Name: マウス インビボ 胎盤標的CRISPR操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶマウス胎盤標的CRISPR操作法。妊娠中期から後期の遺伝子機能解明に有用で、プラスミド注入と電気穿孔により胎盤内遺伝子発現を操作できます。発生生物学研究に応用可能です。

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著者らは、R01 MH122435、NIH T32GM008629、およびNIH T32GM145441の資金源を認めている。著者らは、アイオワ大学のヴァル・シェフィールド博士とカルビン・カーター博士の研究室が手術室と機器を使用してくれたこと、そして顕微鏡検査の支援をしてくれたエリック・ヴァン・オッタールー博士、ナンダクマール・ナラヤナン博士、マシュー・ウェーバー博士に感謝の意を表した。著者はまた、パイロット手術を支援してくれたサラ・マウラー博士、マヤ・エバンス博士、スリーレカ・クンドゥ博士にも感謝しています。

すべての手順は、連邦規制およびアイオワ大学の方針に従って実行され、それに準拠して実行され、施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.動物と飼育
<ol><li>動物を12時間の日光サイクルに保ち、食物と水を 自由に保ちます。</li>
	<li>8〜15週齢のCD-1雌マウスを使用する。交尾プラグの存在を使用してE0.5を識別します。</li>
	<li>E0.5では、妊娠中のダムを単独で収容します。</li>
</ol>2. マイクロピペットの校正
注:可能であれば、マイクロピペットのキャリブレーションを手術前に実行する必要があります。
<ol><li>マイクロピペットを作製して校正する前に、すべてのプラスミドをDNaseフリー水で推奨濃度(0.1 μg/μL)に希釈してください。プラスミドを適度に希釈したファストグリーン色素(PBS溶液1 μg/μL)と混合します(最終プラスミド濃度:0.06 μg/μL)。</li>
	<li>マイクロピペットプーラーで外径1.5 mm、内径0.86 mmの10 cmガラスキャピラリーを使用してマイクロピペットを引きます。</li>
	<li>マイクロピペット(2〜3 mm)の先端を滅菌鉗子で慎重に切り離します。</li>
	<li>マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロキャピラリーチップにマイクロピペットをロードします。マイクロインジェクターがマイクロインジェクションマシンに取り付けられていること、およびマイクロピペットを校正するのに十分なレベルの窒素があることを確認してください。</li>
	<li>マイクロピペットをマイクロインジェクターに取り付けたら、Fast Green色素溶液をロードしてキャリブレーションを実行します(PBS溶液1 μg/μL)。マイクロピペットを較正して、約3.5 μLの容量を注入します。 以下のように、プラスミド溶液をロードする準備としてマイクロピペットを空(「透明」)にします。 注意: 各マイクロピペットはわずかに異なります。注射中の胎盤の損傷を避けるために、注射時間は0.5〜1.5秒の間で設定する必要があります。圧力は1〜8.5psiの間で設定する必要があります。各マイクロピペットを個別に校正します。マイクロピペットをこれらのパラメータ内で校正できない場合は、使用しないでください。</li>
</ol>3.手術(図1A)
注:準備するには、準備領域と手術領域の両方の表面を70%エタノールで洗浄します。準備エリアに吸収性アンダーパッドを置きます。手術エリアでは、加熱パッドを下に置いてから、その上に吸収性のアンダーパッドを置きます。手術前にすべての道具を滅菌してください。ダムが麻酔下にある時間は1時間未満でなければなりません。
<ol><li>麻酔<ol><li>手術の30分から1時間前に、5 mg / kgのNSAID(メロキシカム)または別の承認された鎮痛薬を妊娠中のダムに投与します。.</li>
		<li>妊娠中のダムをイソフルラン気化器に取り付けられた誘導チャンバーに置きます。</li>
		<li>気化器を4%イソフルランと3.5 L / min酸素に設定します。</li>
		<li>つま先のつまみに対する反応の欠如と呼吸数の低下によって麻酔が確認されたら、ダムを誘導室から準備エリアに移します。</li>
	</ol></li>
	<li>手術の準備<ol><li>準備エリアで、ノーズコーンでダム仰臥位を置きます。</li>
		<li>ダムがノーズコーンにある間、気化器を2%イソフルランと3.5 L / min酸素に減らします。</li>
		<li>ダムの腹部を完全に剃り、余分な毛皮を取り除きます。滅菌綿先端アプリケーターを使用して、剃毛した腹部をポビドン溶液と70%エタノールで交互に3回コーティングします。ポビドン溶液の最終コートを適用します。角膜の乾燥を防ぐために、ダムの両目に人工涙液ゲルを置きます(図2A、B)。</li>
		<li>準備が終わったら、ノーズコーン付きのダムを指定された手術部位に移動します。</li>
	</ol></li>
	<li>子宮開腹術 注意: 手術中は滅菌手袋を使用してください。滅菌されていない表面に接触した場合は、手袋を交換してください。<ol><li>手術部位にダムを仰臥位で置き、ノーズコーンをテープで固定します。吸収パッドの下の加熱パッドを45°Cに設定します。</li>
		<li>鉗子とはさみを使用して、皮膚を通して約2 cmの正中線切開を行います。鉗子を使用して皮膚をテント張りにし、皮膚を垂直に切開します。この後、腹膜を通して別の同様のサイズの切開を行い、子宮角を露出させます。鉗子を使用して、垂直切開を行いながら腹膜にテントを張ります(図2C、D)。 注意: 腹膜を切開しながら適切にテントを張らないと、腸が致命的に切開される可能性があります。</li>
		<li>腹部の側面を押して、切開部を通して子宮角を優しくマッサージします。偶発的な怪我を避けるために指だけを使って、道具なしで子宮を慎重に導くことによってこれを行います。ダムの腹部を覆う滅菌外科用ドレープの上に露出した子宮を置き、必要に応じて使用前に30°Cに温めることができる滅菌生理食塩水の滴で手術中湿らせてください(図2E、F)。 注:子宮角は、Wangら27に記載されているように識別できます。</li>
