Name: エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶマウス造血幹細胞のエクスビボ増殖と遺伝子操作法。ポリビニルアルコール培養システムを用いて長期培養と電穿孔による遺伝子導入を実現し、造血機構の研究に応用可能です。

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フローサイトメトリーへのアクセスを提供してくれたWIMMフローサイトメトリーコアと、レンチウイルスベクターの生成にWIMMウイルススクリーニングコアに感謝します。この研究は、Kay Kendall Leukaemia FundとUK Medical Research Councilによって資金提供されました。

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</ol>

著者には利益相反はありません。

このプロトコルが、HSC生物学、造血、および血液学をより一般的に調査するための有用なアプローチを提供することを願っています。FACS精製HSCs8のPVAベースの培養法の最初の開発以来、この方法は拡張されてきた。例えば、この方法は、骨髄および負の表面荷電プレート14で富化されたc−Kitで機能することが示されている。形質導入およびエレクトロポレーションとの適合性も実証されている14,15。これらのHSCおよびc-Kit+ HSPC培養物のin vivo検証はこれらの出版物に記載されていますが、読者はin vivo移植プロトコルに関する他の公開プロトコルを参照できます21。移植後の新鮮なHSPCと培養されたHSPCの間で系統キメラに大きな違いは見られませんが、ex vivo拡張後の個々のHSCの再構成効力は...

造血系は、酸素供給から病原体との戦いまで、特殊な血液および免疫細胞タイプを通じて、哺乳類のさまざまな重要なプロセスをサポートします。造血幹および前駆細胞(HSPC)1によって維持される血液系の恒常性をサポートするためには、継続的な血液産生(造血)が必要です1。最も原始的な造血細胞は造血幹細胞(HSC)であり、これは自己複製および多系統分化のためのユニークな能力を有する2,3。これはまれな細胞集団であり、主に成体の骨髄4に見られ、約30,000細胞に1個の頻度で発生します。造血幹細胞は、生涯にわたる造血をサポートし、血液学的ストレス後の造血を再確立するのに役立つと考えられています。これらの能力はまた、HSCが照射されたレシピエントへの移植後に造血系全体を安定して再構成することを可能にする5。これは、HSCの機能的定義を表しており、さまざまな血液および免疫疾患の治癒的治療法であるHSC移植療法の科学的根拠も形成します6。これらの理由から、造血幹細胞は実験血液学の主要な焦点です。
研究の大きな焦点にもかかわらず、HSCをex vivo7で安定的に増殖させることは依然として困難でした。私たちは最近、マウス造血幹細胞8用の最初の長期生体外増殖培養システムを開発しました。このアプローチは、移植可能なHSCを4週間の培養で234〜899倍拡大することができます。他のアプローチと比較して、プロトコルの主な変更は、血清アルブミンの除去と合成ポリマーへの置き換えでした。ポリビニルアルコール(PVA)は、マウスHSC培養8に最適なポリマーとして同定され、現在では他の造血細胞タイプ9の培養にも使用されています。しかし、Soluplus(ポリビニルカプロラクタム-アセテート - ポリエチレングリコールグラフトコポリマー)と呼ばれる別のポリマーも最近同定されており、クローンHSCの膨張を改善するようです10。ポリマーを使用する前は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン画分V、または組換え血清アルブミンの形態の血清アルブミンが使用されていましたが、これらはHSC増殖のサポートが限られており、短期間(~1週間)のex vivo培養のみをサポートしていました7。しかしながら、HSCを静止状態で保持するHSC培養プロトコルは、より長いエクスビボ培養時間をサポートできることに留意すべきである11、12。
他の培養方法と比較して、PVAベースの培養の主な利点は、生成できる細胞の数と、プロトコルを使用して幹細胞をex vivoで追跡できる時間の長さです。これは、マウスあたりの単離可能なHSCの数が少ない(数千人のみ)ことや、in vivoでHSCを経時的に追跡することの難しさなど、実験血液学の分野におけるいくつかの障壁を克服します。ただし、これらの培養物はHSC増殖を刺激しますが、in vivo HSCプールは主に定常状態で静止していることを覚えておくことが重要です13。さらに、培養物は造血幹細胞に選択的ですが、時間の経過とともに追加の細胞型が培養物とともに蓄積し、移植可能な造血幹細胞は1か月後に34細胞に約1個しか表しません。骨髄系造血前駆細胞は、これらのHSC培養において主要な夾雑細胞型であると思われる8。それにもかかわらず、これらの培養物を使用して、不均一な細胞集団からの造血幹細胞を濃縮することができます(例:c-Kit+骨髄HSPC14)。また、遺伝子操作のためのHSCの形質導入またはエレクトロポレーションもサポートしています14,15,16。不均一な培養HSPC集団からの造血幹細胞の同定を支援するために、CD201(EPCR)は最近、有用なex vivo HSCマーカー10,17,18として同定され、移植可能な造血幹細胞はCD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分に限定されています。
このプロトコルでは、PVAベースのマウスHSC増殖培養を開始、維持、および評価する方法、およびエレクトロポレーションまたはレンチウイルスベクター形質導入を使用したこれらの培養内での遺伝子操作のプロトコルについて説明します。これらの手法は、様々な実験的血液学者にとって有用であることが期待されます。

