、顆粒球、単球、および血小板などのより分化した血液細胞が含まれます7。造血細胞はBM空間にランダムに配置されているのではなく、異なる起源の多くの細胞型(骨芽細胞、破骨細胞、MSC、脂肪細胞、類洞内皮および血管周囲間質細胞、免疫細胞、神経細胞、および明確な成熟造血細胞)を含む造血ニッチ内の特定の組織を示し、正常な造血を確実にするために複雑な構造を形成します8.造血ニッチの生物学的機能には、HSC生存の調節、接着、静止、ホーミング、および複数の生理学的または非生理学的ストレスに応答したさまざまなメカニズム(細胞間および細胞マトリックス相互作用、可溶性因子の産生、低酸素症)を介した分化が含まれます3,6。これらの造血ニッチは当初は均質な実体として認識されていましたが、シングルセル解析やイメージング解析などの技術的進歩により、その複雑さ、ダイナミクス、および適応特性が徐々に明らかになりました9,10,11。
人間の生理学的および病理学的プロセスを解読するための動物の使用を置き換え、削減するという決定的な必要性は、新しい機会と課題につながります11,12。新たに記載されたインビトロツールの中で、古典的な2次元(2D)培養物よりもインビボヒトBMをよりよく模倣する3次元(3D)モデル13、14、15、16、17が提案されている。したがって、3Dモデリングは、in vivoで発生するものに近い、細胞間および細胞マトリックスの相互作用を観察するための有望なアプローチであるように思われます。これらのさまざまなモデルを使用して、いくつかのチームはHSCの生存と増殖を実証しました18,19。いくつかの3Dモデルが利用可能であり、最も一般的なアプローチは、骨芽細胞系譜分化能力を利用するMSCに関連する、ヒドロゲル、コロイド、またはコラーゲンなどの足場ベースの3D生体材料の使用である20、21、22。それにもかかわらず、特にこれらの現在の3Dシステムは主に初代間質細胞に依存しているため、ユーザーフレンドリーで標準化された方法でヒト細胞に関する研究のすべての要件を満たすための世界的な合意に達していません23、したがって一次サンプルへのアクセスが制限されているため、組織の入手可能性、および不均一性。
さらに、内皮細胞コンパートメントは、細胞間相互作用の主要な構成要素を表し、白血病24 と転移25の両方で幹細胞の運命とBM疾患の発症に関与しているため、導入する必要があります。我々は以前、標準化されたヒト3D骨髄モデルに病理学的要素を追加することで、細胞外マトリックス(ECM)の変化などの患者サンプルで観察された特徴を再現することを報告しました26。ヒトBM微小環境と常在細胞との間のダイナミクスと相互作用をよりよく理解するために、最小限の、よく組織化されたBMのような構造を構築するための、ユーザーフレンドリーで標準化されたシステムの詳細なプロトコルを提供します。このシステムは、微小環境を表す内皮細胞と間質細胞、および造血幹細胞の3種類のヒト骨髄細胞で構成されています。特定のビーズを足場および骨芽細胞分化培地として使用することにより、得られた3D構造はヒト髄質ニッチを模倣し、ヒト骨髄の便利な研究を可能にします。

