アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介したナローリーフオオバコの遺伝子形質転換

オオバコ種は、植物血管生物学およびストレス生理学のモデル植物として使用できます。形質転換プロトコルの確立により、これらの植物に関する詳細な研究が可能になり、遺伝子とそれらに関連する表現型との関係を調査できます。この技術の主な利点は、食品を外植片として使用して、ナローリーフオオバコを高効率で変換することです。

はじめに、市販の野生型プランタゴランセオラータの種子を、希望する植物の数に応じて、5ミリリットルマークまで50ミリリットルの遠沈管に入れます。種子を75%エタノールに60秒間浸します。エタノールを捨てた後、チューブを静かに反転させて、新しく調製した20%次亜塩素酸ナトリウムに種子を40分間浸します。

ラミネートフローフードの下で、次亜塩素酸ナトリウム溶液を廃棄し、種子を蒸留水で5回洗浄します。最後のすすぎの後、種子に少量の水を追加します, これはプレートへの植物の移動を助けるのに役立ちます.滅菌鉗子を使用して、発芽する苗の過密を防ぐために、種子をプレートの表面全体に、各種子の間に約1センチメートル均等に広げることにより、種子を固体MS培地で事前に準備されたペトリ皿に移します。

汚染を防ぐために2層のパラフィンフィルムでプレートを密封し、室温で冷たい白いグローライトの下でインキュベートします。実生が発芽し、移すのに十分な大きさになったら、通常は発芽の2〜3日後に、滅菌鉗子を使用し、50〜100ミリリットルのMS培地を含む滅菌箱に苗を移します。箱をサージカルテープで密封します, そして、植物が冷たい白いグローライトの下で約3〜4週間成長するのを待ちます.

目的のプラスミドを含むストリークアグロバクテリウムツメファシエンスを、適切な選択剤とともに調製した固体LBプレート上に配置します。パラフィンシールプレートを摂氏28度で最大48時間、またはバクテリアが摘み取るのに十分な大きさになるまでインキュベートします。インキュベーション後、形質転換の2日前にピペットチップを使用して細菌コロニーを選び、適切な選択剤を含む6ミリリットルの液体LBを含む15ミリリットルの丸底チューブに接種します。

OD 200が摂氏28度の卓上シェーカーで0.6〜0.7に達するまで、0.7RPMで一晩振とうします。細菌が必要なODに達したら、200マイクロリットルの細菌培養物を、選択剤を含む100ミリリットルのLBを含む滅菌フラスコに移します。摂氏28度で200RPMで一晩振とうします。

次に、細菌培養物を50ミリリットルの滅菌遠心チューブに移し、2、200Gで室温で10分間遠心分離して細菌を回収します。上清を廃棄し、ピペッティングにより室温で5ミリリットルの新たに調製した懸濁液またはSSに細菌ペレットを再懸濁する。次に、SSを50ミリリットルマークまで追加し、反転させて数回混ぜます。

植物が形質転換の理想的な段階に達したら、約3週間で、滅菌鉗子とはさみを使用して根を植物から分離し、葉と茎の材料を廃棄します。切断直後に、鉗子を使用して滅菌水の入った箱に根片を無菌的に移し、水分を保ちます。次に、SS懸濁したアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌培養物を滅菌済みの150×15ミリメートルの使い捨てシャーレに注ぎます。

切り取った根を細菌培養物に移し、少なくとも20分間インキュベートします。インキュベーション中に、鋭利な刃の付いた滅菌メスを使用して、根を1センチメートルの断片に切断し、一次根と側根を分離します。次に、根の表面に細い浅い切り込みを入れて、細菌が植物に感染できるようにします。

インキュベーション後、根片を滅菌ペーパータオルに移して余分なバクテリアを取り除きます。次に、乾燥した根を、根のサイズに応じて、プレートあたり約10〜20根の固体共培養培地を含む準備されたペトリ皿に移します。プレートを2層の透明プラスチックフィルムで密封し、次にアルミホイルで密封して、室温で3日間インキュベートします。

3日間のインキュベーション後。共培養培地では、テメチン1リットルあたり500ミリグラムと適切な抗生物質の選択を含む固体シュート誘導培地またはSIMを使用して、根片を準備済みのペトリ皿に移します。透明なプラスチックフィルム密封プレートをグローライトの下で1ヶ月間、または芽が出始めるまでインキュベートします。

小植物が1.5から2.0センチメートルの長さに成長すると。それらを準備された滅菌箱に移します。固体根誘導培地を使用。

根が形成されるまで数週間グローライトの下で植物を育てます.通常、1週間後、根系が移動するのに十分な大きさになったとき、通常1か月の成長後に植物を取り、根を水で穏やかに洗って、根に付着している培地を取り除きます。次に、植物を事前に濡れた万能土壌を含む3.5インチの正方形の鉢に移し、BM sevenは植物をプラスチック製の培養土で覆い、次に透明なビニール袋で覆い、植物が湿気の多い環境にとどまるようにします。

この方法は、根の葉とささいな古い組織でテストされました。予備実験では、すべての組織タイプで無神経を誘発することができましたが、根組織のみがSIMで1か月後にシュートイニシャルを生成し、葉とペダルが茶色に変わって死にました。形質転換組織から出現するシュートイニシャルの進行は、初日から観察された。

根は、芽が根付く準備ができたときにSIMに置かれました。1週間後、根の組織はシュートのイニシャルの初めに無神経質を形成し、観察することができました。シュートは2週目と3週目の間出現し続け、4週間後、シュートは根誘導培地に移される準備ができました。

懲罰的トランスジェニック植物の同定は、芽の長さが約0.5センチメートルになった後に採取された葉セグメントを用いたベータグルクロニダーゼGUS Histochemical アッセイを用いて行った。空のベクターを用いた変換中の野生型は染色パターンを示さない。GUS遺伝子が存在しないため、ベータグルクロニダーゼGUS遺伝子による形質転換は、静脈に明確な青色の染色パターンを示し、植物がトランスジェニックであることを確認しました。 これを防ぐために、手順中に乾燥を防ぐために根を常に水和しておく必要があります。