Name: シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ 瞬間凍結肝臓組織からの核単離法。密度勾配遠心分離を用いてマウス・ヒト・非ヒト霊長類の肝臓から高品質な核を抽出し、シングルセルマルチオミクス解析を実現します。

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この研究は、ヘルムホルツパイオニアキャンパス(M.S.、K.Y.、C.P.M.-J.)および計算生物学研究所(C.T.-L.)の支援を受けました。この研究は、AMEDの助成金番号JP20jm0610035(C.P.M.-J.)の支援も受けています。HMGU(I. de la Rosa)のコアゲノミクスとBioinformatics(T. Walzthoeni)のサポート、特にトレーニングとガイダンスを提供してくれたザビエル牧師に感謝します。A.フォイヒティンガー、U.ブッフホルツ、J.ブッシュ、およびHMGU病理学および組織分析コア施設の他のすべてのスタッフの技術的および科学的サポート、およびE-StreifenのスタッフであるJ.ゾーン、R.エルデレン、D.ヴュルツィンガー、および実験動物サービスのコア施設の継続的な科学的サポートと議論に感謝します。TranslaTUM(R. Mishra)とIlluminationex, A DiaSorin Company(P. Rein)のコアファシリティセルアナリシスに感謝しています。I Deligiannis博士の技術サポートに感謝します。M.ハートマン博士、A.シュレーダー博士、A.バーデン氏(ヘルムホルツパイオニアキャンパス)は、法的、管理的、および管理上のサポートの基本でした。

すべての動物実験は、ドイツの動物福祉法およびオーバーバイエルン州政府の規則に従って実施されました。動物の飼育は、ドイツ動物福祉法の§11に従って承認され、指令2010/63 / EUに従って実施されました。
1.ティッシュの準備
<ol><li>生後3ヶ月から22ヶ月の雄C57BL/6Jマウスを頸部脱臼により屠殺する。動物を解剖板の上に置き、四肢をピンで固定し、70%エタノールで腹部を消毒します。</li>
	<li>Treuting et al.16で推奨されているように剖検を行う。<ol><li>腹部を胸郭まで開き、肝臓を視覚化し、鉗子を使用して小葉を刺さずに慎重に肝臓を取り除きます。</li>
		<li>横隔膜を鉗子で保持し、ハサミで接続組織を除去することにより、無傷の肝臓を抽出します。</li>
	</ol></li>
	<li>臓器を冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗い、清潔なペーパータオルで軽くたたいて乾かし、さまざまな目的のために肝小葉をいくつかの部分に切ります:単核分離およびマルチオミクス用のFF。パラフィン包埋用のパラホルムアルデヒド固定(10%PFA)。および/またはさらなる組織学的分析のために最適な切削温度(OCT)コンパウンドに埋め込まれています(図1A)。</li>
	<li>肝臓片をクライオバイアルまたは5 mLスクリューキャップチューブに分注し、すぐに液体窒素で瞬間凍結します。凍結肝臓サンプルを-80°Cで保存し、下流の単核マルチオミクス実験を行います(図1B、C)。 注意: 凍結保存された組織は、-80°Cで数年間安全に保管でき、使用前に必ず-80°Cのドライアイスで輸送する必要があります。</li>
</ol>2. 原子核の分離
<ol><li>ベンチトップ洗浄とバッファーと消耗品の準備<ol><li>作業用ベンチトップとピペットを70%エタノールとRNase除染溶液で洗浄するか、専用のRNaseフリーのベンチトップと材料を使用してください。</li>
		<li>以下に詳述するように、スイングバケットと固定角度遠心分離機、1.5 mL/2 mLチューブ、およびマルチウェルプレートの両方を4°Cにプレチルします。</li>
		<li>ティッシュハンドリングに使用されるRNaseフリーの使い捨てピンセット、使い捨て滅菌メス、およびドライアイス(-60°C)のペトリ皿をプレチルします。</li>
		<li>ダウンスガラスホモジナイザーと乳棒を氷上で予冷します(4°C)。各乳棒(A および B)を5mLチューブに入れて、氷との直接接触および潜在的なRNase汚染を避けます。</li>
		<li>ヨージキサノール培地(IDM)の希釈溶液を調製し(表1A)、それを使用して、60%ヨージキサノールストック密度勾配培地(それぞれ表1B および 表1C)の50%および29%希釈を行う。</li>
		<li>すべてのチューブを事前に冷やします。処理するサンプルごとに、次のチューブを準備します。<ol><li>3本の1.5 mL低DNA結合チューブを準備します(1本はろ過した組織ホモジネート用、もう1本目は250 μLの50%希釈ヨージキサノール溶液、もう1本目はクリーンな核懸濁液用)。</li>