<table><tbody><tr><td>3,3-ジアミノベンジジン(DAB)液体基質システム</td><td>MERCK SIGMA</td><td>D7304</td><td>IHC染色</td></tr><tr><td>5mLピペット</td><td>SARSTEDT</td><td>861253001</td><td>中交換</td></tr><tr><td>アンチマウスHRP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>62-6520</td><td>IHC二次染色</td></tr><tr><td>アンチウサギHRP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31460</td><td>IHC二次染色</td></tr><tr><td>アスコルビン酸 250 &mu;M</td><td>MERCK SIGMA</td><td>A92902</td><td>ODM medium</td></tr><tr><td>BCP</td><td>CaP Biomaterials LLC-US</td><td></td><td>3D ビーズ</td></tr><tr><td>ベータ グリセロリン酸 10 mM</td><td>MERCK SIGMA</td><td>G9422</td><td>ODM medium</td></tr><tr><td>CD31-BV711</td><td>BD</td><td>744078</td><td>3D endothelial 細胞集団標識</td></tr><tr><td>CD34-APC</td><td>BD</td><td>555824</td><td>3D 未熟血液学的細胞集団標識</td></tr><tr><td>CD38-PE-Cy5</td><td>BD</td><td>555461</td><td>3D 前駆細胞 血液学的 細胞集団標識</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-110-637</td><td>血液細胞のIHC染色</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD</td><td>555485</td><td>3D 血液学的 細胞集団標識</td></tr><tr><td>CD45-BV500</td><td>BD</td><td>560777</td><td>3D 血液学的細胞集団標識</td></tr><tr><td>CD73</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-120-066</td><td>間質コンパートメント</td></tr><tr><td>CD73-BV605</td><td>BD</td><td>563199</td><td>3D骨芽細胞細胞の細胞集団ラベリング</td></tr><tr><td>5mLチューブ付きFACS機器用細胞ストレーナー</td><td>ファルコン</td><td>352235</td>ス<td>トレーナーとチューブを使用して細胞を収集し、ビーズを除去</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>MERCK SIGMA</td><td>C2674-1G</td><td>3D酵素解離</td></tr><tr><td>サイトメトリーろ過チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10585801</td><td>3D回収細胞 ろ過</td></tr><tr><td>サイトメトリーチューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10100151</td><td>3D回収細胞のラベリング&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI(Solution 12)</td><td>Chemometec</td><td>910-3012</td><td>3Dで得られた生存細胞の標識デ</td></tr><tr><td>キサメタゾン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A13449</td><td>ODM培地</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸500 mL</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31966021</td><td>ODM培地</td></tr><tr><td>EGF</td><td>MERCK SIGMA</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>HMED-1ミディアム</td></tr><tr><td>エッペンドルフ 1.5 mL チューブ</td><td>SARSTEDT</td><td>72696</td><td>ビーズオートクレーブおよび上澄み液用</td></tr><tr><td>ファルコン 15 mL</td><td>ファルコン</td><td>352096</td><td>3D 解離用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>DUTSCHER</td><td>S1900-500</td><td>培養培地を補い、トリプシン作用を停止するには</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1286001</td><td>HMED-1 培地</td></tr>ヘ<tr><td>マトキシリン溶液、ギルの代替No. 1</td><td>MERCK SIGMA</td><td>GHS132-1L</td><td>IHC staining</td></tr><tr><td>HMEC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>3D endothelial Cell population&nbsp;</td></tr><tr><td>HS27A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td>3D骨芽細胞集団&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>MERCK SIGMA</td><td>H0135-1MG</td><td>HMED-1 培地</td></tr><tr><td>インサート: Nunc ポリカーボネート細胞培養インサート マルチウェルプレート</td><td>THERMO SCIENTIFIC NUNC</td><td></td> 140627 <td>細胞を採取し、3Dを形成する 骨様構造</td></tr><tr><td>KI-67 IHC</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MA5-14520</td><td>増殖細胞のIHC染色</td></tr><tr><td>MCDB 131 培地、グルタミンなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10372019</td><td>HMED-1中</td></tr><tr><td>型マイクロピペット(1,000 & micro;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>&nbsp;4924000088</td><td>培地交換</td></tr><tr><td>PBS D 1x</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190169</td><td>細胞/インサートウォッシュ</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td>培養培地を補うため&nbsp;</td></tr><tr><td>PFA(ホルムアルデヒド16%)</td><td>EUROMEDEX</td><td>EM-15710</td><td>3D固定(PBS 1Xで希釈)</td></tr><tr><td>RMPI 1640培地、グルタマックスサプリメント</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>61870044</td><td>Cuture培地</td></tr><tr><td></td><td>メス&nbsp;FISHER SCIENTIFIC</td><td>11768353</td><td>3Dメンブレン切断</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>3D培養</td></tr><tr><td>TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x)</td><td>Thermofisher</td><td>25300096</td><td>3D 酵素解離</td></tr></tbody></table>

生理学的または子宮頸部の文脈における常在細胞間のダイナミクスと相互作用を調査するためのヒト骨髄3dモデル

A Human Bone Marrow 3D Model to Investigate the Dynamics and Interactions Between Resident Cells in Physiological or Tumoral Contexts

髄質ニッチは、常在細胞の恒常性を維持するために不可欠な複雑な生態系です。実際、複雑な細胞外マトリックスと間葉系幹細胞、骨芽細胞、内皮細胞などのさまざまな細胞種を含む骨髄は、サイトカイン産生だけでなく、直接的な細胞間相互作用を通じて造血幹細胞の制御に深く関与しています。この in vivo 構造を厳密に模倣し、ヒト骨髄の応答を反映した実験を行うために、主に初代間質細胞に依存して、生体材料に基づいていくつかの3Dモデルが作成されています。ここでは、セットアップが容易で、内皮細胞を含む異なる細胞集団を組み合わせ、 in vivo 骨髄組織の不均一性を反映する骨髄様構造の特徴を提供する最小限の標準化されたシステムを得るためのプロトコルについて説明します。骨髄微小環境を代表するリン酸カルシウムベースの粒子とヒト細胞株を使用して組み立てられたこの3D骨髄様構造は、システム内の異なる初代細胞集団を組み合わせまたは置換することにより、さまざまな生物学的プロセスのモニタリングを可能にします。最終的な3D構造は、固定後の画像解析、パラフィン包埋、およびシステム内の細胞局在のための組織学的/免疫組織化学的染色のために収集するか、分子的または機能的特性評価のために各細胞成分を収集するために解離することができます。

