Name: 神経細胞移植のヒト大脳オルガノイドモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぼう、ヒト大脳オルガノイドを用いた神経細胞移植プロトコル。iPSC由来神経前駆細胞の注入・追跡法により、細胞のエングラフトメントと機能的統合を長期評価できます。創薬研究や細胞治療開発に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

中枢神経系損傷/神経変性疾患の治療のための細胞治療アプローチへの大きな関心を考えると1,2,3,4,5,6,7,8、移植環境における細胞機能のモデルの重要性が高まっています。この論文では、標識されたヒトNPCをヒト大脳オルガノイドに移植する方法と、その生細胞追跡、組織学および免疫蛍光染色によるエンドポイント評価について紹介します。重要なことは、移植された細胞がオルガノイド設定で遊走、分化、および長期(4か月)の持続が可能であることを示したことです。このような長期持続性は、脳スライス培養の保守性よりも顕著に向上する17。したがって、このシステムは、生存、増殖、分化など、潜在的な治療環境で評価する必要がある多くの行動を調べるのに適しています。実際、最近の直交研究では、移植されたNPCは、NSGマウスの脳に移植されたNPCと比較して、大脳オルガノイドで同様の挙動を示すことが示され20、移植レシピエントとしてのオルガノイドの有用性が確認されました。これはin vitroシステムであるため、サイトカインや目的の薬物を添加することも簡単です。これは、炎症や免疫抑制剤などの特定の環境が移植細胞に及ぼす影響をよりよく理解し、治療環境で遭遇する可能性のあるものをさらに模倣するために使用できます。私たちが実証したサイクリック免疫蛍光プロトコール(以前の研究21に基づく)は、このアプローチの力をさらに拡張し、幅広い系統マーカーと潜在的に疾患特異的マーカーを単一のセクションで同時に評価することを可能にし、したがって、移植された細胞と組織への影響を正確に追跡することができます。もちろん、分析の目的に応じて、代わりに他のエンドポイント評価方法を使用することもできます。例えば、細胞の形態が主な関心事である場合は、3D再構成による組織透明化を、特定の細胞タイプの定量化が最終目標である場合は、解離とそれに続くフローサイトメトリーを使用することができます。この方法は、中枢神経系腫瘍などの他の細胞タイプに容易に拡張でき、微小環境に関連する状況での研究が可能になる可能性があると期待しています。同様に、レシピエントとして使用されるオルガノイドは、疾患モデルオルガノイドと交換される可能性があり25、26、27、これらの疾患の移植アプローチのモデル化が可能になる可能性がある。
すべてのモデルと同様に、ここで紹介するモデルにも独自の制限があります。一つには、iPS細胞由来のオルガノイドは発生的に未熟であり19、したがって、多くの神経変性疾患が現れる老化した脳と比較して重要な違いがあります。また、大脳オルガノイドは発生において不均一であり19、したがって、まったく同じ生理学的ニッチへの一貫した注入を妨げている。さらに、それらは関連する脳領域の細胞型を含んでいるが18,19、それらは内皮、ミクログリア、および免疫成分を欠いており、これらはin vivoの設定でも重要である14。これにより、宿主が細胞移植にどのように反応するかの研究が制限されます。現在、血管28細胞とミクログリア29細胞を追加し、オルガノイドの一貫性と局所化18を増加させ、オルガノイド移植システムのモデリング能力を向上させる技術がオンライン化されています。ただし、ここで紹介する以上のテストと最適化が必要になります。このプロトコルは安価で特殊な機器を必要としませんが、注入深さなど、多くの重要な技術的考慮事項が残っています。これは、オルガノイドが灌流されていないため、オルガノイドが大きくなりすぎると壊死中心を持つことが多く19、生細胞追跡のために光がオルガノイドコアを透過できないという事実によるものです。そのため、深く注入しすぎた細胞や、内部で遊走したコロニーを見逃す可能性があります。これは、組織浸透度30のより優れた長波長蛍光色素を使用することで改善できるが、オルガノイドのサイズおよび検出装置によっては、これは引き続き検討事項となる可能性が高い。最後に、脳オルガノイドは発生段階にあるため、注入するオルガノイドの発生段階によって環境が異なる可能性があるため、移植のタイミングも重要な考慮事項です。これは、注射時のオルガノイド年齢を一定にすることである程度制御できますが、考慮が必要な要因であることは間違いありません。
このプロトコルは安価で、シンプルで、動物を使わず、特殊な機器を必要としないため、移植モデリングをさまざまなラボで利用することができます。神経細胞治療とオルガノイドモデルシステムの両方における急速な進歩により、ここで紹介するオルガノイド移植プロトコルは、さまざまな疾患や治療アプローチの有用なモデルとなることが期待されます。