			<li>密度勾配分離用のヨージキサノール溶液の29%希釈液500 μLを含む2 mL丸底チューブを1本準備します。</li>
			<li>核分離媒体-2(NIM-2)およびホモジナイズバッファー(HB)用の15 mLコニカルチューブを1本用意します。</li>
		</ol></li>
		<li>核分離媒体-1(NIM-1)を準備し(表1D)、それを使用してNIM-2(表1E)、続いてHB(表1F)を作成します。両方のRNAse阻害剤は、以下のプロトコルに記載されているように、使用直前に追加してください。</li>
		<li>表1Gに記載されるように核貯蔵バッファー(NSB)を調製する。使用直前に組換えRNAse阻害剤を添加します。FACSソーティングに使用する前に、タンパク質ベースのRNAse阻害剤をNSBに追加します(オプション)。</li>
		<li>ホモジナイザーの最適な洗浄とメンテナンスのために、組織の均質化に続いてDounceホモジナイザーと乳棒を浸すために、滅菌水で500 mLビーカーを準備します。</li>
	</ol></li>
	<li>組織の均質化<ol><li>ドライアイスのペトリ皿の内側にプレチルメスで20〜30 mg(または5 mm3)のティッシュ片を切り取ります。その後、直ちにシャーレを湿氷(4°C)に移す。1 mLのHBを加え、冷たいメスを使用して、1 mLの幅の開口部の先端で簡単に吸引できるように、組織をできるだけ細かく刻みます。 注意: すべての組織/核の移動には常に広いオリフィスチップを使用してください。別の方法として、1 mLのチップを滅菌プラスチックカバー上の滅菌メスで切断して、広いオリフィスを生成することができます(図2A)。</li>
		<li>組織懸濁液を収集し、プレチルド2 mLガラスDounceホモジナイザーに移します(図2B)。</li>
		<li>追加の0.5〜1 mLのHBでペトリ皿を洗い、すべてを氷上に保ちながら残りの組織片をすべて集めます。</li>
		<li>氷の上で緩い乳棒 A でゆっくりと慎重に5ストロークを行います。乳棒を上下に引っ張るときに乳棒のねじれ運動を使用して泡を作成することは避けてください。乳棒がストロークごとにホモジナイザーの上部から下部に注意深く移動することを確認します。</li>
		<li>その後、氷上でタイトな乳棒 B で10〜15回のスローストロークを実行します。泡の作成は避けてください。 注:乳棒 B で10ストロークした後、顕微鏡で核を目視検査して、さらにストロークが必要かどうかを確認することをお勧めします。これを行うには、トリパンブルー染色(トリパンとサンプルの比率が1:1)と手動血球計算盤(例:.、10 μLのトリパンブルーを10 μLの核懸濁液と混合し、顕微鏡下での検査に10 μLの混合物を使用します。 図2C)。</li>
		<li>ホモジネートを50 μmのセルストレーナーでろ過し、プレチルした1.5 mLチューブに移します。結合組織の塊を大量に含むホモジネートには、複数のフィルターやチューブを使用してください。</li>
		<li>ホモジナイザーと使用したフィルターを追加の0.5〜1 mLのHBですすぎ、すべての組織ホモジネートを完全に収集します。密度勾配遠心分離に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>密度勾配遠心分離<ol><li>ろ過したホモジネートを、プレチルした固定角遠心分離機で1,000 × g で4°Cで8分間遠心分離します。</li>
		<li>サンプルを回転させながら、250 μLの50%ヨージキサノール希釈液を含む1.5 mLチューブと、500 μLの29%ヨージキサノール希釈液を含む1本の2 mLチューブを準備します。両方のチューブを氷の上に置いてください。</li>
		<li>遠心分離後、真空ポンプを用いてペレットを乱すことなく上清を吸引する。 注意: 手動ピペッティングを使用すると、最終的な核懸濁液の品質が低下します。</li>
		<li>1 mLのワイドオリフィスピペットチップを使用して250 μLのHBをペレットに加え、非常にゆっくりと再懸濁します。</li>
		<li>250 μLの核懸濁液を、250 μLの50%ヨージキサノール希釈液を含むプレチルド1.5 mLチューブに移し、穏やかに、しかし完全に混合して、25%ヨージキサノール/核懸濁液を生成します。</li>
		<li>500 μLの25%ヨージキサノール/核懸濁液を、500 μLの29%ヨージキサノール希釈液を含むプレチルド2 mLチューブに移します。 注:500 μLの25%ヨージキサノール/核懸濁液は、25%/29%ヨージキサノール混合物が明確な相分離を示すように、500 μLの29%ヨージキサノール溶液の上に穏やかに堆積させる必要があります。.ピペットチップを45°の角度で配置したチューブ壁の側面を使用して、このグラジエントインターフェースを作成します。それ以降、チューブはこの勾配を乱さないように穏やかに取り扱う必要があります。</li>
		<li>ブレーキをオフにした状態で、12,500gのプレチルスイングバケット遠心分離機でチューブを20分間遠心分離します。</li>