このプロトコルを使用すると、最小限の in vitroの 3DヒトBM様微小環境を再現することができ、そこから3つの異なる細胞コンパートメントから生細胞を取り出すことができます(図1)。実際、所望の曝露後、3D BM様構造を解離させ、フローサイトメトリーを用いてMSC、内皮細胞、造血細胞を評価/特性評価することができる(図2A)。これまでのところ、結果は、生細胞を回収する前に、3Dモデル内で血液学的細胞を少なくとも6週間維持することが可能であることを示唆しています(図2B)。ただし、この3Dモデルの限界を推定するには、今後の調査が必要です。さらに、必要に応じて、この3D BM様モデルにおいて、HS27A細胞株を初代正常骨髄(NBM)MSCまたは急性骨髄性白血病(AML)MSCに置き換えるか(図2C)、造血細胞株を初代造血幹細胞に置き換えることができます(図2D)。さらに、細胞コンパートメント間の相互作用または目的の特定のマーカーの局在を分析する場合、3D BM様構造を固定し、パラフィン包埋および免疫化学でさらに処理することができます。例えば、CD45(血液学的)またはCD73(MSC)含有量の分析は、これらの3Dモデルを用いて行われた(図3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig01.jpg"> 図1:人間の3D BMのようなシステムの初期設定の概略図。 3週間の共培養の後、固形BM様組織を採取するか、造血細胞(例のように)または他の細胞型で播種することができる。必要に応じて、細胞が接着したら、治療を追加し、週に2回培地交換を行うことができます。実験の最後に、BM様構造を固定し、局在化研究のためにさらに処理するか、または細胞含有量を評価するために解離させることができる。略語:BCP =二相性リン酸カルシウム;BM =骨髄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig02.jpg"> 図2:BM様3Dモデルにおける培養後の異なるコンパートメントからの生細胞の回復。 (A)9.84%の生細胞を有する1つの解離したBM様構造体からの細胞回収の典型的なパターン(DAPI−<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig03large.jpg" target="_blank"></a>

ここでは、ヒト骨髄の in vivo 構造の複雑さを反映した、実装が簡単で標準化された微小生理学的システムについて説明し、幅広い正常および病理学的イベントを細かく研究するための適切なモデルを提供します。

生理学的または子宮頸部の文脈における常在細胞間のダイナミクスと相互作用を調査するためのヒト骨髄3Dモデル

The medullary niche is a complex ecosystem that is essential to maintain homeostasis for resident cells. Indeed, the bone marrow, which includes a complex ...