ヒトの脳は、神経系とグリア系の複数の細胞型で構成される複雑な器官です。これらが一緒になって、認知を生じさせる洗練されたネットワークを形成します。外傷性脳損傷(TBI)1,2、神経変性疾患3,4,5,6,7、脳卒中8など、さまざまな神経疾患の治療薬として、このシステムへの細胞移植に大きな関心が寄せられています.しかし、このような戦略の進歩における大きな限界の1つは、予想される移植結果を決定するために利用可能な前臨床モデルが相対的に不足していることです。現在最も使用されているモデルは、細胞電位を決定するためのin vitro培養法とマウスへの異種移植です。細胞培養法は分化と自己複製能を評価できますが9、これらは移植の文脈で細胞が遭遇する微小環境を模倣しない最適な増殖条件下で行われます。さらに、細胞の増殖の仕方も、細胞の挙動に影響を与える可能性がある10。
マウスの脳は微小環境のすべての細胞を含んでおり、移植のための非常に強力なモデルシステムである11。しかし、マウスとヒト皮質の間には重要な違いがあり12,13、すべての成長因子が種間で交差反応するわけではありません。霊長類モデルは、人間のシステムをよりよく模倣し、重要な前臨床結果ももたらした、より緊密な代替手段です14。しかし、これらのより近縁な近縁種でさえ、細胞構成に重要な違いを保持している15。これらのモデルシステムはどちらも、移植中の細胞挙動に関する貴重な洞察を提供し、最終的な治療の外科的要素を組み込んでいますが、不完全なままです。また、コストがかかり、技術的にも困難であるため(つまり、動物に脳外科手術を行わなければならない)、可能なスループットが制限されます。さらに、ヒトの脳細胞を動物に移植することに関連する倫理的問題は山ほどある16。脳スライス培養では、1つの脳を切断して複数の治療に使用することができるため、動物移植の制限の一部が取り除かれます。しかし、これらは寿命(数週間)が限られており、依然として動物由来であり、(薄切りであるため)細胞の注入を模倣するのに十分な体積/表面の完全性を有していない17。したがって、厳密な細胞培養/ポテンシャルモデルとin vivo移植の間には重要なギャップが残っています。
脳オルガノイドは、脳内に存在する主要な神経細胞タイプを含むin vitroモデルであり、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)から大量に生成することができます18,19。したがって、このようなオルガノイドは、移植環境における目的の試験細胞の機能的能力の評価を可能にする細胞状況を提供する。実際、最近の研究では、ヒト大脳オルガノイドに移植された神経前駆細胞(NPC)は、肥満の糖尿病患者であるエベレ複合免疫不全gアンマ(NSG)マウスの脳に移植されたNPCと同様に生存、増殖、分化することが実証されました20。したがって、脳オルガノイドは、ヒトの脳の細胞型を捕捉する、虐待がなく、長寿命(>6ヶ月)で費用対効果の高いシステムです。そのため、神経細胞の再生能力を早期に試験するための理想的な移植レシピエントとなる可能性があります。
この論文では、標識されたヒトNPCをヒト脳オルガノイドに移植し、その後追跡するためのプロトコルを提示します(図1)。これは、GFP標識NPCを成熟した(生後2〜4か月の)脳オルガノイドに注射することから始まります18。その後、移植された細胞に続いて、生細胞蛍光顕微鏡を4ヶ月間にわたって行います。この間、注射部位での細胞の持続性だけでなく、オルガノイドの遠位領域への遊走も示しています。エンドポイントでは、以前の研究に基づいて、既存のAlexaFluorベースの色素を消光して追加の染色およびイメージングラウンドを可能にするプロトコルを含む、これらのオルガノイドに由来する組織学的切片の抗原賦活化、染色、およびイメージングを実証します21。従ってこのプロトコルは移植の設定のセルの微分容量の測定で有用、接木の耐久性、 その場のセル拡張および移植の場所からのセル移動で有用であることができる。これは、再生医療/細胞治療への応用だけでなく、腫瘍細胞を関連する領域特異的なオルガノイドに生着させることによる腫瘍モデリングにも役立つと期待されています。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>タンパク質分解-コラーゲン溶解酵素ミックス</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗 GFP 抗体</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗 MAP2 (クローン SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗 GFAP 抗体 (クローン SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗ネスチン (クローン10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗チューブリン &; β; 3 (TUBB3) (クローン TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td> Biotek-Denanalated <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol (Anhydrous)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxide (DMSO)、滅菌</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>シグマ</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Phenol Red-free, LDEV-free</td></tr><tr><td>MX35 microtome blade&nbsp;</td><td>エプレディア&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>サーモ</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK阻害剤 Y-27632</td><td>アブカム</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp;ステンレス製ベースモールド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp;UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Progenitor Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Neural Induction Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific ShandonFinesse ME ミクロトーム</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Tissue</td><td></td></tr> <tr><td>Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp;AI ティッシュプロセッサー</td><td>Sakura Finetek-Toluene</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(histological)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blue; 0.4% (wt/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

