修飾酵素結合免疫吸着アッセイを用いたヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の検出と定量(英語)
2023年6月16日
ヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)濃度に関する公表されたデータは一貫していません。.これらの不一致は、この神経ペプチドを定量するための標準化された検証済みの方法論の欠如が原因である可能性があります。ここでは、ヒト血漿中のCGRPを精製および定量するための検証済みの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。
この修正されたELISAプロトコルにより、ヒト血漿中のCGRPの精製と正確な定量が可能になります。必要な検証実験を経ており、将来の定量化手法の標準化に役立ちます。このプロトコルは、プロテアーゼの大幅な分解前のサンプル処理、固相抽出による精製、およびマイクロタイタープレートへのブロッキングバッファーの適用による非特異的結合の制限を含むという利点を提供します。
CGRPは片頭痛の病態生理学において懲罰的な役割を果たし、おそらくバイオマーカー状態の候補です。また、心臓病学、皮膚科、ウイルス、さらにはCOVID-19関連の疾患プロセスにも関与しています。まず、標準的な静脈穿刺法で肘前静脈から5ミリリットルの全血を6ミリリットルのバキュテイナーEDTAチューブに集めます。
標的ペプチドの溶解を阻止するために、0.5ミリリットルのアプロチニン競合セリンプロテアーゼ阻害剤を添加する。チューブを10回反転させ、次のステップまで氷上に保管します。次に、チューブを600 4gで摂氏4度で4分間遠心分離します。
そして、血漿画分を2ミリリットルの丸底滅菌クライオバイアルに移す。クライオバイアルを摂氏マイナス80度で最大2週間すぐに保管してください。血漿サンプルを抽出するには、15ミリリットルの円錐形遠心管内に抽出カートリッジを置きます。
5ミリリットルの100%メタノール、次に10ミリリットルの超純水をカートリッジに通して作動させます。流体は、重力駆動の流れによってカートリッジを通過するときにチューブに集められます。カートリッジがカートリッジを飲み込まないように、蓄積した余分な液体を廃棄し、実験中に乾燥しないようにします。
250マイクロリットルの血漿を750マイクロリットルの4%酢酸で希釈し、ゆっくりとカートリッジに通します。次に、カートリッジを10ミリリットルの酢酸で洗浄します。余分な液体が除去されたら、カートリッジを新しい15ミリリットルの円錐形遠心管に移します。
3ミリリットルのメタノール酢酸溶液を調製して、カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたはCGRPを溶出する。そのうち1ミリリットルをカートリッジに通し、各溶出の間に25分間待ちます。最後の溶出後、チューブには3ミリリットルの総溶離液が含まれています。
1ミリリットルの溶離液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ミニ遠心分離機で1秒間回転させて溶離液を沈降させます。次に、1, 400 RPMおよび摂氏4度の真空遠心分離機でサンプルを乾燥させます。アッセイの直前に、乾燥したサンプルを解凍した酵素免疫測定法またはEIAバッファーで再構成する。
プレートブロッキングのために、250マイクロリットルのTBS魚ゼラチンブロッキングバッファーを各ウェルに加えます。プレートの上にカバーシートを置き、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーシートをはがし、プレートをひっくり返して空にします。
次に、プレートをペーパータオルで拭き取り、微量の液体を捨て、層流フードで10分間乾燥させます。プレートが目に見えて乾いたら、シリカゲル乾燥剤サシェ付きのグリップシールホイルポーチに入れます。マイナス20°Cで24時間保管してください。
アッセイを実行する前に、すべてのサンプルと調製した試薬を室温で解凍します。ブロックプレートのウェルをすすぐには、300マイクロリットルの洗浄バッファーを追加し、30秒間放置します。その後、洗浄バッファーを廃棄し、すすぎを5回繰り返します。
最後のすすぎの後、前に示したようにプレートを吸い取ります。次に、100マイクロリットルのEIAバッファーを専用の2つの非特異的結合またはNSBウェルに分注します。100マイクロリットルのCGRP標準物質を追加し、続いて再構成されたサンプルと品質管理を適切なウェルに複製します。
ブランクウェルを除く各ウェルに100マイクロリットルのCGRPトレーサーを追加します。最後に、透明なカバーシートを使用してプレートを密封し、サンプルと試薬が蒸発しないようにし、プレートを摂氏4度で16〜20時間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、製造元の指示に従ってエルマン試薬を準備します。
プレートをデカントしたら、前に示したように各ウェルを3回洗浄します。最後のすすぎの後、プレートを120 RPMで2分間振ってください。もう一度、プレートを3回すすぎ、吸い取って乾かします。
液体がウェルから目に見えて除去されるまで、逆さのプレートをタップします。次に、ブランクウェルを除く各ウェルに200マイクロリットルのエルマン試薬を追加します。プレートが覆われたら、光にさらされないようにアルミホイルで包み、吸光度を記録する前に室温で1時間暗所でインキュベートします。
本研究は、ブロッキングステップの追加により、各CGRPスパイクサンプルにおける回収率が許容範囲内であったことを実証した。しかし、ブロッキングステップを除外した場合、非特異的結合により回収率が上限の125%を超えるCGRP分解を制限するために、採取直後に血液サンプルを保持するためにアプロチニンを添加することが重要です。さらに、ブロッキングバッファーをELISAの前にマイクロタイタープレートに追加して、非特異的結合をさらに減らす必要があります。
したがって、このプロトコルは、片頭痛および前庭片頭痛の血漿患者のCGRPのレベルを定量化することにより、前庭片頭痛のバイオマーカーとしてのCGRPの候補を対照と比較するために利用できます。
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概要