		<li>遠心分離ステップが完了する直前に、scRNA-seqパイプラインに進む際にRNAse阻害剤をNSBバッファーに追加します( 表1Gを参照)。</li>
		<li>遠心分離後、真空ポンプを用いてペレットを乱すことなく上清を吸引する。 注意: 手動ピペッティングを使用すると、最終的な核懸濁液の品質が低下します。</li>
		<li>1 mLのワイドオリフィスピペットチップを使用して、ペレットを100〜300 μLのNSBに静かに再懸濁し、核懸濁液を清潔でプレチルした1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>トリパンブルー溶液(トリパンとサンプルの比率1:1)と手動血球計算盤(例:.、10 μLのトリパンブルーと10 μLの核懸濁液を混合し、10 μLの混合物を使用してカウントします。 図2D)。</li>
		<li>得られた核懸濁液を直ちに単核ゲノミクスアッセイに使用します。 注:NSB中の核懸濁液は、フローおよび/またはイメージングフローサイトメトリーによるさらなる分析のために、4°Cで最大1週間冷蔵保存できますが、snRNA-seqまたはsnATAC-seqではできません。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 肝細胞倍数性プロファイリングまたはウェルベースシーケンシングアプローチのための核ソーティング
<ol><li>フローサイトメトリーベースのセルソーティングでは、核懸濁液を50 μmフィルターを通してプレチルド5 mL FACSチューブにろ過します。</li>
	<li>100 μmノズルを備えたフローサイトメトリーソーターを使用してください。FACSチューブをソーターにロードし、サンプルをプレビューします。</li>
	<li>前方散乱領域対側散乱領域(FSC-A/SSC-A)をプロットしてスキャッターゲートから始め、次にヘキスト高さ対ヘキスト領域(核ゲート)、次にヘキスト幅対ヘキスト領域(シングレットゲート)をプロットして、核ソートのゲーティング戦略を設定します。ヘキスト面積ヒストグラム上の核倍数性プロファイルを視覚化します。 注意: ピーク分解能を向上させるには、ヘキストチャネル(450/50)を線形スケールで視覚化します(図3A)。</li>
	<li>96/384ウェルプレートにソーティングするには、液滴遅延を設定し、前述のようにベンジジン基質-西洋ワサビペルオキシダーゼ(TMB-HRP)を用いた比色法を使用してプレートアライメントを最適化します6。</li>
	<li>サンプル冷却とプレートホルダーの両方を4°Cで冷却するように設定し、サンプル回転を300rpmでオンにします。</li>
	<li>単一核を~1 x 105 核/mLのサンプル濃度で、200-500イベント/秒の流速でソートします。</li>
</ol>4. イメージングサイトメトリーによる核内パラメータの目視検査と定量(オプション)
<ol><li>50 μLの核懸濁液を2 ×10 7 核/mLの濃度で含む0.5 mLチューブをロードします。</li>
	<li>アスペクト比とヘキスト蛍光チャンネルに基づいて 全イベント ゲートを設定し、核倍数性プロファイルを視覚化します(図3B)。</li>
	<li>明視野(BF)とヘキスト蛍光チャンネルを使用して、40倍の倍率でサンプルを取得します。</li>
	<li>明視野測定とイメージングサイトメトリーソフトウェアによるヘキスト蛍光強度を使用して、2nおよび4n核を検査および定量します(図3C)。</li>
</ol>5. 単一核RNA-seq、ATAC-seq、またはマルチオームライブラリの構築とシーケンシング
<ol><li>液滴ベースのsnRNA-seqアプローチでは、精製された核懸濁液をマイクロ流体デバイスに直接ロードして、自動並列分配と分子バーコーディングを行います17。</li>
	<li>単一細胞分配装置でマイクロ流体ランが完了した後、ゲルビーズ封入核を収集し、インキュベートし、製造業者のガイドライン17で前述したように洗浄する。</li>
	<li>次のプログラムを使用して、cDNAプリアンプのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)サイクルを11回実行します:98°Cで3分(98°Cで15秒、63°Cで20秒、72°Cで1分)x 11、72°Cで1分、4°Cで保持します。 製造元17で示されているように、エンドリペアとAテーリングステップとアダプター結紮を続行します。その後の最終的な遺伝子発現ライブラリー構築のために、次のプログラムを使用して10回のPCRサイクルを実行します:98°Cで45秒、(98°Cで20秒、54°Cで30秒、72°Cで20秒)x 10、72°Cで1分、4°Cで保持します。</li>
	<li>得られたライブラリを、核あたり~20,000-50,000平均リードの読み取り深度までシーケンスします。</li>