神経細胞移植のヒト大脳オルガノイドモデル

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

細胞移植アプローチの進歩には、移植された細胞の機能的効力を正確に評価できるモデルシステムが必要です。中枢神経系では、異種移植は依然として最先端ですが、そのようなモデルは技術的に困難であり、スループットに限界があり、高価です。さらに、存在する環境シグナルは、ヒト細胞と完全に交差反応するわけではありません。この論文では、ヒト神経細胞をヒト大脳オルガノイドに移植および追跡するための、安価でアクセスしやすく、ハイスループット互換のモデルを提示します。これらのオルガノイドは、市販のキットを使用してヒト人工多能性幹細胞から容易に作製でき、大脳の主要な細胞タイプを含んでいます。 
まず、EGFP標識ヒトiPS細胞由来の神経前駆細胞(NPC)をこれらのオルガノイドに注入することで、この移植プロトコルを実証します。次に、生細胞蛍光顕微鏡法によるオルガノイドにおけるこれらの細胞の増殖を追跡するための考慮事項について説明し、オルガノイドに移植されたEGFP標識NPCの4か月間の追跡を示します。最後に、移植された細胞の局所的な状況での切片化、周期的免疫蛍光染色、およびイメージングのプロトコルを提示します。ここで紹介するオルガノイド移植モデルでは、安価で実施が簡単なプロトコルにより、移植されたヒト細胞をヒト微小環境で直接(少なくとも4か月)追跡することができます。したがって、これは、神経細胞治療(移植)と、中枢神経系(CNS)腫瘍をより微小環境的に正確な方法でモデル化するための有用なモデルである可能性が高い。