本記事では、ヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）の精製および定量を目的とした、検証済みの酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）プロトコルを提示します。本手法は、定量プロセスを標準化することで、従来のCGRP濃度データに見られた不整合を解消します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 臨床研究
背景
- CGRPは、片頭痛を含むさまざまな疾患プロセスに関与しています。
- これまでの研究では、CGRP濃度の結果に一貫性がないことが示されてきました。
- 正確な定量をには、標準化された手法が不可欠です。
- 本プロトコルには、プロテアーゼによる分解を防ぐための措置が含まれています。
研究目的
- CGRP定量のためのバリデートされたELISAプロトコルを開発すること。
- 今後のCGRP研究に向けた手法を標準化すること。
- さまざまな疾患におけるバイオマーカーとしてのCGRPの可能性を探索すること。
使用した手法
- 肘正中皮静脈から5 millilitersの全血を採取する。
- 血液採取には6 milliliterのEDTA真空採血管を使用する。
- 精製には固相抽出法を適用する。
- 非特異的結合を抑制するためにブロッキングバッファーを含める。
主な結果
- 改良されたELISAプロトコルにより、正確なCGRP定量が可能になります。
- バリデーション実験により、本手法の信頼性が確認されています。
- このプロトコルは、今後のCGRP研究を標準化するために適用可能です。
- さまざまな疾患におけるCGRPの役割を理解するための潜在的な意義が期待されます。
結論
- 検証済みのELISAプロトコルにより、CGRP測定の精度が向上します。
- CGRP定量法の標準化は、研究成果の改善につながる可能性があります。
- 今後の研究により、さまざまな疾患におけるバイオマーカーとしてのCGRPの探索が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
ヒト血漿中のCGRPを信頼性高く定量することは、片頭痛やその他の疾患におけるトランスレーショナルバイオマーカーとしての適格性を進展させる上で極めて重要です。このバリデーション済みで標準化されたELISAプロトコルは、従来のCGRP測定における不整合を解消し、バイオマーカーの探索および検証の転換点において、より高い予測信頼性を可能にします。標準化された定量法は、初期探索およびトランスレーショナル研究における堅牢なポートフォリオの選別と、試験間の比較可能性をサポートします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 片頭痛および関連疾患におけるメカニズム的バイオマーカー候補としてのCGRPの厳密な検証を可能にします。
- 疾患に関連するニューロペプチドのバリデートされ再現性のある定量化を提供し、生物学的なリスク低減をサポートします。
- ターゲットへの結合およびパスウェイ調節研究における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ELISAベースのアッセイにおいて、血漿サンプルの調製および非特異的結合を最小限に抑えるための検証済みワークフローを提供します。
- アッセイの再現性と標準化を向上させ、下流のスクリーニングおよび定量分析をサポートします。
- 前臨床およびトランスレーショナルな設定におけるCGRP調節化合物の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 患者および対照コホートにおけるCGRPの定量化を可能にし、バイオマーカー駆動型のトランスレーショナルリサーチと整合します。
- 標準化された測定プラットフォームを提供することで、初期の探索から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- バイオマーカーの適格性確認および患者層別化研究におけるリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このプロトコルは、バイオマーカーの探索、ターゲットの検証、およびトランスレーショナルリサーチの接点を統合するものであり、初期の探索から前臨床評価に至るワークフローを支援します。
- 探索生物学：CGRP関連パスウェイの仮説検証およびメカニズムのデリスキングのための定量的なアウトプットを提供します。
- スクリーニング：CGRP調節を標的とした化合物評価のためのアッセイの準備完了状態と再現性を確立します。
- 分析：条件間およびコホート間の比較のための、バリデーション済み定量測定値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：探索段階から前臨床段階にわたるバイオマーカーの一致と連続性を可能にします。
- エンタープライズ再利用：複数の疾患モデルおよび研究にわたるCGRP定量のための、標準化された再利用可能なプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CGRPバイオマーカー研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：血漿ベースのELISAワークフローの標準化、再現性、および拡張性を向上させます。
- 戦略的価値：バイオマーカー駆動型プログラムにおける堅牢なgo/no-go判断と資本効率をサポートします。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けと、CGRP標的アセットの推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 血漿サンプルの取り扱いおよびELISAアッセイの実施に関する専門知識が必要です。
- バリデーション済みの固相抽出およびELISA装置へのアクセスが必須です。
- サンプル処理およびブロッキング工程について、チーム間で厳格な標準化を行う必要があります。
- 異なる血漿マトリックスや疾患コホートに応じて、調整が必要な場合があります。
- プロテアーゼによる分解および非特異的結合に対するプロトコルの感受性は、記載通りに管理する必要があります。