	<li>関節マルチオミクス(RNA+ATAC)液滴ベースのシーケンシングでは、肝核を溶解バッファー中で5分間インキュベートし、次いで1時間タグ付けします(前述の18)。</li>
	<li>タグ付き核をマイクロ流体デバイスに直接ロードして、自動並列分配と分子バーコーディングを行います。</li>
	<li>マイクロ流体ランが完了した後、ゲルビーズ封入核を収集し、インキュベートし、製造業者18によって記載されるように洗浄する。</li>
	<li>次のプログラムを使用して、cDNAプリアンプステップの6つのPCRサイクルを実行します:72°Cで5分、98°Cで3分、(98°Cで20秒、63°Cで30秒、72°Cで1分)x 6、72°Cで1分、4°Cで保持します。</li>
	<li>プリアンプサンプルを35 μL採取し、以下のようにcDNA増幅を行う:98°Cで3分、(98°Cで15秒、63°Cで20秒、72°Cで1分)×6、72°Cで1分、4°Cで保持する。 製造元18 が示すように、エンドリペアとAテーリングステップとアダプター結紮を続行します。その後の最終サンプルインデックスPCRでは、98°Cで45秒(98°Cで20秒、54°Cで30秒、72°Cで20秒)x 15、72°Cで1分、4°Cで保持するように15回のPCRサイクルを実行します。</li>
	<li>ATACライブラリの構築には、40 μLを使用し、次のプログラムを使用してサンプルインデックス作成用の6つのPCRサイクルで増幅します:98°Cで45秒(98°Cで20秒、67°Cで30秒、72°Cで20秒)x 6、72°Cで1分、4°Cで保持します。</li>
	<li>得られたマルチオーム遺伝子発現ライブラリを、核あたり20,000リードペアの最小リード深さに配列決定し、マルチオームATACライブラリを細胞あたり25,000リードペアの最小リード深さに配列決定します(製造元18)。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

単一細胞または単核RNA-seqによって肝臓の細胞組成を解剖することで、肝疾患の発症と進行をより深く理解することができます3、4、5、24。肝臓からの単一細胞単離は時間がかかり、過酷な機械的または酵素的解離を伴うプロトコルが必要です25,26,27。すべての組織が最適な組織解離プロトコルを決定するための体系的な評価、および脆弱な細胞型または核を捕捉するための適切な保存方法を必要とすることは広く受け入れられています28。組織の入手可能性、関心のある疾患、発生段階、またはモデル生物によっては、下流処理用の単核懸濁液の調製が、単一細胞懸濁液を使用するよりも適切な方法論である可能性があります。重要なことに、肝臓では、scRNA-seqとsnRNA-seqが核内mRNAと細胞質mRNAの間に高い相関を示しており、両方のアプローチが相補的な情報を提示することを示唆しています2,3,4,6,29。
この論文は、マウスおよびヒトやマカクを含む他の種からの凍結およびアーカイブされた肝臓サンプルからの標準化された堅牢で再現性のある単核単離を提供します。この方法は、固形飼料と高脂肪食(HFD)を与えられた野生型マウス、およびウェルプレートベースおよび液滴ベースの単核ゲノムアプローチの両方を使用した肝線維症のマウスモデルに使用できます6。この方法は、Krishnaswami et al.30によって脳組織について最初に記述されたプロトコルに依存しており、瞬間凍結肝臓用に調整された追加の変更が加えられています。最適な均質化は、核膜の完全性に悪影響を与えることなく、組織からほとんどの核を解放します。ただし、過度に跳ね返ると、壊れやすい原子核が損傷し、全体的な品質が低下する可能性があります。若年および/または脂肪肝は通常、乳棒Aで5ストローク、乳棒Bで10ストロークのみを必要としますが、老人および/または線維性肝臓は乳棒Bで15ストロークを必要とする場合がありますが、それ以上は必要ありません。したがって、ここに示されている数を超えてストロークを実行することはお勧めしません。過剰に跳ね返ると、単核懸濁液の品質に悪影響を及ぼし、周囲RNAの量を増加させる可能性があります。その後、これにより、ダウンストリームデータ分析中に追加の計算フィルタリング手順を実行する必要が生じる可能性があります。
ここで紹介するプロトコルは用途が広く、若齢(3か月)および老齢(24か月)のマウスのさまざまな肝臓の状態に合わせて調整できます。肝臓のより大きな部分が古い組織、HFD、および線維性組織に必要であることがわかったため、処理に利用できる組織のサイズは、出発生物材料の量が少ない一部のユーザーにとって制限をもたらす可能性があります。ただし、液滴ベースのゲノムアッセイによる即時サンプル処理には、グラジエント精製を強くお勧めします。ウェルベースのアッセイのために核を96ウェル/384ウェルプレートにFACSソーティングする必要がある場合は、グラジエント精製を省略できます。FACSソーティングに推奨される核濃度(~1 ×10 5 nuclei/mL)を得るのに十分な組織サンプルがある場合は、グラジエント精製を実行することをお勧めします。