大脳オルガノイドの同一性の検証として、成熟した(生後2ヶ月の)大脳オルガノイドの組織学的切片をPAX6(背側NPCのマーカー23)およびSATB2(成熟した有糸分裂後の上層ニューロンのマーカー24)について染色した。予想通り、PAX6+ 細胞はオルガノイドの内部に存在し、SATB2+ 細胞は上層に存在していました(図2)。これらの結果は、使用された大脳オルガノイドが、分化キットで指定されているように、実際に背側前脳であったことを裏付けています。脳オルガノイド移植系の用量依存性を確立するために、生後2か月の脳オルガノイドにEGFP+ iPS細胞由来NPCの数を増やして注入しました。インプット細胞数に対するGFP蛍光の明確な用量依存性が存在し、10,000細胞以上で一貫したEGFP+ 細胞パッチ検出が見られました(図3)。次に、移植されたNPCの持続性と移動性を、移植されたオルガノイドを経時的に追跡することによって評価しました。このために、50,000個のiPS細胞由来EGFP+ NPCを、同じiPS細胞株から作製した生後2〜3か月の脳オルガノイドに移植しました。注入されたオルガノイドとコントロールは、次の3〜4か月間、指定された時点でEGFP陽性の画像化されました。この移植シリーズでは、4か月の追跡期間を通じて注射部位の持続性を観察しました(図4A)。追加のEGFP+ 細胞パッチは移植後9日までに現れ、研究エンドポイント(オルガノイドに応じて3〜4か月)まで持続し、細胞の移動と新しい部位への統合を示しています(図4A)。より高い倍率では、オルガノイドへの長い突起で明確な神経形態が観察され(図4B)、注入された細胞の統合が確認されました。
注入後遅くに注入した細胞の分化状態を決定するために、4ヶ月間追跡されたオルガノイドとそのコントロールを固定し、パラフィン包埋し、厚さ15 μmのスライスに切断し、スライドガラスに取り付けました。次に、スライスを処理し、1回の蛍光染色(EGFP、TUJ1、NESTIN)または2回の連続した染色サイクルでマーカーを添加(MAP2、GFAP)しました。最初の1ラウンド染色では、NPC状態を保持する細胞(NESTIN+TUJ1−)と神経運命に分化した細胞(NESTIN−TUJ1+)の混合物を含むEGFP+細胞が注射部位に存在することが確認されました(図5)。対照オルガノイドと注入オルガノイドの両方で、NESTIN+ NPCはごくわずかしか観察されず(すべてではありませんが、ほとんどが注射部位にEGFP+移植されたNPCでした)、TUJ1+の未熟成熟ニューロンの大部分が観察されました(図5)。2ラウンド染色により、オルガノイドの外側領域の大部分に成熟したニューロン(NESTIN-TUJ1+MAP2+GFAP-)が見られ、中央に向かって未熟なニューロン(NESTIN-TUJ1+MAP2-GFAP−)の領域が明らかになりました(図6A、B)。アストロサイト(NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+)は、注入されたオルガノイドとコントロールオルガノイドの両方に存在し、外縁の周囲に散在していました(図6A、B)。注入したオルガノイドで2ラウンド染色を行ったスライスは、成熟ニューロンの表現型を採用したEGFP+細胞の小さなサテライトコロニーを注入部位から遠く離れたところに示しました(図6B、C)。これらのいくつかは、アストロサイトに近接しているように見えました。しかし、GFAP染色と完全に重複するEGFP+細胞は存在せず、アストロサイト自体を生成するのではなく、隣接していることを示唆しています(図6B、C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> 図1:標識細胞の脳オルガノイドへの移植モデル。 レンチウイルス形質導入による標識細胞の作製、脳オルガノイドへの移植、生細胞イメージングと免疫蛍光法による追跡の概略図。略語:GFP = green fluorescent protein。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> 図2:初期および後期オルガノイドの構造を示す組織学的切片の免疫蛍光法。 生後2ヶ月の脳オルガノイドを固定し、パラフィン包埋し、スライスし、PAX6、SATB2、およびDAPIで染色しました。未染色の切片を使用して、自家蛍光による偽陽性シグナルを回避するための曝露時間と積分時間を設定しました。PAX6+細胞はオルガノイドの内部に存在し、SATB2+細胞は上層に存在した。Zスタック画像は、15μmの組織切片全体にわたって4.2μmごとに撮影されました。光学セクションは、Gen5ソフトウェアのフォーカススタッキングオプションとデフォルトオプションを使用して結合されました。スケールバー = 100 μm。略語: PAX6 = ペアボックス6タンパク質;SATB2 = 特殊なATリッチ配列結合タンパク質2;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> 図3:NPCの脳オルガノイドへの用量依存的な生着。 オルガノイドには、0個(ネガティブコントロール)、1,000個、5,000個、10,000個、または50,000個のGFP+ iPS細胞由来NPCを移植しました。移植後1週間で、オルガノイドをGFPフィルターキューブでCytation 5にイメージングしました。ネガティブコントロールを使用して、自家蛍光を最小限に抑えるための曝露時間と積分時間を設定しました。色が濃いほど、ネガティブコントロールよりもEGFP蛍光が多いことを示します。スケールバー = 100 μm。これらはオルガノイド全体の4倍画像です。イメージング後、オルガノイド全体のバックグラウンド強度の変動を補正するために、表示前にピクセル半径50のローリングボールバックグラウンド減算を行いました。生着が最も高い領域として特定された注射部位は、生着が存在した場所に赤い矢印で示されます。略語:NPC =神経前駆細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;EGFP = 増強GFP;iPS細胞=人工多能性幹細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> 図4:蛍光生細胞イメージングによる移植細胞の増殖、遊走、および持続性の追跡。 (A)コントロールオルガノイドと移植オルガノイド(50,000 GFP+ iPS細胞由来NPC)に続いて、2つの独立した移植セットから2〜4か月にわたって蛍光生細胞イメージングを行いました。