		<li>子宮が露出したら、操作のために3対の胎盤を選択します。 注:胎盤は、Elmoreら24に記載されているように識別できます。胚の生存を最大化するために、6つ以下の胎盤を治療する必要があります。存在する胚が12個未満の場合は、4個以下の胎盤を注射する必要があります。隣接する2つの胎盤を選択して、一方が対照注射を受け、もう一方が実験プラスミドを受け取るようにします。隣接する2つの胎盤を使用すると、子宮内の同様の場所にある胎盤をより適切に比較でき、生存率を高めることもできます。選択された胎盤対はランダムに選択され、両方の子宮角全体に間隔を空けて選択されます(図1B)。</li>
		<li>胎盤操作の位置と子宮角内の胚の組織を記録して、1つのダムが対照と実験的に処理された胎盤/胚の両方を運ぶため、収集中に胚と胎盤を識別できるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>コントロールプラスミドの胎盤注入とエレクトロポレーション 注意: 無菌技術を維持するには、使用前にエレクトロポレーションパドルとマイクロインジェクターを冷滅菌剤で滅菌してください。滅菌されていない表面に接触した場合は、手袋を交換してください。<ol><li>較正されたマイクロピペットを使用して、3回の注入に十分な量の適切なコントロールプラスミドをロードします。すべての注入を、脱落膜(白)と接合部(暗赤色)の間の胎盤に横方向に~0.5mmの深さで行います(図3A-F)。</li>
		<li>3つの対照胎盤に注射を行います。 注:マイクロピペットによるプラスミドの交差汚染を避けるために、実験的注入の前にすべてのコントロールプラスミド注入を実行してください。これにより、マイクロピペットとキャリブレーション時間を変更すると手術時間が大幅に増加し、ダムの生存率が低下するため、同じマイクロピペットを使用できます。</li>
		<li>コントロールプラスミド注入胎盤のエレクトロポレーションを注射後2分以内に行う。</li>
		<li>エレクトロポレーションには、エレクトロポレーションマシンに取り付けられた3mmパドルのペアを使用します。CRISPRの取り込み効率と胚の生存率を確保するには、次のエレクトロポレーション設定を使用します:2パルス、30 V、30 msパルス、970 msパルスオフ、ユニポーラ。</li>
		<li>注射後、エレクトロポレーションの直前に、接触場所を滅菌生理食塩水でコーティングし、生理食塩水を子宮壁の3つの部位とパドルにスポイトまたはシリンジで正確に塗布します。</li>
		<li>胎盤の側面にあるエレクトロポレーションパドルをそっと押します。アノードパドルを注入部位とカソードの真向かいに配置します(図4A-C)。</li>
		<li>エレクトロポレーションマシンのパルスを押し、2つのパルスが完了するのを待ってから、エレクトロポレーションパドルを取り外します。 注:パルス中にパドルと胎盤の間に少量の白い泡がよく見られます。これが発生しない場合は、さらに使用する前に電圧計でパドルからの電圧を確認してください。電圧計の読み取り値がエレクトロポレーション電圧設定と一致しない場合、パドルは機能しません。</li>
	</ol></li>
	<li>実験用プラスミドの胎盤注入とエレクトロポレーション<ol><li>手順 3.4.1 と同じ手順に従います。ステップ 3.4.2 に移動します。コントロールプラスミドの代わりに実験用プラスミドを用いた。</li>
		<li>注射から2分以内に、3つの実験的注入された胎盤すべてのエレクトロポレーションを実行します。これは、コントロールプラスミドを注入したものと同様にして行うべきである。手順 3.4.4 に従います。ステップ 3.4.7 に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>手術の完了<ol><li>胎盤操作が完了したら、指だけを使って子宮角を腹腔内で優しくマッサージします(図5A)。</li>
		<li>まず、長さ45cmのコーティングおよび編組溶解可能な縫合糸を13mm3/8c針合金で使用して、腹膜層に二重結節の単一縫合糸を行います。縫合糸を2〜3 mm離して配置します(図5B)。</li>
		<li>腹膜層を縫合した後、溶解可能な縫合糸で皮膚を縫合する。ダムが縫合元を元に戻すことができないように、単一の縫合糸を2〜3 mm離してトリプルノットします(図5C)。</li>
		<li>縫合が完了したら、イソフルランを1%、酸素を3.5 L / minに設定し、皮膚の縫合糸に組織接着剤を塗布します(図5D)。 注:組織接着剤はオプションですが、ダムの咀嚼による切開の再開を防ぐために推奨されます。</li>
		<li>組織接着剤が乾いたら、気化器をオフにし、手術エリアからダムを取り外します。ダムを背中の支持ケージに入れます。</li>
	</ol></li>
</ol>4.術後のケアとモニタリング
<ol><li>妊娠中のダムを監視下の清潔なケージで最低30分間回復させて、手術の即時の合併症がないことを確認します。それが完全に歩行可能になり、補助なしでその足にひっくり返ることができるまで観察してください。手術後のダムを単独で収容します。</li>
	<li>胚の採取まで、施設の術後ケアとモニタリングに従ってください。ダムの重量を記録し、縫合糸と切開部位を毎日監視します。</li>
</ol>5. E14.5胎盤コレクション
<ol><li>E14.5では、ケタミン/キシラジンカクテル(1 mg / mLケタミンと0.1 mg / mLキシラジン)でダムを深く麻酔し、ダムを頸部脱臼させます。</li>
	<li>ハサミでダムの腹部にV字型の切開を行い、子宮を取り除きます。すぐに氷の上の5cmのペトリ皿に置きます。鉗子を使用して、胚と対応する胎盤を子宮から慎重に取り除きます。 注:子宮角の胚の位置と対応する胎盤を記録して、手術中に直接操作を受けたものを特定します。</li>
	<li>胎盤の体重を記録します。RNAseフリーの鉗子とかみそりを使用して、胎盤を正中線の下で半分に切ります。4°Cで半分を4%PFAに入れます。 残りの半分を再度半分にカットし、残りの2/4を-80°Cで2本のチューブ(1本はRNA保存試薬付き)に保存します。 注:胚およびその他の母体組織は、将来の使用のために-80°Cでコレクションから保存できます。</li>
</ol>6. 胎盤遺伝子発現解析
<ol><li>-80°Cで保存された胎盤の四分の一をRNA保存試薬に使用します。</li>
