研究細胞培養実験室における真菌や細菌による汚染を回避するための細胞培養技術と実践

細胞培養は、管理された実験室環境でさまざまな種類の細胞や組織を増殖させるために必要な繊細なスキルです。細胞培養作業を行う際の主な関心事は汚染です。この汚染は、細菌、カビ、またはマイコプラズマの形で発生する可能性があります。

このビデオで概説されているすべての技術と実践は、細胞が生存可能で健康で汚染のない状態を維持することを保証します。これらの慣行は厳守されるべきであり、すべてのラボ担当者は少なくとも年に一度トレーニングを受ける必要があります。作業を開始する前に、細胞培養室でのみ使用するように指定された清潔な白衣を着用してください。

他の表面に触れていない新しい手袋を着用してください。手袋がしっかりとフィットしていることを確認してください。ニトリルパウダーフリーの手袋が最適です。

白衣と手袋は無菌である必要はありません。作業の準備として、手袋、白衣の袖、生物学的安全キャビネットの内部に70%エタノールをスプレーします。作業面、側面、背面、キャビネット内のアイテム、前面ガラスパネルを内側と外側の両方からスプレーします。

作業面とガラスパネルを糸くずの出ないペーパータオルで拭いて乾かします。キャビネット内にワークスペースを配置するのに少し時間がかかります。細胞培養室内に水浴を保管し、培地の加温や細胞の解凍などの細胞培養目的にのみ使用してください。

水浴は週に一度排水して洗うべきです。キャビネットに持ち込まれるアイテムの量を制限し、前面または背面のグリルを塞いで生物学的安全キャビネット内の空気の流れを妨げないでください。キャビネット内に置かれたすべてのアイテムに70%エタノールをスプレーし、拭いて乾かします。

メディアボトルの上部にスプレーすることから始めて、下に向かって作業します。清潔なペーパータオルで、メディアボトルの上から始めて拭いて乾かし、徐々に下に向かって進んでいきます。キャップに向かって戻らないでください。

これらのキャビネットの仕組みは、部屋とキャビネット自体からフロントグリルとバックグリルから空気を引き出すことです。空気はキャビネットの背面に向かって上部に移動します。そこでは、汚染された空気がフィルターの山を通過し、ろ過された清浄な空気の一部がキャビネット内の作業領域に押し下げられます。

キャビネットが血清学的ピペットを収容するのに十分な大きさである場合、それらは内部に配置することができ、そうでなければ、キャビネットの外側に取り付けられたレセプタクルに保管することができる。使用前に、包装されたピペットの両側に穴、裂け目、または穴がないか確認することをお勧めします。ラッピングをはがさないでください。

代わりに、ラッピングの端をそっとはがします。血清学的ピペットをピペットエイドに挿入し、1回の流体動作でラッピングを取り外します。開いたボトルやフラスコの上にカーソルを合わせないでください。

開いたボトルやフラスコの上に手を伸ばしたり、開いたフラスコの上で作業することはお勧めしません。キャビネット内の空気の流れは、内部のものを押し下げます。手を伸ばすと、スリーブや手袋がアイテムの上に置かれ、スリーブに存在する汚染物を細胞培養に押し込む可能性があります。

可能な限り、液体を注がないでください。代わりに、血清学的ピペットを使用して追加してください。内容物を完全に混合し、ボトルを初期化します。

メディアが補足されているものを書き留めます。付着培養物を使用していて、プラスチックフラスコが必要な場合は、パッケージ全体にスプレーして中に入れます。手袋が乾いたら、もう一度エタノールをスプレーしてください。

接着性細胞株を扱う場合は、オートクレーブ滅菌ガラスピペットまたは使い捨て滅菌プラスチックピペットを使用して、培地または洗浄液を吸引します。保管容器から金属キャップを慎重に取り外します。容器を斜めに静かに振って、1つのガラスピペットを分離します。

容器に手を伸ばすときは、他のピペットに触れないでください。選択したピペットを片端からのみ取り扱ってください。ボトルとフラスコのキャップをできるだけ早く交換してください。

リムが作業面に触れないように、作業面にキャップを逆さまに置きます。キャップを上または下からつかまないでください。代わりに、側面からキャップに触れます。

液体を吸引するときは、キャビネットの外側にある真空トラップフラスコを床の二次容器に入れます。キャビネット内での作業中に廃棄物が発生します。キャビネットに手を出し入れする頻度が高すぎると空気の流れが妨げられるため、キャビネット内に廃棄物を一時的に残しても問題ありません。

作業を中断しないように、横に置いてください。手袋が乾いたらいつでも70%エタノールをたっぷりとスプレーしてください。濡れないように手をこすり合わせます。

血清学的ピペットについての簡単なメモ。彼らが誤ってフード内の何か他のものに触れた場合は、遠慮なく捨ててください。汚染されている可能性のあるピペットを使用するのではなく、清潔な血清学的ピペットで新たに始めるのが最善です。

細胞をインキュベーターに入れる前に、顕微鏡でどのように見えるかを確認してください。単一細胞を観察する必要があります。これは、細胞が完全に再懸濁されたことを示しています。

インキュベーターに話したり、くしゃみをしたり、咳をしたり、激しく吸い込んだりしないでください。インキュベーターのドアをすばやく開閉します。必要以上に長く開いたままにしておくと、空気中に存在する汚染物質がインキュベーターに入る可能性があります。