ネガティブコントロールオルガノイドを使用して、各時点での自家蛍光を最小限に抑えるための曝露時間と積分時間を設定しました。EGFP画像は、移植後の指示された時間にCytation 5のGFPフィルターキューブを使用してキャプチャされました。色が濃いほど、その時点のネガティブコントロールと比較してEGFP蛍光が多いことを示します。オルガノイド全体の変動するバックグラウンド強度を補正するために、表示前にピクセル半径50のローリングボールバックグラウンド減算を行いました。オルガノイドを各時点でほぼ同じ向きに配置し、表示の一貫性を確保し、移植された細胞増殖を明確に示すために画像を回転させました。最も早い時点で生着が最も高い領域として特定された注入部位は、赤い矢印で示されています。ネガティブコントロールオルガノイドの例を図の下部に示します。(B)移植後1週目および15週目に生着したオルガノイドからの例20x画像を示す。局所的なコントラストは、神経突起の視認性を確保するためにFIJIを使用して表示する前に強化されました。スケールバー = 100 μm。略語:NPC =神経前駆細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;EGFP = 増強GFP;iPS細胞=人工多能性幹細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> 図5:組織学的切片の免疫蛍光法により、注射部位に移植されたNPCの持続性、遊走および神経分化が明らかになりました。 (A)非注入オルガノイドおよび(B)移植オルガノイドからのシングルチャンネル蛍光画像。右のオーバーレイ画像は、対象となる3つのチャンネル(NESTIN、TUJ1、EGFP)を示していますが、DAPIは含まれていません。表示の最小値は、ネガティブセルからのシグナルのみを除外するように設定しました(非注入コントロールからの EGFP と、既知のマーカーの組み合わせに基づいて他のチャネルについて決定)。表示の最大値は、任意の細胞でその抗体について観察された最高のシグナルに基づいていました。直接比較できるように、非注射オルガノイドと移植オルガノイドの間で表示範囲を一定に保ちました。スケールバー = 100 μm。略語:NPC =神経前駆細胞;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TUJ1 = β-IIIチューブリン;EGFP = 増強された緑色蛍光タンパク質。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> 図6:組織切片の周期的免疫蛍光法を用いた生着細胞の分化状態と局在化の評価。 非注入オルガノイド、(A)年齢一致オルガノイド、および(B)移植オルガノイドからのシングルチャンネル蛍光画像が、示されているように、1回目と2回目の染色に示されています。表示の最小値は、ネガティブセルからのシグナルのみを除外するように設定しました(非注入コントロールからの EGFP と、既知のマーカーの組み合わせに基づいて他のチャネルについて決定)。表示の最大値は、任意の細胞でその抗体について観察された最高のシグナルに基づいていました。表示範囲(およびもちろんイメージングパラメータ)は、直接比較できるように、コントロールオルガノイドと注入オルガノイドの間で一定に保たれました。スケールバー = 100 μm。各オルガノイドの染色ラウンドごとに重ね合わせた画像(DAPIを除く)を右側に示します。(B)画像レジストレーションを行った注入オルガノイドについては、すべての画像を両方の染色ラウンドで観察された領域にトリミングします。(B、C)注入されたオルガノイドの場合、EGFP+ 細胞領域は青色の輪郭で囲まれています。(C)は、画像登録時にDAPIを使用して特徴を照合する方法の図を示し、その後に登録された画像の全体的なマージを示します。略語:DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TUJ1 = β-IIIチューブリン;EGFP = 増強緑色蛍光タンパク質;MAP2 = 微小管関連タンパク質 2;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>クローン</td>
			<td>蛍光色素</td>
			<td>濃度</td>
		</tr><tr><td>抗NESTIN</td>
			<td>セッションID: 10C2</td>
			<td>アレクサフルオッ... 594</td>
			<td>1で2,000</td>
		</tr><tr><td>アンチTUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647(アレクサフローア647)</td>
			<td>1で2,000</td>
		</tr><tr><td>抗GFP</td>
			<td>FM264Gの</td>
			<td>アレクサフローア488</td>
			<td>1で200</td>
		</tr><tr><td>アンチGFAP</td>
			<td>SMIの25</td>
			<td>アレクサフルオッ... 594</td>
			<td>1で500</td>
		</tr><tr><td>アンチMAP2</td>
			<td>SMIの52</td>
			<td>アレクサフローア488</td>
			<td>1人に1,000人</td>
		</tr><tr><td>アンチPAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647(アレクサフローア647)</td>
			<td>1で100</td>
		</tr><tr><td>アンチSATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>アレクサフルオッ... 594</td>
			<td>1で500</td>
		</tr></tbody></table>表1:染色用の抗体濃度。 略語:TUBB3 =ベータチューブリンIII;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;MAP2 = 微小管関連タンパク質 2;PAX6 = ペアボックス6タンパク質;SATB2 = 特殊なATリッチ配列結合タンパク質2。