	<li>RNA単離のためのTrizol法、RNA濃度のための分光光度計、cDNA合成キット、およびSYBRグリーンマスターミックス28を用いたqPCRを使用して、Elserらに記載されているようにqPCRのために胎盤を処理します。Elserらで参照されているターボDNAフリーキットDNAaseの代わりに、Trizol RNA単離後にRNAクリーンアップキットを使用して、サンプルに汚染物質が含まれていないことを確認します28。 注意: Trizolの製品安全データシート(MSDS)を読み、化学ヒュームフードで使用してください。</li>
	<li>GFPプライマーを用いた対照プラスミドおよびBLASTプライマーを用いた実験プラスミド( 補足表1に記載されているプライマー)のプラスミド挿入を評価します。CT値を使用して、プラスミドの存在を判断します。 注:35を超えるCT値は偽陽性であり、35未満のCT値のみがプラスミドが正常に挿入されたことを示す陽性の指標と見なす必要があります。</li>
	<li>ハウスキーピング遺伝子18sに正規化したIGF-1胎盤発現を評価する(補足表1に列挙するプライマー)。ddCT法を使用してフォールド変化を計算し、次に実験サンプルの正規化フォールド変化をコントロールサンプルの平均フォールド変化に計算します。</li>
</ol>7.胎盤タンパク質レベルの分析
<ol><li>-80°Cで保存された胎盤の四分の一を使用してください。 最終pH7.4のdiH 2 O中の11.5 mM Tris HCl、5 mM MgCl2、および10 mMプロテアーゼ阻害剤からなる緩衝溶液で組織をホモジナイズします。ハンドヘルドホモジナイザーと乳棒を使用して組織を破壊します。 注:サンプルはバッファーの容量の10%を超えてはなりません。</li>
	<li>ホモジナイズしたサンプルをバッファー中で1:12に希釈し、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)キットの検出範囲内になるようにします。製造元の指示に従ってBCAアッセイを実行し、プレートリーダーを使用して総タンパク質を定量します。</li>
	<li>BCAアッセイを実行した後、Gumusogluら29で行われているように、IGF-1 ELISAのすべてのサンプルを同じ総タンパク質濃度2 mg/mLに正規化します。</li>
	<li>製造元の指示に従ってIGF-1 ELISAを実行し、標準濃度曲線を用いてプレートリーダーでIGF-1タンパク質レベルを定量します。</li>
</ol>8. 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション標識を用いた空間的クリプサー検証
<ol><li>胎盤の半分を4°Cの4%PFAで1〜3日間適切に固定した後、4°Cの20%スクロースに移してから、最適な切断温度(OCT)コンパウンドで凍結します。</li>
	<li>OCT包埋胎盤の半分を-20°Cのクライオスタットで10 μmの切片に連続切断し、ラベル付けするスライドに配置します。胎盤の半分を切断して、3つのサブ領域すべてが見えるようにします。 in situ ハイブリダイゼーションに使用するまで、スライドを-80°Cで保存してください。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)標識を実行します。1つのスライドをdCas9-3xNLS-VP64プローブとハイブリダイズし、同じ胎盤の2番目の「姉妹」スライドをPrl8a8プローブとハイブリダイズします。 注:dCas9-3xNLS-VP64プローブは、過剰発現プラスミドの存在を検出します。Prl8a8プローブは、接合帯の海綿状絨毛膜を強調し、胎盤のサブ領域を識別できるようにします。これらの2つのプローブは、胎盤内の緑色の自家蛍光とのマルチチャンネル蛍光の干渉を避けるために、別々の「姉妹」スライドに標識されています。</li>
	<li>両方のプローブを検出色素(Opal 620)で標識します。FISHの製造元のプロトコルが完了したら、DAPI封入剤を塗布し、スライドにカバーガラスを置きます。透明なマニキュアでカバーガラスを密封します。</li>
	<li>正立型複合蛍光顕微鏡でスライドを画像化し、適切な画像処理ソフトウェアを使用して処理します。ここでは、CellSensソフトウェアを使用しました。</li>
</ol>

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著者は開示するものは何もありません。

胎盤は胎児の成長の主要な調節因子であり、前述のように、胎盤の遺伝子発現または機能の変化は胎児の発育に大きな影響を与える可能性があります6。ここで概説したプロトコルは、比較的高度な外科的アプローチを使用して、マウス胎盤の標的in vivo CRISPR操作を実行するために使用できます。この技術により、生存可能な胚とそれに対応する胎盤のかなりの収量が可能になり、さらなる研究に使用できます(図6A、B)。この手法により、E14.5上の胎盤IGF-1を過剰発現させることに成功しました(図7A、B)。使用したプラスミドは、挿入されたプラスミドが操作された胎盤に残り、隣接する未処理の胎盤には存在しなかったため、特異性を示しました(図7C、D)。IGF-1活性化プラスミドの...

胎盤は胎児の発育に関与する必須の器官です。胎盤の主な役割は、必須の要素を提供し、胎児との間の栄養素と老廃物の移動を調節することです。哺乳類の胎盤は、胎児と母体の界面を構成する胎児組織と母体組織の両方で構成されているため、母親と胎児の両方の遺伝学が機能に影響を与えます1。胎盤の遺伝的異常または機能障害は、胎児の発育を劇的に変化させる可能性があります。以前の研究では、胎盤の遺伝学と発達が胎児の特定の臓器系の発達の変化に関連していることが示されています。特に、胎盤の異常は、胎児の脳、心臓、血管系の変化と関連しています2,3,4,5。
胎盤から胎児へのホルモン、成長因子、およびその他の分子の輸送は、胎児の発育に大きな役割を果たします6。特定の分子の胎盤産生を変化させると、神経発達が変化する可能性があることが示されています。母親の炎症は、胎盤におけるトリプトファン(TRP)代謝遺伝子発現を変化させることによってセロトニンの産生を増加させることができ、その後、胎児の脳にセロトニンの蓄積を作り出す7。他の研究では、心臓の欠陥と一緒に胎盤の異常が見つかりました。胎盤の異常は、ヒトで最も一般的な先天性欠損症である先天性心疾患の一因となると考えられています8。最近の研究では、胎盤と心臓の両方で同様の細胞経路を持ついくつかの遺伝子が特定されました。破壊された場合、これらの経路は両方の臓器に欠陥を引き起こす可能性があります9。胎盤の欠陥は先天性心疾患を悪化させる可能性があります。胎盤遺伝学と特定の胎児臓器系の発達における機能の役割は、新たな研究分野です。