肝臓は肝細胞の倍数体の性質によって特徴付けられる9が、正常な生理機能および疾患における肝細胞倍数性の役割はまだ明らかではない。倍数性がゲノムの多様性を提供することを示す証拠が増えており31、倍数性が32,33歳とともに増加することはよく知られています。しかし、単核四倍体肝細胞の濃縮は、ヒト肝細胞癌(HCC)の予後不良と臨床的にも関連しています34。同様に、肝細胞の倍数性レベルの変化は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)などの加齢関連の慢性肝疾患に関連しています35,36,37。倍数性は、ゲノムのコピーを2つ以上所有している状態であり、ゲノムの内容をHoechst38などのDNA色素で染色することで探索できます。抽出前にHBに添加されるヘキスト色素は、単離プロトコル中にすべての核を標識します。これにより、フローサイトメトリー装置でUV(350 nm)または紫色(450 nm)レーザーで励起したときのDNA含有量に基づいて、二倍体核と倍数体核を区別することができます。紹介されたゲーティング戦略により、2n、4n、8n、およびそれ以上のレベルにある肝細胞の倍数性を凍結されたアーカイブされた肝臓で調査して、組織機能における細胞の不均一性の役割をよりよく理解することができます1(図3A)。さらに、サイズと体積を含む核形態をイメージングフローサイトメトリーを使用して定量し、核サイズの変化と、倍数性レベルに応じた総数数または遺伝子数の変化を相関させることができます(図3B、C)。
マルチモーダルオミクス測定は、ゲノム構成の複数の層を同時に調査する機会を提供します。共同RNA + ATACマルチオミクスアプローチは、上流の調節因子と下流の代謝遺伝子の調査を可能にし、単一細胞分解能で肝機能に関連する転写ネットワークとクロマチン構造を研究するための包括的なアプローチを提供します。さらに、データのスパース性とシーケンシングコストの削減を説明できる計算方法の進歩により、シングルセルマルチオミクスは、同じセルからの複数のモダリティの評価の先駆者です。この単核分離プロトコルは、発現およびクロマチンデータセットの個別および共同評価と互換性があります。我々は、Stuart et al.23(Signacパッケージ)によって確立された標準パイプラインを使用してデータの品質を説明しましたが、いくつかの利用可能な代替計算方法は、ダウンストリーム分析に簡単に採用できます23、39、40、41。
全体として、単核マルチオミクスは、ここに示されている核抽出プロトコルを実装することにより、非常に少量の出発サンプル材料を使用して、バイオアーカイブされたFFマウス、ヒト、および非ヒト霊長類の肝臓組織の調査を可能にします。この非常に貴重なツールは、肝臓生物学者がさまざまな肝臓の病状の文脈で遺伝子発現とクロマチンアクセシビリティの両方を調査することを可能にします。さらに、さまざまなレベルの肝細胞倍数性と、その結果としての肝小葉内の位置に応じた遺伝子発現の調整により、肝臓の病状におけるそれらの役割が明らかになる可能性があります。したがって、細胞の不均一性の調査は、HCCやNAFLDなどの疾患に対する精密医療と標的介入の開発のための新しい機会を提供すると期待しています。

シングルセルゲノミクスは、肝機能を研究し、健康と病状における細胞の不均一性の影響を評価するために不可欠な方法論に急速になりつつあります1。異なる情報層を同時に測定するための「マルチオミクス」の急速な発展と、堅牢な計算パイプラインの並行拡張は、正常および病気の肝臓におけるこれまで知られていなかった細胞型とサブタイプの発見への道を開いています2。
バイオバンクとアーカイブされた凍結サンプルを探索する可能性は、非実質細胞の役割を再検討して発見する機会を大幅に増加させました3,4,5、および老化中および慢性疾患における倍数体肝細胞の役割を調査する6,7,8,9 .したがって、この論文では、ダウンストリームの一核RNAシーケンシングおよびATACシーケンシング、およびマルチモーダルオミクス(ジョイントRNA-seqおよびATAC-seq)と互換性のある、瞬間凍結(FF)アーカイブ肝臓用の堅牢で再現性のある単核分離プロトコルについて説明します(図1)。
このワークフローにより、酵素解離プロトコルにおいて、細胞サイズや脆弱性に関係なく、肝臓のすべての細胞タイプのトランスクリプトームとクロマチンアクセシビリティを調査できます。貴重なヒトサンプルまたはトランスジェニックマウスからの小さな組織切片(15〜30 mgまたは5〜10 mm3)で実行できます。核単離の高純度を決定することは、核サイズの定量化および測定を含み、これは細胞サイズおよび老化の増加と相関する可能性がある10,11、そしてこの純度は肝細胞倍数性12および細胞サイズ依存性転写機構の両方の分析に関連している11,13,14,15。.さらに、凍結肝臓から分離された核は、肝臓のゾーニングに関する貴重な情報を保持します。