マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化
2023年3月3日
提示されたプロトコルは、96ウェルハイスループット透析プレートを使用してタンパク質結晶化条件と結晶成長をスクリーニングするための簡単なアプローチを説明しています。微結晶の大規模な成長のためのダイアライザーチューブの使用は、シリアル結晶学およびMicroEDアプリケーションでも実証されています。
透析による結晶化は十分に活用されていない方法です。このプロトコルは、これに対するNovoアプローチを提示し、構造化された決定に現在利用可能な結晶化戦略の範囲を拡大します。この技術の主な利点は、スループットが高く、特殊な機器を必要とせずにセットアップが簡単で、結晶成長のモニタリングが容易であることです。
この技術を実行する個人は、少量のピペッティングとマルチチャンネルピペットの使用に慣れている必要があります。滴は部分的な脱水を防ぐためにできるだけ十分にピペットで入れなければなりません。マイクロダイアリシス実験のセットアップは、市販の96穴マイクロダイアリシスプレートをタンパク質側を上にして置き、200ミクロンの圧力接着剤スペーサーを剥がして粘着カバーテープをはがします。
粘着カバーテープを剥がした後、ウェルA1の位置に注意してください。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、最大3.2マイクロリットルの適切に調製されたタンパク質サンプルを各ウェルにロードします。200ミクロンのUVカバーフィルムを96ウェルプレートの上に、フィルムを上に向けて適切に配置します。次に、圧力接着剤をアクティブにしてシールするには、シーリングパドルを使用してUVカバーフィルムを押し下げ、その完全性を確認します。
次に、プレートを反転させてバッファー側を上にして、マークされたウェルA1の鏡面位置をメモします。マルチチャンネルピペットを使用して、最大350マイクロリットルの透析溶液をプレートの各ウェルにロードし、リザーバーカバーフィルムでウェルを慎重に密封します。次に、プレートを摂氏20度の適切な温度制御インキュベーター内のバッファー側を上にした向きにして、結晶成長を可能にします。顕微鏡で結晶形成を調べるには、200ミクロンのUVカバーフィルムから保護カバーフィルムをはがし、タンパク質側を上に向けて接眼レンズの下にプレートを置きます。
大規模な結晶化実験を設定するには、マイクロ透析プレートで微結晶成長が起こった条件を採用し、大きな容器で同じ条件を再現します。透析液の量に応じて容器サイズを選択してください。赤いプラスチックキャップを使用してチューブを密封する前に、最大容量500マイクロリットルのタンパク質サンプルを透析チューブにピペットで入れます。
密閉された500マイクロリットルの透析チューブを、透析液で満たされた容器内のフローティングラックに入れます。次に、容器を摂氏20度の適切な温度制御されたインキュベーター内に乱さずに置き、結晶成長を実現します。結晶の形成を確認するには、1〜2マイクロリットルの溶液を透析器からガラスカバースライドにピペットで貼り付けます。
スライド上の溶液を別のスライドガラスで覆い、顕微鏡で観察します。ステレオ高倍率顕微鏡で撮影した画像では、分子量10キロダルトンのカットオフ膜を備えたマイクロ透析プレートを用いて、4つのタンパク質の微結晶形成に成功しました。リゾチームは、適切な添加剤を含むpH 4で0.1モルの酢酸ナトリウムに対して透析すると結晶を形成することがわかりました。
ドマチンは、適切な添加剤を含むpH 6.6で0.1モルのビストリスプロパンに対して透析すると結晶を形成した。透析条件を最適化することで、膜タンパク質、すなわち大腸菌多剤排出ポンプタンパク質AcrBと大腸菌ラクトーストランスポーターLacYによる微結晶形成がもたらされました。微小透析実験から得られた最適化された透析条件を用いた透析管内での大規模な結晶化により、タンパク質ごとに数千個の微結晶が形成されました。
フォミチンの結晶化のために、250マイクロリットルのタンパク質を50ミリリットルの透析溶液に対して透析した。AcrBについては、250マイクロリットルのタンパク質を25マイクロリットルの透析溶液に対して透析した。LacY結晶化も同じ比率で設定され、100マイクロリットルのタンパク質と10ミリリットルの透析溶液が添加されました。
プレートをバッファー側を上に反転させるときは、結晶化スクリーンからの溶液をそれに応じて分注できるように、A1の位置に注意してください。この方法で得られた結晶は、シリアル結晶学やマイクロEDなどのダウンストリームアプリケーションに使用できます。
概要
このプロトコルは、96ウェルマイクロダイアリーシスプレートを使用したタンパク質結晶化条件のスクリーニングのための高スループットの方法を概説しています。連続結晶解析およびMicroEDへの応用のためのマイクロ結晶の成長を実証しています。
主要な研究要素
科学分野
- タンパク質結晶化
- 構造生物学
- 結晶解析技術
背景
- ダイアリーシスによる結晶化は、タンパク質結晶化においてあまり一般的ではない方法です。
- この方法は利用可能な結晶化戦略の範囲を拡大します。
- その単純性と高スループット能力により有利です。
- この方法では結晶成長のモニタリングが容易です。
研究目的
- タンパク質結晶化のための新しいアプローチを提示すること。
- マイクロ結晶の大規模成長を促進すること。
- 連続結晶解析およびMicroED応用のための条件を最適化すること。
使用方法
- 結晶化のための96ウェルマイクロダイアリーシスプレートの利用。
- ウェルへのタンパク質サンプルおよびダイアリーシス溶液のロード。
- 結晶成長のための温度管理されたインキュベーション。
- 結晶形成の顕微鏡観察。
主な結果
- 複数のタンパク質のマイクロ結晶の成功した形成。
- 最適化された条件により数千のマイクロ結晶が得られました。
- リゾチーム、ドマチン、AcrB、LacYの特定の条件が特定されました。
- 形成された結晶は下流の応用に使用できます。
結論
- この方法は結晶化条件をスクリーニングする信頼性の高い方法を提供します。
- 結晶化実験の容易なスケーリングを可能にします。
- このアプローチはタンパク質の構造決定に有益です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput protein crystallization via microdialysis enables rapid screening of crystallization conditions, supporting structural biology and drug discovery pipelines. This workflow increases predictive confidence in structure-based target validation and accelerates the transition from discovery to preclinical research. The approach is scalable, robust, and compatible with downstream applications such as serial crystallography and MicroED.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid interrogation of protein structure-function relationships for target validation.
- Enables mechanistic de-risking by providing atomic-resolution structural data.
- Supports portfolio triage by identifying tractable targets through structural insights.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein crystals for downstream screening and biophysical assays.
- Standardizes crystallization conditions using SBS-compatible 96-well plates for reproducibility.
- Enables scalable production of microcrystals for high-throughput screening platforms.
- Supports reliable evaluation of protein-ligand interactions in structure-based drug design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant protein targets for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery-stage structural elucidation to preclinical validation studies.
- Reduces risk in advancing candidates by providing robust structural evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This microdialysis-based crystallization method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting iterative structure-guided optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through high-throughput structural analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers high-quality crystals suitable for X-ray and electron diffraction measurements.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for repeated use across diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable crystallization workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust structural insights early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling and low-volume pipetting techniques.
- Needs access to standard crystallization laboratory infrastructure and microscopy for monitoring.
- Demands cross-team standardization for plate setup and data interpretation.
- Adaptable to a wide range of protein classes, including membrane proteins, as demonstrated.
- Limited by protein solubility and stability under dialysis conditions as noted in the protocol.