この技術は、ヒト細胞株または初代細胞集団からのセットアップが容易で、よく組織化された骨髄様構造の特徴を提供する標準化されたシステムの開発を可能にします。このモデルにより、固定後の細胞採取により、イメージングを介してシステム内のin situ細胞局在を特徴付けたり、分子または機能研究のために各細胞成分を収集するための3D構造解離を行ったりすることができます。手順を実演するのは、私の研究室のアシスタントエンジニアであるケビンガイストリッヒです。インサートごとに1.5ミリリットルのチューブに35〜40ミリグラムのBCPビーズを計量します。つまり、底にポリカーボネート膜が付いた小さな円筒形のプラスチック皿です。オートクレーブサイクル中に蓋が飛び出さないように、1.5ミリリットルのチューブの上部にきれいな針で小さな穴を開け、閉じた滅菌ボックスにチューブを垂直に置きます。滅菌ポリカーボネート細胞培養インサートを6ウェルプレートのウェル内に置きます。滅菌BCPビーズを1.5ミリリットルのチューブからインサートに注ぎます。インサート内に350マイクロリットルの1X PBSを滴下してビーズを注意深く洗浄し、次に4.5ミリリットルの1X PBSをウェルに追加します。チップをウェルの隅に置いて、真空または5ミリリットルのピペットを使用してPBSを廃棄します。洗浄手順を2回繰り返します。次に、10%FBSを追加した1X PBSを使用してシステムをブロックします。350マイクロリットルのブロッキング溶液をインサートに、4.5ミリリットルをウェルに慎重に加え、プレート全体をインキュベーターに一晩入れます。システムからブロッキングソリューションを削除します。血管および間葉系間質細胞区画をそれぞれ表す6個のHMEC-1細胞に10回、血管および間葉系間質細胞区画をそれぞれ表す6個のHS27A細胞に10倍10回混合し、室温で1, 575Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、間葉系間質細胞の骨芽細胞への分化を促進する175マイクロリットルのODMを添加した175マイクロリットルのHMEC-1培地を追加します。各インサート内の合計6個のセルに3倍10を含む350マイクロリットルのセル懸濁液を注ぎます。次に、細胞を含まない4.5ミリリットルの混合培地をプレートのウェルに注ぎます。混合物を穏やかに吸引し、1ミリリットルのマイクロピペットで数回分注し、インサート内の細胞とBCPビーズを均質化します。ミックス全体がインサートの下部に落ち着くまで待ちます。内皮細胞と間葉系細胞がインサート内でホモジナイズされたら、6ウェルプレートをインキュベーター内に3週間保管します。週に2回、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して培地を慎重に取り出し、チップをインサートの内側の壁に配置して、インサートの角を乱さないようにして、ウェル内のインサート内の培地を交換します。目的の血液細胞をHMEC-1およびRPMIコンビネーション培地に再懸濁し、細胞懸濁液をインサートに追加します。このステップでは、専用培地を用いた他の細胞タイプを追加することができます。薬物治療プロトコルが必要な場合は、目的の細胞を追加してから24時間待ってから治療し、骨のような構造に接着する時間を与えます。週に2回、50%HMEC-1完全培地と50%RPMI完全培地で培地をリフレッシュします。培養液を週2回交換した後、インサート内部から取り出した上清をマイナス80°Cで保存し、システム内でのタンパク質産生を評価します。細胞を3D構造から解離させるには、4.5ミリリットルのRPMIを0.5ミリリットルのFBSと混合し、15ミリリットルのチューブに1ミリリットルのコラゲナーゼあたり0.4ミリグラムを添加します。次に、溶液を摂氏37度で10分間温めます。インサートを逆さまにして滅菌済みの6ウェルプレートカバーに置き、メンブレンを適切に切り取ります。滅菌メスを使用して膜を側面から切断し、白い固体ディスクを取り出します。前に調製した溶液混合物を含む温かい15ミリリットルのチューブの中にディスクを置きます。チューブを摂氏37度のインキュベーターのアクティブホイールに入れ、消化できるように10分間インキュベートします。すべてのメンブレンに同じインキュベーション時間を適用して、歪んだ分析を回避します。インキュベーション後、15ミリリットルチューブを室温で1, 575 Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを5ミリリットルの温かい1X PBSに再懸濁します。ペレットを300マイクロリットルの温かいトリプシンに再懸濁し、10秒間ピペッティングしてよく混合し、摂氏37度に設定した水浴に1分間入れます。1ミリリットルの温かい純粋なFBSを加えて酵素消化を止めます。1ミリリットルのマイクロピペットで、培地を機械的に吸引して分注し、椎間板を完全に解離させます。チューブを1, 575 Gで5分間遠心分離し、10%FBSを添加した3ミリリットルの1X PBSにペレットを再懸濁します。ビーズを5秒間沈殿させてから上清を採取し、収集チューブに置いた35ミクロンのセルストレーナーでろ過します。回収したろ液を1, 575Gで5分間遠心分離し、トリパンブルーで細胞を計数し、生存率を評価した。ペレットを抗体ミックスに再懸濁し、光を避けて氷上で30〜40分間インキュベートします。2%FBSを添加した1ミリリットルのPBSを加えて細胞を洗浄し、1, 57 G.To 5で5分間遠心分離してフローサイトメトリー分析を開始し、検索したペレットを10%FBSを含む200マイクロリットルの1X PBSに再懸濁し、DAPIを1〜2000溶液に補充します。テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、サイトメーターでチューブを分析します。FSC-H対FSC-Wグラフプロットを使用して、一重項母集団をゲートします。一重項画分では、DAPI-A対FSC-Aグラフプロットを使用して、生細胞集団を決定します。DAPI陰性集団を以前にゲートした状態で、APCA-A対FSC-Aグラフプロットを使用して、CD45陽性集団を決定します。BMのような構造を修正するには、インサートを古いプレートから1X PBSで満たされた新しい6ウェルプレートに移します。次に、インサート内の培地を1X PBSと慎重に交換します。インサートを洗浄したら、新しい6ウェルプレートに入れ、ウェルとインサートの両方に開封したばかりのパラホルムアルデヒドを充填します。固定プロセスを室温で4時間、光から離して進行させます。次に、インサートを1X PBSで1回洗浄し、光から離して摂氏4度で保管します。所望の曝露後、結果は、生細胞を回収する前に、3Dモデル内で血液学的細胞を少なくとも6週間維持することが可能であることを示唆した。この3D BM様モデルでは、HS27A細胞株を初代正常骨髄MSCまたは急性骨髄性白血病MSCに置き換えるか、造血細胞株を初代造血幹細胞に置き換えることができました。 パラフィン包埋と免疫化学により、3Dモデルを使用したCD45およびCD73含有量の分析に成功しました。この3Dシステムでは、骨髄様構造を3週間使用し、目的の細胞でさらに時間をかける必要があります。また、無菌状態を維持する必要がありますが、週に2回の培地交換で培地の汚染が見られることもあります。

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Biology

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