ワークフローと組織収集により、単一細胞ゲノミクスデータの検証や、同じ組織および同じ個体からの免疫組織化学や空間トランスクリプトミクスなどのさらなる補完的な分析が可能になります。したがって、このアプローチは、複数の肝疾患状態およびモデル生物に体系的かつ確実に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>10% Tween 20 - 5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー 機器</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>接着性 PCR フィルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー 高感度 DNA 分析</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorter</td><td></td><td></td> 蛍光<td>活性化セルソーティング(FACS)用、例えばBD FACSAria Cell Sorter。</td></tr><tr><td>遠心分離機 5430R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5428000619</td><td>4°Cで冷やして使用。C</td></tr><tr><td>Chromium コントローラー &Next GEM アクセサリーキット</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G シングルセルキット</td><td>10X Genomics</td><td>1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip J シングルセルキット、16反応</td><td>10X Genomics</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM シングルセル 3' キット v3.1、4</td>反応 <td>10X Genomics</td><td>1000269</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td><td>10X Genomics</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td>1 mM Stock Solution and use at 1 & micro;M最終濃度。</td></tr><tr><td>DNA AWAY 表面除染剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10223471</td><td>実験開始前に表面とピペットを拭く</td></tr><tr><td>DNA LoBind チューブ、1.5 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>16628742</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind チューブ、2.0 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>16638742</td><td></td></tr><tr><td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>13527550</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフサーモミキサーCアクセサリー:Smartblock</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13518470</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、アブソリュート(200プルーフ)、分子生物学グレード-100 mL&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10517694</td><td></td></tr><tr><td>フィルター 50 & マイクロ;m、滅菌&nbsp;&nbsp;</td><td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td><td>04-004-2327</td><td>組織と核のサイズに応じてフィルター径を調整</td></tr><tr><td>グリセリン (グリセロール)、50% (v/v) - 1 L</td><td>リッカケミカル