蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

このプロトコルにより、研究者はカスパーゼ活性が細胞死と関連して発生するかどうかを識別できるため、さまざまな細胞死モードを特定できます。この技術の利点は、集団ベースのアッセイまたは単一細胞でカスパーゼ活性を評価できる柔軟性です。手順を実演するのは、博士課程の卒業生であるステファニー・ルフリと、ウェンディ・ウェイリン・ウォンの研究室の客員博士課程の学生であるジン・トンです。

原稿に記載されている骨髄由来マクロファージまたはBMDMを分化および回収した後、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1倍の密度で6ウェルプレートに播種します。細胞をSMAC模倣体で16時間処理します。細胞ライセートを調製するには、処理した細胞を含むプレートを氷上に移し、細胞培養培地を1.5ミリリットルのチューブに集めます。

摂氏4度で5分間300gで遠心分離します。培地を吸引し、チューブを氷の上に置きます。次に、1ミリリットルの冷たいPBSを細胞培養プレートに加えて細胞を洗浄します。

すべてのPBSを吸引した後、100マイクロリットルのトリプシンを細胞に加えます。細胞がプレートから切り離されたら、それらを1.5ミリリットルのチューブに集めます。細胞懸濁液を遠心分離した後、上清を除去し、ペレットを100マイクロリットルのDISC溶解バッファーに再懸濁する。

サンプルを氷上で20分間インキュベートした後、ライセートを遠心分離して不溶性画分をペレット化します。カスパーゼ-3/7活性アッセイの場合は25マイクロリットルのライセートを白色平底96ウェルプレートに、ビシンコニン酸またはBCAアッセイの場合は10マイクロリットルを透明な平底96ウェルプレートに移します。タンパク質定量のために、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンまたはBSA濃度の範囲を調製します。

サンプルを含む平底96ウェルプレートに標準BSAを添加したら、BCA試薬1と2を50対1の比率で混合し、標準サンプルに200マイクロリットルを加えます。摂氏37度で30分間インキュベートした後、蛍光測定器で562ナノメートルの吸光度を測定し、検量線でタンパク質濃度を定量します。ポピュレーションベースのアッセイを実行するには、蛍光測定装置を起動し、機械を摂氏30度に加熱します。

励起波長と発光波長をそれぞれ360ナノメートルと465ナノメートルに設定します。次に、原稿に記載されているように氷上でマスター反応ミックスを調製し、カスパーゼ活性を測定します。75マイクロリットルの混合物を各サンプルと標準物質に加え、総反応量100マイクロリットルを得ました。

蛍光測定装置のセットアップを使用して蛍光をすぐに測定し、個々の測定値を毎分40分間記録して、反応速度を決定します。播種後、前に示したように接着細胞を5ミリリットルのポリスチレンチューブに回収します。その後、サンプルを摂氏4度で300Gで5分間遠心分離し、上清を除去します。

染色ミックスを調製するには、1マイクロリットルの蛍光発生基質を取り、150マイクロリットルのPBSで希釈します。サンプルあたり50マイクロリットルの染色ミックスを加え、摂氏37度の暗所で30分間インキュベートし、15分ごとに混合します。この集団ベースのアッセイでは、カスパーゼ-3/7活性の速度論的アッセイの代表的なデータは、SMAC模倣体濃度の増加とともに基質切断の増加を示しました。.

しかし、500ナノモル濃度での増加は、多重比較による通常の一元配置分散分析に基づいて重要ではありませんでした。フローサイトメトリーを用いたカスパーゼ-3/7活性の分析は、SMAC模倣体で処理した細胞が未処理の細胞と比較して蛍光のシフトを示し、これはプロットされた蛍光強度の中央値でも明らかであり、500ナノモル濃度での増加は有意でした。手順は氷上で実行する必要があります。

ただし、ポピュレーションベースのアッセイでは、サンプルを無期限に氷上に残すことはできません。溶解ステップの後、サンプルはすぐにさらに処理または凍結する必要があります。生細胞顕微鏡を使用してカスパーゼ活性をイメージングすることは、単一細胞レベルで速度論的情報を得るための追加の方法となるでしょう。