マウスは、血球胎盤などヒト胎盤の特徴を有しており、ヒトの疾患を研究するための非常に有用なモデルとなっています1。胎盤の重要性にもかかわらず、現在、標的を絞ったin vivo遺伝子操作が不足しています。さらに、現在、ノックアウトまたはノックダウンには、胎盤10の過剰発現または機能獲得操作よりも多くの選択肢があります。胎盤特異的操作のためのいくつかのトランスジェニックCre発現系統があり、それぞれが異なる時点で異なる栄養膜系統にあります。これらには、Cyp19-Cre、Ada/Tpbpa-Cre、PDGFRα-CreER、およびGcm1-Cre11,12,13,14が含まれる。これらのCre導入遺伝子は効率的ですが、特定の時点で一部の遺伝子を操作することができない場合があります。胎盤遺伝子発現をノックアウトまたは過剰発現させるために一般的に使用される別の方法は、レンチウイルスベクターを胚盤胞培養物に挿入することであり、これは絨毛膜特異的な遺伝子操作を引き起こす15,16。この技術は、発生の初期における胎盤遺伝子発現の堅牢な変化を可能にする。生体内でのRNA干渉の使用は、胎盤ではまばらに利用されています。shRNAプラスミドの挿入は、本論文に記載のCRIPSR法と同様に行うことができる。これはE13.5で行われ、胎盤でのPlGF発現を正常に減少させ、子孫の脳血管系に影響を与えました17。
主にノックアウトまたはノックダウンに使用される技術に加えて、過剰発現の誘導は、一般的にアデノウイルスまたは外因性タンパク質の挿入によって行われる。過剰発現に使用される技術は、成功率にばらつきがあり、主に妊娠後期に実施されています。胎盤機能におけるインスリン様成長因子1(IGF-1)の役割を調べるために、IGF-1遺伝子の過剰発現を誘導するために、アデノウイルス媒介胎盤遺伝子導入が行われた18,19。これは、E18.5のマウス妊娠後期に直接胎盤注射を介して実施されました。追加の選択肢を提供し、Cre−Lox併用の失敗、アデノウイルスの毒性の可能性、およびshRNAのオフターゲット効果などの確立された胎盤遺伝子操作の起こり得る失敗を回避するために、胎盤のin vivo直接CRISPR操作を使用することができる20、21、22。このモデルは、過剰発現モデルの欠如に対処し、柔軟性のあるモデルを作成するために開発されました。
この技術はLecuyerらの研究に基づいており、shRNAおよびCRISPRプラスミドをin vivoでマウス胎盤に直接標的化してPlGF発現を変化させました17。この手法は、複数の時点でCRISPR操作を使用して胎盤遺伝子発現を直接変更するために使用できます。この作業では、E12.5が選択されました。胎盤はこの時点で成熟しており、操作するのに十分な大きさであり、E12.5に特定のCRISPRプラスミドを挿入することができ、妊娠中期から後期の胎児の発育に大きな影響を与える可能性があります23,24。トランスジェニックアプローチとは異なり、ウイルス誘導やRNA干渉に似ていますが、この技術は、比較的高度な外科的アプローチを使用して特定の時点で過剰発現またはノックアウトを可能にするため、以前の変化による胎盤形成障害または胚致死の可能性を回避します。同腹仔内で実験プラスミドまたは対照プラスミドを受け取る胎盤はごくわずかであるため、このアプローチでは2種類の内部コントロールが可能になります。これらのコントロールは、適切なコントロールプラスミドを注入およびエレクトロポレーションしたものであり、直接操作を受けないものである。この技術は、相乗的活性化メディエーター(SAM)CRISPRプラスミドを介してマウス胎盤にIGF-1遺伝子の過剰発現を作り出すように最適化されました。IGF-1は胎児に送達される必須の成長ホルモンであり、主に出生前に胎盤で産生されるため、IGF-1遺伝子が選択されました25,26。この新しい胎盤を標的としたCRISPR技術により、胎盤機能と胎児の発育との関係を定義するのに役立つ直接操作が可能になります。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml チューブ</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルメルジド (PFA) PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J61899.AP</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>ス3598BCA</td><td>キット</td></tr><tr><td>用吸収性アンダーパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>活性化制御プラスミド</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジーsc-437275</td><td></td>希釈<td>AMV</td></tr><tr><td>逆転写酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0277LcDNA</td><td>合成麻酔薬に使用</td></tr><tr><td>ガス気化器</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>VADコンパクト気化器</td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Protein Quantification</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000ハンドヘルド</td><td>組織ホモジナイ</td></tr><tr><td>ザーCellSensソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>V4.1.1FISH</td><td>画像への画像処理。