キャビネットから取り外す前に、すべてのボトルのキャップが完全に閉じていることを確認してください。メディアは光に敏感です。使用しないときは、摂氏4度の暗所で保管する必要があります。

細胞培養作業が終了したら、キャビネットの内部に70%エタノールを再度スプレーし、ペーパータオルで表面を拭いて乾かします。バイオハザード廃棄物バッグを空にします。このプロセスを繰り返し、別の細胞株に切り替えるときに手袋を交換してください。

ガラスフラスコで培養した浮遊培養物を扱うときは、手袋が濡れていることを確認してください。濡れた手袋でアルミホイルに触れてから、フラスコの底にのみスプレーしてから、生物学的安全キャビネット内に置きます。細胞計数用のサンプルを採取する場合は、容器から1.5 mlチューブを1本だけ取り出してください。

他のチューブには触れないでください。キャップを逆さまにして作業面に置きます。内側の縁には触れないでください。

側面から注意して取り扱い、完了したら交換してください。懸濁セルとガラスフラスコを取り扱うときは、フラスコの首全体を覆う二重に折り畳まれたアルミホイルを慎重に取り外してください。四隅すべてをそっと引っ張り、ホイルを逆さまにして作業面に置きます。

ガラスフラスコは下からのみ取り扱ってください。ホイルが外れたら首から触れないでください。1 mlの血清学的ピペットを使用して、細胞計数用のサンプルを採取します。

フラスコの側面にメディアが滴り落ちないようにしてください。もしそうなら、ペーパータオルに70%エタノールをスプレーし、すぐにきれいにしてください。生物学的安全キャビネットからボトルまたはフラスコを取り外す前に、キャップまたはアルミホイルが締められていることを確認してください。

細胞の種類ごとに別々のインキュベーターを使用してください。これにより、異なる細胞タイプの交差汚染を防ぐことができます。キャビネット外の床に液体廃棄物を収集するための真空トラップフラスコを、廃棄物とラベル付けされた二次容器に配置することをお勧めします。

ホースはフィルターに接続されており、毎月交換されます。ホースはキャビネットの側面から入ります。作業が完了したら、バイオハザードのゴミを取り除きます。

シンクのそばの壁にガラス洗浄プロトコルを保管してください。まず、廃棄した細胞を10%漂白剤で約5分間浸します。次に、漂白剤混合物を廃棄し、フラスコを水で十分にすすいでください。

石鹸を水で加え、ブラシでよくこすり、さらに水ですすいでください。そして最後のステップは、右側の蛇口にあるDI水でガラス製品をすすぐことです。ガラスフラスコをできるだけ早く洗い、ガラス製品をよくこすります。

Sf9細胞は、適切にスクラブされていない場合、この死んだ細胞の縁を残します。これらのフラスコは、ガラス洗浄施設に送るのではなく、細胞培養、オートクレーブ細胞培養ガラス器具にのみ使用してください。オートクレーブの真空サイクルを40分の滅菌時間と40分の乾燥時間で使用します。

ラボのメインエリアのガラス製品とは別に保管してください。すべての消耗品が1つのエリアに配置されるように細胞培養室を整理することで、ラボメンバーが消耗品を求めて細胞培養室を出る必要性を最小限に抑えます。細胞を回収するために使用され、その後細胞培養で再利用されるペットボトルには、細胞培養専用のラベルを付けてください。

特定の細胞タイプに指定された細胞培養ボトルを使用してください。これらのボトルは、簡単にアクセスできるように細胞培養室に保管してください。懸濁液で育てられた培養物の場合、カビは培地中の浮遊ボールとして認識されます。

細菌汚染に関しては、それはメディアを白くそして曇らせるでしょう。同様に、接着細胞の場合、カビの汚染はファジーパッチとして簡単に認識できます。細菌汚染は、通常は透明な培地、白と曇りに変わります。

マイコプラズマの多くの種は、PCRベースのアッセイを使用して確実に同定できます。左側のバンドはDNAの分子量基準を示しています。右側の4つのバンドはポジティブコントロールです。

マイコプラズマが検出されなかったため、テストした細胞タイプにバンドは現れません。細胞培養培地は、pHインジケーターが存在する場合、色が赤から黄色に変わります。黄色はpHが低く、培地を交換する必要があることを示します。

細胞カウントの実行中に光学顕微鏡で他の増殖または細胞形状が観察される場合、これは汚染の指標である可能性があります。このタイプの破片は血球計算盤にのみ存在し、細胞培養自体には存在しない可能性があるため、血球計算盤の徹底的な洗浄は細胞計数の前に行う必要があることに注意してください。汚染は細胞培養作業を行う際の主な懸念事項の1つですが、これらのリスクは、このビデオで概説されている慣行と技術に従うことで軽減できます。

毎月マイコプラズマ検査を実施し、ラボ担当者が毎年トレーニングを受け、これらの慣行を厳守すれば、細胞は健康で汚染のない状態を保ちます。これは、高価な細胞培養培地の購入、新しい細胞の購入に関連するコストの削減にも役立ち、インキュベーターの除染ダウンタイムを削減します。細胞培養を成功させる鍵は、そもそも汚染を防ぐための早期の行動であることを忘れないでください。