<table><tbody><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖キット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12764416</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>アップルトンウッズ株式会社</td><td>HC002</td><td></td></tr><tr><td>P3 初代細胞 4D-ヌクレオフェクター X キット</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr>乳<tr><td>棒および乳鉢</td><td>科学実験室供給 限定</td><td>X18000</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACSセパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>VWR International Ltd</td><td>720-2519</td><td></td></tr><tr><td>19 G needle</td><td>VWR International Ltd</td><td>613-5394</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu;mセルストレーナー</td><td>シスメックス</td><td>04-004-2317</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>コーニング</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Kimtechワイプ</td><td>VWR International Ltd</td><td>115-2075</td><td></td></tr><tr><td>LS MACSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &mu;g</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td></td>1081058</tr><tr><td>アニマルフリー組換えマウス幹細胞因子&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-250-03</td><td></td></tr><tr><td>アニマルフリー組換えマウストロンボポエチン</td><td>Peprotech</td><td>AF-315-14</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD117 APC (クローン:2B8)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17-1171-83</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD117 BV421 (クローン:2B8)</td><td>Biolegend</td><td>105828</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD127&nbsp;APC/Cy7 (クローン:A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135040</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD127ビオチン(クローン:A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115914</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD201&nbsp;APC (クローン: eBio1560)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-2012-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD34 FITC (クローン: RAM34)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD4&nbsp;APC/Cy7 (クローン:RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100526</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD4ビオチン(クローン:RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100508</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD45R&nbsp;APC/Cy7 (クローン:RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103224</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD45Rビオチン(クローン:RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD48 BV421(クローン:HM48-1)</td><td>Biolegend</td><td>103428</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD8ビオチン(クローン:53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD8a&nbsp;APC/Cy7 (クローン:53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスLy6G/Ly6C&nbsp;APC/Cy7 (クローン:RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108424</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスLy6G/Ly6Cビオチン(クローン:RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca1 PE (クローン:D7)</td><td>Biolegend</td><td>108108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119&nbsp;APC/Cy7 (クローン:TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Ter119 ビオチン (クローン:TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>CellBINDプレート、24ウェル</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>ネガティブ表面荷電</td></tr><tr><td>CellBINDプレート、96ウェル&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3330</td><td>ネガティブサーフェスチャージ</td></tr><tr><td>カスタム合成 sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>F7524-50ML</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチンコーティングプレート, 96ウェル</td><td>BD Biosciences</td><td>354409</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td><td>Gibco</td><td>51500.056</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61196。AP</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Enzo Life Sciences(UK)Ltd</td><td>EXB-0018</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンAPC / Cy7</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>405208</td><td></td></tr><tr><td>T&uuml;RKSのソリューション</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Mettler-Toledo Ltd</td><td>95015662</td><td></td></tr></tbody></table>

エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

自己複製型多能性造血幹細胞(HSC)は、生涯を通じて造血をサポートし、移植後に血液系全体を再構成する能力があるため、重要な細胞型です。造血幹細胞は、さまざまな血液疾患の治癒的治療を表す幹細胞移植療法で臨床的に使用されています。造血幹細胞活性と造血を調節するメカニズムの理解と、新しいHSCベースの治療法の開発の両方に大きな関心が寄せられています。しかしながら、幹細胞幹細胞の ex vivoでの安定した培養および増殖は、取り扱い可能な ex vivo システムでこれらの幹細胞を研究する上で大きな障壁となってきた。我々は最近、移植可能なマウス造血幹細胞の長期的・大規模拡大を支援できるポリビニルアルコールベースの培養系と、それらを遺伝子編集する方法を開発しました。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入 を介して マウスHSCを培養および遺伝子操作する方法について説明しています。このプロトコルは、HSC生物学と造血に関心のある幅広い実験血液学者に役立つことが期待されます。

造血幹細胞のFACS精製では、c-Kitが豊富な骨髄内で、細胞の~0.2%が若い(8-12週齢)C57BL/6マウスのCD150+CD34-c-Kit+Sca1+系統集団であると予想しています(図1)。ただし、トランスジェニックマウスまたは異なる年齢のマウスは、異なるHSC頻度を示す可能性があります。4週間の培養後、CD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分は~10%になると予想しています(図2)。これらの結果は、c-Kit濃縮骨髄またはFACS精製HSCから開始された細胞培養についても同様である。GFP発現レンチウイルスベクター(20形質導入単位/細胞)による形質導入後、~30%のGFP+細胞が期待されます(図3</stron...