</td></tr><tr><td>遠心分離機 5810</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP022628168</td><td>プレート遠心分離機</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J67241-AP</td><td>RNA分離</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>使用前に滅菌</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 コントロールプラスミド</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>sc-418922</td><td>希釈のために提供されるドナーゼフリーの水</td></tr><tr><td>CryoStat</td><td>ライカ</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M125 C</td><td>壊死後のイメージングに使用</td></tr><tr><td>溶解性縫合糸</td><td>Med Vet International</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>(-) Calcium;(-)マグネシウム</td></tr><tr><td>ECM 830 エレクトロポレーター (エレクトロポレーションマシン)</td><td>BTX ハーバード装置</td><td>45-0662</td><td>発電機のみ</td></tr><tr><td>電気カミソリ</td><td>ウォール</td><td>CL9990</td><td>ケントサイエンティフィック</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションパドル/ピンセット</td><td>BTX ハーバード装置</td><td>45-0487</td><td>直径 3 mm パドル; ワイヤー付属</td></tr><tr><td>埋め込みカセット: 250 PK</td><td>グレインジャー</td><td>21RK94</td><td>カセットを埋め込むプラセンタ</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>268280010</td><td></td></tr><tr><td>F-エアキャニスター</td><td>ペン獣医供給株式会社</td><td>BIC80120</td><td>過剰イソフルランフィルター</td></tr><tr><td>ファストグリーンダイ FCF</td><td>シグマ</td><td>F7252-5G</td><td>1 &mu;g / mlおよびフィルター;光から保護する</td></tr><tr><td>フィルターベースのマイクロプレート光度計(プレートリーダー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14377576</td><td>BCAおよびELISA</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>に使用できます VWR</td><td>82027-386</td><td>ファインチップ、ストレート、鋸歯状</td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝、10%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー-ホウケイ酸ガラス(マイクロピペット)</td><td>サッター機器</td><td>B150-86-10</td><td>O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861281</td><td>Protein homogenization buffer</td></tr><tr><td>Heating Pad Heating Pad</td><td>Thermotech</td><td>S766D</td><td>Digitial Moist Heating</td></tr><tr><td>Pad Hemostats</td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>Fully surrated jaw; curved</td></tr><tr><td>Hot Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM Plasmid (m1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-421056-ACT</td><td>Dnase-free water provided for dilution</td></tr><tr><td>Induction Chamber</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>特定のリットルサイズは必要ありません</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Isoproponal/2-Proponal</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>ケタミンHCl 100mg / ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 /塩化マグナイス</td>ム <td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M. タンパク質均質化</td></tr><tr><td>バッファーMicroAmp&trade;バーコード付き光学式384ウェル反応プレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>4309849 バーコードプレート不要</td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーチップ</td><td>エッペンドル</td>フ <td>5196082001 