ここでは、標識された神経細胞をヒト大脳オルガノイドに移植および追跡するためのプロトコルについて説明します。

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

細胞治療への関心が高まる中、これらの細胞の機能を評価するための新しい方法が必要とされています。このプロトコルは神経の文脈にこれらのセル移植の生体外の長期査定を可能にする。この手法の主な利点は、すべてのコンポーネントが人間の起源に由来することです。また、生着を簡単に追跡でき、オルガノイドからの環境を簡単に変更できるため、さまざまな薬剤や治療法を試すことができます。このテクニックを実演するのは、私の研究室の優秀な博士課程の学生であるIliana Ibanezです。まず、人工多能性幹細胞またはiPS細胞由来神経前駆細胞(NPC)の単細胞懸濁液を氷から取り出し、300gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを3ミリグラム/ミリリットルの可溶化基底膜マトリックスに再懸濁して、注入あたり2マイクロリットルの最終容量を得ます。使用するまで、すぐにサスペンションを氷に戻します。冷やしたシリンジを摂氏20度の冷凍庫からアイスバケットに移し、さらに使用します。次に、インキュベーターから脳オルガノイドプレートを取り出し、口径の広いチップを使用してオルガノイドを35mmのディッシュに移します。オルガノイドを安定させ、注入を容易にするために、オルガノイドを傷つけることなく培地を可能な限り除去します。オルガノイドが入った35mmの皿を解剖顕微鏡の下に置き、注入を容易にします。オルガノイドを注入する準備ができたら、冷やしたP20ピペットチップを使用してEGFP標識NPC細胞を静かに再懸濁し、これらの細胞の2マイクロリットルを事前に冷却した滅菌スライドガラスに移します。氷からあらかじめ充填されたインスリン注射器を取り出し、針の斜角を下に向けて2マイクロリットルの細胞懸濁液をゆっくりと吸い上げます。オルガノイドが入った皿の蓋を開けてから、顕微鏡の焦点を合わせます。片手で皿を持ち、針の斜角を上に置きます。そしてもう一方の手で、細胞をオルガノイド表面にゆっくりと注入します。細胞を注入した後、蓋を皿に戻し、注入したオルガノイドを1〜2分間インキュベートします。次に、500マイクロリットルのオルガノイド培地をプレートに静かに添加してから、オルガノイドを先端径の広い24ウェルプレートに移します。オルガノイドを摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートし、2日ごとに培地を完全に交換します。非注入またはネガティブコントロールオルガノイドを蛍光顕微鏡にロードします。また、自家蛍光を最小限に抑えるために、照明強度を1〜2、露光時間を80〜100ミリ秒に設定します。次に、ポジティブコントロールオルガノイドをロードし、曝露時間を増やして、標識細胞が見えるようにします。口径の広いピペットチップでオルガノイドを再配置し、注入用の増強された緑色蛍光タンパク質またはEGFP plus領域を見つけます。オルガノイドを装填する前に、培地をオルガノイドから完全に除去します。そして、選択した設定で画像化します。イメージングが完了したら、オルガノイドが乾燥しないように、すぐに新しい培地を追加します。すべてのオルガノイドについて培地の除去とイメージングを繰り返した後、オルガノイドを通常のインキュベーションと培地交換に戻します。希望の間隔でイメージングを繰り返します。トルエンを充填したCoplinスライド染色ジャーにスライドを2分間入れ、このステップを繰り返します。次に、スライドガラスを100%エチルアルコールで満たされたガラス製のCoplinスライド染色ジャーに2分間移します。