ここでは、 ex vivo ポリビニルアルコールベースの増殖を使用してマウス造血幹細胞培養を開始、維持、および分析するためのプロトコルと、レンチウイルス形質導入およびエレクトロポレーションによってそれらを遺伝子操作する方法を紹介します。

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

このプロトコルは、機能的なマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作を可能にし、造血幹細胞の生物学と造血のより深い理解を可能にします。この技術の利点は、造血幹細胞を長期間のex vivo培養でサポートでき、造血の遺伝学を調べるための遺伝子操作を可能にすることです。この培養システムは、造血幹細胞生物学および造血に関する遺伝子研究、分子研究、生化学的研究を含むさまざまな研究のためのプラットフォーム技術を提供します。トラブルシューティングの表には、この手法で遭遇する一般的な問題の原因と解決策がリストされています。骨髄細胞について読むよりも、骨髄細胞を正しく抽出し、完全な培地変更を実行する方法を示す方がはるかに簡単で効果的です。造血幹細胞(HSC)の抽出を開始するには、糸くずの出ない繊細なタスクワイプを使用して、適切に安楽死させたマウスから新たに分離された骨をきれいにします。約3ミリリットルのPBSを含む乳鉢に追加する前に、骨から筋肉と脊髄を取り除きます。乳棒を使用して、せん断力を最小限に抑えるために骨を粉砕せずに粉砕します。次に、5ミリリットルのシリンジに取り付けられた19ゲージの針を使用して、PBSに放出された大きな骨髄片を分解し、懸濁液を70ミクロンのフィルターを通して50ミリリットルの円錐管に移します。懸濁液が移されたら、骨が漂白されるまで新鮮なPBSでこのプロセスを繰り返します。マウスあたり約30ミリリットルのエンドボリュームを目指し、2匹のマウスが骨髄が見えなくなるまで骨を漂白するために50ミリリットルを目指します。上部に50ミクロンのフィルター、下に15ミリリットルの円錐管を備えた磁気カラムセパレーターの磁石に磁気ろ過カラムを配置して、カラム濃縮の準備をします。次に、細胞をアロフィコシアニン抗c-Kit抗体およびアロフィコシアニン磁気マイクロビーズで処理した後、3ミリリットルの滅菌PBSを50ミクロンフィルターおよび濾過カラムに通す。PBSが通過したら、細胞懸濁液をカラムに通し、その後、毎回3ミリリットルの冷たいPBSを3回洗浄します。各洗浄の後、カラムの滴下が止まるのを待ってから、次の洗浄のためにPBSを追加します。次に、カラムを磁石から取り外し、新しい15ミリリットルのチューブの上に置き、5ミリリットルの冷たいPBSをカラムに追加してから、カラムプランジャーを取り付け、プランジャーを押して細胞を溶出します。本文に記載されているプロトコルに従って、ミリリットルあたり0.5〜100万個の細胞を播種するために必要な数の細胞またはウェルに十分なHSC培地を準備します。次に、c-Kitが豊富な造血幹および前駆細胞(HSPC)をスピンダウンし、ペレットを新たに調製したHSC培地に目的の細胞密度で再懸濁します。細胞をフィブロネクチンコーティングまたは負の表面帯電プレート

ex-vivo-expansion-genetic-manipulation-mouse-hematopoietic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。...

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

造血のための3D培養系は、ヒト臍帯血および白血病骨髄細胞を用いて記述されています。方法は、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた多孔質のポリウレタン合成足場の使用に基づいています。この足場は、細胞の広い範囲に対応するために適応可能である。...

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。...

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。...

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

このプロトコルの目標はヒト以外の霊長類 CD34 を分離、+細胞プライミング骨髄、レンチ ウイルスのベクトルでこれらの細胞の遺伝子変更および自己ホストの注入の製品を準備します。総プロトコルの長さは、約 48...

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

ここで、ex は説明 cd34 陽性から造血幹細胞の体外増幅+臍帯血由来の細胞は、サイトカイン カクテルとバルプロ酸の併用治療します。このメソッドは、いずれかのプリミティブの HSCs...

ひと臍帯血由来 cd34 陽性造血幹細胞の体外増幅+細胞を用いたバルプロ酸

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。...

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo...

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

学ぶマウス造血幹細胞のエクスビボ増殖と遺伝子操作法。ポリビニルアルコール培養システムを用いて長期培養と電穿孔による遺伝子導入を実現し、造血機構の研究に応用可能です。

エクスビボポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

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エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

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