BTX</td><td>マイクロインジェクター</td></tr>に取り付けられる <tr><td>マイクロインジェクター</td><td>BTXハーバード装置</td><td>45-0766</td><td>ステンレス製ピペットホルダー、長さ130 mm、1〜1.5 mmピペット用</td></tr><tr><td>Microject 1000A (射出成形機)</td><td>BTX ハーバード装置</td><td>45-0751</td><td>MicroJect 1000A Plus システム</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー モデル P-97</td><td>サッター装置</td><td>P-97</td><td>フレーミング/ブラウンタイプ マイクロピペットプーラー</td></tr><tr><td>マイクロプレートミキサー(プレートシェーカー)</td><td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>マウス/ラット IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISAキット</td><td>R &Dシステム</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>BD-ベクトン、ディクソン、および会社</td><td>305106</td><td>30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>窒素タンク</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>任意の内部ガス</td></tr><tr><td>非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)</td><td>Norbrook Laboratories Limited</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Meloxicam</td></tr><tr><td>Nose Cone</td><td>Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 mm</td>などの麻酔薬</tr><tr><td>オパール620検出染料</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td></td></tr><tr><td>FISHの最適な切断温度(OCT)のために使用される 化合物</td><td>さくら</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td><td>医療グレードの酸素</td></tr><tr><td>乳棒</td><td>USA Scientific Inc</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Yodine溶液、5%</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>パワーSYBR&trade;グリーンPCRマスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4367659</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー(ランダムプライマー)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S1330ScDNA</td><td>合成に使用</td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>グレインジャー26X080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAクリーンアップキット &コンセントレーター</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope kit v.2.5</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>323100</td><td>蛍光in situハイブリダイゼーションに必要なすべての試薬が含まれています。プローブは別売りです。</td></tr><tr><td>RNAスコープ&トレード;プローブ-MM-PRL8A8-C2</td><td>アドバンストセルズ診断</td><td>&nbsp;528641-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAスコープ&貿易;プローブ-ベクター-dCas9-3xNLS-VP64</td><td>高度な細胞診断</td><td>527421</td><td></td></tr><tr><td>Roto-Therm Mini</td><td>Benchmark</td><td>R2020</td><td>in situハイブリダイゼーション用ドライオーブン</td></tr><tr>は<td>さみ</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>解剖はさみ、鋭い先端、4&sup1;/?</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(生理食塩水)</td><td>Hospra</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>滅菌、&nbsp; 0.9%</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩、二水和物、[クエン酸、二ナトリウム]</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>03-04-6132</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム1N濃縮物、フィッシャーケミカル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS277</td><td>タンパク質均質化緩衝液</td></tr><tr><td>スチーマー</td><td>ベラ</td><td>B00DPX8UBA</td><td></td></tr><tr><td>滅菌外科用ドレープ</td><td>Busse</td><td>696</td><td>使用前に滅菌してください</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>サージパスカバーガラス 