カンパニー</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>ハードシェル、384ウェルPCRプレート、薄壁、スカート、クリア/ホワイト</td><td>バイオ・ラッド</td><td>HSP3905</td><td></td></tr><tr><td>ヘレンツハインツABS鉗子</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1131884</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物、10 mg/mL 水溶液</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>光感受性</td></tr><tr><td>イメージングフローサイトメーター</td><td></td><td></td><td>イメージングフローサイトメトリー分析用、例: Luminex Amnis ImageStream</td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11568846</td><td></td></tr><tr><td>KCl (2 M)、RNase-free、100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M)、100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 8-Cap Strip、clear-300 strips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10209104</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 8-Tube Strip、0.2 mL-125 strips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10733087</td><td></td></tr><tr><td>M&ouml;rser 2 mL DOUNCE</td><td>ワグナー &Munz GmbH</td><td>9651632</td><td>使用前にRNaseをザップしてMillQですすいでください</td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td>またはその他のストリップ&チューブミニ遠心分離機</td></tr><tr><td>Neubauer Hemocytometer</td><td>OMNILAB&nbsp;LABORZENTRUM</td><td>5435293</td><td>顕微鏡下で核を視覚化し、カウント</td></tr>します <tr><td>ヌクレアーゼフリー水(DEPC処理されていません)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度グラジエント ミディアム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ RT LTS 1000 &micro;L、ワイドO</td>メト<td>ラートレド</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>ピスティル「A」2mL</td>ワー<td>グナー&ムンツGmbH&nbsp;</td><td>9651621</td><td>RNase ザップし、MillQ ですすいで</td></tr>から <tr><td>Pistill "B" 2 mL</td><td>Wagner &Munz GmbH</td><td>9651627</td><td>RNase ザップして MillQ 使用前にすすぎ</td></tr>ます <tr><td>ポリプロピレン 15 mL 遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>10579691</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン シャーレ、60 mm x 15 mm</td><td>サーモフィッシャー サイ</td><td></td>エンティフィック 10634141 <td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底 5 mL FACS チューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>10100151</td><td></td></tr><tr><td>プロテクター RNase 阻害剤 - 2,000 U</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>3335399001</td><td>キープ イン -20 &deg;</td></tr><tr><td>タンパク質ベースのRNase阻害剤SUPERase&bullを使用するまでのC;In (20 U/&mu;L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM2696</td><td>-20°C;C 