そして、この手順を繰り返してから、スライドを水で満たされたCoplinジャーに2分間移します。水洗いを繰り返します。次に、プラスチック容器を水浴に入れ、プラスチックが浴槽の底に触れないようにします。プラスチック容器の中にクエン酸緩衝液を注ぎ、摂氏95〜100度にします。緩衝液が希望の温度に達したら、スライドを緩衝液の中に置き、容器を蓋でゆるく覆い、スライドをウォーターバス内に30〜40分間放置します。インキュベーション後、プラスチック容器をウォーターバスから取り出し、室温で20分間冷まします。スライドをPBSでそれぞれ2分間、3回洗浄します。サンプルに触れずに紙ティッシュでPBSを取り除きます。透過処理バッファーを調製し、スライドガラス染色ジャーに充填します。スライドを透過処理バッファーに浸し、10分間インキュベートします。PBSをそれぞれ2分間3回繰り返します。次に、各サンプルを覆うように染色ミックスを調製し、オルガノイドスライドに25マイクロリットルを加えてから、スライドを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSをそれぞれ2分間3回洗浄し、スライドガラス染色ジャー内の蒸留水でスライドをすすぎ、塩を除去します。次に、蛍光顕微鏡を使用してスライドをイメージングする前に、各サンプルに10マイクロリットルの液体マウントとDAPIを追加します。2Xクエンチングバッファーを半分まで充填したガラス製のCoplin染色ジャーに、45ミリリットルのPBSを加え、スライドをこのジャーに入れます。瓶を摂氏4度で一晩インキュベートします。蛍光顕微鏡を使用して、染色とイメージングを繰り返す前に、蛍光色素が効果的に消光されているかどうかを確認します。GFP蛍光の明確な用量依存性は、10, 000細胞以上で一貫したEGFPと細胞パッチ検出で、入力細胞数に存在した。EGFP陽性の画像を画像化した注入オルガノイドとコントロールは、4か月の追跡期間を通じて注入部位の持続性を示しました。追加のEGFP陽性細胞パッチは、移植後9日で出現し、研究エンドポイントまで持続し、細胞の移動と新しい部位への統合を示しました。より高い倍率では、オルガノイドへの長い突起で明確な神経形態が観察され、注入された細胞の統合が確認されました。最初の1回ラウンド染色では、NPC状態を保持する細胞と神経運命に向かって分化した細胞の混合物を含む、注射部位にEGFPプラス細胞が存在することが確認されました。対照オルガノイドと注入オルガノイドでは、Nestin plus NPCはごくわずかしか観察されず、TUJ1と未熟な成熟ニューロンが大半を占めました。2つの円形染色により、より詳細が明らかになり、オルガノイドの外側の領域の大部分の周囲に成熟したニューロンがあり、中央に向かって未熟なニューロンの領域が明らかになりました。アストロサイトは、注入されたオルガノイドとコントロールオルガノイドに存在し、外縁の周囲に散在していました。注入したオルガノイドで2つの円形染色を行ったスライスは、成熟ニューロンの表現型を採用したEGFPプラス細胞の小さなサテライトコロニーを注入部位から遠く離れたところに示しました。これらのコロニーのいくつかは、アストロサイトの近くにあるようです。しかし、GFP染色と完全に重複するEGFPプラス細胞は、アストロサイト自体を生成するのではなく、隣接していることを示唆していませんでした。オルガノイドを注入するときは、オルガノイドを完全に破壊する可能性があるため、力を入れすぎたり、速すぎたりしないようにする必要があります。そのため、ライフトラッキング後、オルガノイドを関連付けて、フローサイトメトリー解析やシングルセルシーケンシングアプローチに使用することができます。これにより、細胞の分子状態を知ることができます。この技術は、神経変性疾患の細胞治療の進歩や、脳腫瘍や転移のモデル化に非常に役立つ可能性があります。