24x60</td><td>ライカ</td><td>3800160</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD - ベクトン、ディクソン、カンパニー</td><td>309659</td><td>BD ルアースリップチップ シリンジ 滅菌済み、単回使用、1 mL</td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック&トレード;Invitrogen&trade;ナノドロップ&トレード;WiFiおよびQubit&tradeを備えた1つの分光光度計。4</td><td>Fluorometer Fisher Scientific</td><td>13-400-525</td><td>この構成には、Qubit 4 Fluorometerが付属しています。&nbsp;量子ビットの定量化は必要ありません。</td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>VetBond</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15568025</td><td>1M. タンパク質均質化緩衝液</td></tr><tr><td>TRIzol&trade;試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15596018</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>TSAバッファーパック</td><td>アドバンストセルズ診断</td><td>322810</td><td>オパール620検出色素の希釈に使用</td></tr><tr><td>ユニバーサルF回路</td><td>ベタマック</td><td>40200</td><td>気化器および気化器アクセサリーに取り付けられ</td></tr>ています <tr><td>直立型化合物蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX61VS</td><td>FISHイメージング</td></tr><tr><td>に使用Vectorshield with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Coverslip mounting media</td></tr><tr><td>ViiA&trade; 7 Real-Time PCR System with 384-well Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4453536</td><td>SYBR 384-well block detection.&nbsp;TaqManおよび/または小さなブロックが利用可能</td></tr><tr><td>ウェットアンドワイルドネイルポリッシュ ワイルドシャイン、クリアネイルプロテクター、ネイルカラー</td><td>アマゾン</td><td>C450B</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン 20mg/ml</td><td>アナセド</td><td>343730_RX</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス インビボ 胎盤標的crispr操作

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

胎盤は、 子宮内の哺乳類の発達を調節および維持する重要な器官です。胎盤は、母親と胎児の間の栄養素と老廃物の移動、および成長因子とホルモンの産生と送達に関与しています。マウスの胎盤遺伝子操作は、胎盤の出生前発達における特定の役割を理解するために重要です。胎盤特異的Cre発現トランスジェニックマウスは様々な有効性を有し、胎盤遺伝子操作のための他の方法は有用な代替手段となり得る。本論文では、CRISPR遺伝子操作を用いて胎盤遺伝子発現を直接変化させる技術について述べ、標的遺伝子の発現を改変することができる。比較的高度な外科的アプローチを使用して、妊娠中のダムは胚の12.5日目(E12.5)に開腹術を受け、CRISPRプラスミドはガラスマイクロピペットによって個々の胎盤に送達されます。プラスミドは、各注入後直ちにエレクトロポレーションされます。ダムの回復後、胎盤と胚は後の時点で評価されるまで発生を続けることができます。この技術を使用した後の胎盤および子孫の評価は、発生における時間特異的胎盤機能の役割を決定することができる。このタイプの操作により、胎盤の遺伝学と機能が複数の疾患の状況における胎児の成長と発達にどのように影響するかをよりよく理解することができます。

一般的な手順の結果(図6) この研究では、3つの操作されたグループがありました。これらには、一般的なCRISPR Cas9コントロールプラスミド(Cas9コントロール)、活性化コントロールCRISPRプラスミド(Actコントロール)、またはIGF-1 SAM活性化プラスミド(Igf1-OE)を注入した胎盤が含まれていました。Cas9コントロールはノックアウトプラスミドに適しており、活性化コントロールは過剰発現/活性化プラスミドに適しています。注射およびエレクトロポレーションによる胎盤の操作によって引き起こされる生存率の変化を評価するために、同腹仔内の胚生存をE14.5で分析しました(図6A)。エレクトロポレーションを用いたCRISPRプラスミドのインビボ挿入を行った他の研究が、発現変化が8〜22時間以内に達成できることを示したので、この時点を選択した30、3...

ここでは、マウス胎盤の重要な発生経路を in vivoで効果的に操作するための時間特異的な方法について説明します。これは、CRISPRプラスミドを妊娠ダムの胎盤に注入し、エレクトロポレーションすることによって行われます 12.5.