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Palma-Tortosa, S., et.al.ヒト幹細胞移植と検証のためのex vivoモデルとしての成人ヒト皮質の器官型培養J. Vis.

幹細胞由来の神経前駆細胞のヒト皮質スライスへの移植

出典: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation.J. Vis. 経験。(2023年)このビデオでは、細胞とマトリックスの混合物を使用して、蛍光標識された神経前駆細胞(NPC)をヒト脳オルガノイドに注入する方法を示します。この方法は再現性があり、動物を含まないため、オルガノイドの破壊を最小限に抑えた移植が可能です。これは、神経移植と中枢神経系 (CNS)...

移植モデリングのためのヒト脳オルガノイドへの蛍光神経前駆細胞の注入

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。...

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。...

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

本研究では、標準的なフィーダーフリーhPSC培養を用いた、シンプルでありながら堅牢な皮質オルガノイド培養システムのための詳細な技術を提供する。これは、...

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

このプロトコルは、人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo...

ヒト幹細胞移植および検証のための ex vivo モデルとしての成体ヒト皮質の有機型培養

霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションは、霊長類(病原)生理学的新皮質の発生に近いモデルシステムにおいて、異なる前駆細胞タイプおよびニューロンに一過性の遺伝子改変を導入するための正確かつ効率的なアプローチを提供します。これにより、神経発達および進化過程の研究が可能になり、疾患モデリングにも適用できます。...

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

ここでは、複数の成熟段階にあるヒト脳オルガノイドをニワトリの絨毛膜膜(CAM)に生着させるプロトコルを紹介します。脳オルガノイドは、ガイドなしで標準化されたプロトコルに従って増殖しました。...

寛容なニワトリ胚絨毛膜への初期の非誘導ヒト脳オルガノイド神経血管ニッチモデリング

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。...

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

学ぼう、ヒト大脳オルガノイドを用いた神経細胞移植プロトコル。iPSC由来神経前駆細胞の注入・追跡法により、細胞のエングラフトメントと機能的統合を長期評価できます。創薬研究や細胞治療開発に応用可能です。

神経細胞移植のヒト大脳オルガノイドモデル

さらに動画を探す