マウス インビボ 胎盤標的CRISPR操作

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

このプロトコルは、CRISPRを使用したマウス胎盤の時間特異的な標的操作を可能にするため、重要です。これにより、妊娠中期から後期の特定の遺伝子機能を解明することができます。マウス胎盤内で過剰発現を引き起こす遺伝子操作は非常にまれです。この技術の主な利点は、胎盤内のさまざまな遺伝子発現の変化を可能にすることです。予備的な用語にこのテクニックがあっても落胆しないでください。このテクニックは難しいので、習得するには練習するのにかなりの時間が必要です。はじめに、麻酔をかけたダムをノーズコーンで仰臥位に配置し、準備エリアに麻酔を維持します。ダムの腹部を徹底的に剃ります。角膜の乾燥を防ぐために、ダムの両目に人工涙液ジェルを置きます。次に、滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して、少なくとも3ラウンドのポビドンヨード溶液で手術部位を交互に消毒し、続いて70%エタノールとポビドンヨード溶液の最終コートを行います。準備が終わったら、麻酔ノーズコーン付きのダムを指定された手術部位に移動します。子宮開腹術の場合は、ダム仰臥位を手術台に置き、ノーズコーンをテープで所定の位置に固定します。摂氏45度に設定された吸収パッドの下に加熱パッドを置きます。足指挟み逆流のなさで麻酔深度を確認後、鉗子とハサミでテント張りの皮膚から約2センチの正中線を切開します。次に、子宮角からそっとテントを張った滅菌鉗子を使用して腹膜を垂直に切開します。腹部の両側を指で押して両方の子宮角をマッサージしてガイドします。露出した子宮を下腹部の上に置いた滅菌外科用ドレープの上に置き、必要に応じて温かい滅菌生理食塩水滴で湿らせます。子宮が露出したら、操作のために3対の胎盤を選択します。胎盤操作の位置と子宮角内の胚の組織を記録します。コントロールプラスミドの胎盤注射のために、較正されたマイクロピペットを使用して3回の注射に十分な量の適切なコントロールプラスミドをロードします。脱落膜と接合部の間のすべての注射を、胎盤への横方向に約0.5ミリメートルの深さで実行します。注射後、エレクトロポレーションの直前に、接触場所を滅菌生理食塩水でコーティングし、生理食塩水を子宮壁の3つの部位とパドルにスポイトまたはシリンジで正確に塗布します。注入後2分以内に、エレクトロポレーションマシンに取り付けられた3ミリメートルパドルのペアを使用してエレクトロポレーションを行います。CRISPRの取り込み効率と胚の生存率を確保するには、設定を30ボルト、30ミリ秒パルス、2パルス、970ミリ秒パルスオフ、ユニポーラに調整します。エレクトロポレーションパドルを胎盤の外側の子宮壁にそっと押します。アノードパドルを注入部位の上に置き、カソードを真向かいに置きます。エレクトロポレーションマシンのパルスを押し、2つのパルスが完了するのを待ってから、エレクトロポレーションパドルを取り外します。次に、前に示したように実験プラスミドの胎盤注射に進みます。対照群に対して行われたように、注射から2分以内に3つの実験的注射された胎盤すべてのエレクトロポレーションを実行します。胎盤操作が完了したら、指だけで子宮角を直接操作しながら、腹腔内の子宮角を優しくマッサージします。長さ45センチメートルのコーティングおよび編組溶解可能な縫合糸を使用して、13ミリメートル、8分の3の円針合金を使用して腹膜層に中断縫合糸を実行します。腹膜層を縫合した後、腹膜に使用されるのと同じタイプの溶解性縫合糸を使用して、溶解可能な縫合糸で皮膚を縫合します。縫合が完了したら、皮膚の縫合糸に組織接着剤を塗布します。組織接着剤が乾いたら、気化器の電源を切り、ダムを手術エリアから背中の支持ケージに移します。胎盤には、一般的なCRISPR Cas9コントロールプラスミドおよび活性化コントロールCRISPRプラスミドまたはIGF-1 SAM活性化プラスミドを注入した。代表的な剖検後の画像は、どの治療群においても表現型の外観に顕著な損傷または変化を示さなかった。操作された同腹仔の未処理の胚の生存率は平均79.05%に減少しましたが、操作された胚の生存率は平均55.56%に有意に減少しましたが、どのグループの胎盤重量にも有意差はありませんでした。偽手術と比較して、手術直後の母親の体重増加に有意差はなかった。多くの妊娠中のダムは、おそらく手術中および手術後の短時間の摂食障害が原因で、手術の翌日に体重がわずかに減少または変化しなかった。ほとんどのダムはE14.5で重量の増加を示しましたが、時折重量の減少が観察されました。qPCRは、対照胎盤と比較してIGF-1過剰発現胎盤におけるIGF-1発現の有意な増加を示した。E14.5胎盤のELIZA評価では、IGF-1過剰発現胎盤のIGF-1タンパク質レベルが対照胎盤と比較して有意に増加したことが示されました。緑色の自家蛍光は、IGF-1過剰発現胎盤のみで赤色Cas9標識を伴う胎盤母体胎児界面のサブ領域を示し、胎盤の3つのサブ領域すべてでCRISPRの取り込みが成功したことを示しています。C2ハイブリダイゼーション標識における蛍光は、未処理の胎盤への移行を伴わずにIGF-1活性化プラスミドの取り込みを確認した。Prl8a8染色でマークされた赤い接合ゾーンの周囲にある脱落膜ゾーンと迷路ゾーンを特定できました。胎盤と対応する胚の操作の種類と位置を記録することを忘れないでください。子宮角内の子宮頸部と胚の位置を記録することを強くお勧めします。この手順に続いて、胎盤、胚、およびダムの分析を行うことができます。これにより、妊娠、胎盤機能、および胚発生における胎盤特異的な役割の遺伝子をより深く理解することができます。

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学ぶマウス胎盤標的CRISPR操作法。妊娠中期から後期の遺伝子機能解明に有用で、プラスミド注入と電気穿孔により胎盤内遺伝子発現を操作できます。発生生物学研究に応用可能です。

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