使用時まで</td></tr><tr><td>組換え RNase 阻害剤</td><td>Clontech Takara</td><td>2313B</td><td>-20 °C キープC 使用まで</td></tr><tr><td>RNAseフリーのマイクロフュージチューブ - 0.5 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 除染液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9780</td><td>実験開始前に表面とピペットを拭い</td></tr>てください <tr><td>SPRIselect - 60 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B23318</td><td>分量して4°Cで保存してください。C</td></tr><tr><td>スクロース、500 g</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S0389-500G</td><td>1 M ストック溶液を作る</td></tr><tr><td>スワン・モートン 滅菌済み使い捨てステンレス製メス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11798343</td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCI (1M)、pH 8.0</td><td>インビトロゲン</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100、98%、100 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック <td>10671652 10% ストック溶液を作る。4°に保ちます。Cと光から保護します。</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11538886</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td></td><td>ミキサーVWR444-1372</td><td>またはその他のタイプのボルテックス</td></tr></tbody></table>

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

肝臓は、とりわけエネルギー恒常性の維持および生体異物の代謝など、多くの重要な生理学的機能を実行する責任がある複雑で不均一な組織である。これらの作業は、肝実質細胞と非実質細胞の間の緊密な調整によって実行されます。さらに、さまざまな代謝活動が肝小葉の特定の領域に限定されています-肝臓ゾーニングと呼ばれる現象。シングルセルシーケンシング技術の最近の進歩により、研究者はシングルセル分解能で組織の不均一性を調査できるようになりました。肝臓を含む多くの複雑な組織では、過酷な酵素的および/または機械的解離プロトコルが、健康と疾患においてこの臓器を包括的に特徴付けるために必要な単一細胞懸濁液の生存率または品質に悪影響を与える可能性があります。
この論文では、凍結されアーカイブされた肝臓組織から核を単離するための堅牢で再現性のあるプロトコルについて説明します。この方法では、一核RNA-seq、ハイスループットシーケンシングによるトランスポゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ(ATAC-seq)、マルチモーダルオミクス(ジョイントRNA-seqおよびATAC-seq)など、下流のシングルセルオミクスアプローチと互換性のある高品質の核が得られます。この方法は、健康および病気のヒト、マウス、および非ヒト霊長類の凍結肝臓サンプルからの核の単離に成功しています。このアプローチは、肝臓のすべての主要な細胞タイプの偏りのない単離を可能にし、したがって、単一細胞分解能で肝臓を研究するための堅牢な方法論を提供します。

ここでは、一核RNA-seq、ATAC-seq、およびジョイントマルチオミクス(RNA-seqおよびATAC-seq)について、瞬間凍結されたアーカイブされた肝臓組織から核を単離するためのプロトコルを紹介します。

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

この簡単で再現性のあるプロトコルは、健康なマウスモデルマウスモデル肝臓、およびヒトおよび非ヒト霊長類の肝臓から高品質の核を単離するために成功裏に使用されました。この方法は、少量の凍結組織材料のみを必要とする。また、密度グレードのインセンティブは、肝臓のすべての主要な細胞タイプが最終的な核調製で保存された非常にクリーンな核懸濁液を提供します。核抽出のこの方法は、バイオバンクに保存されているバイオアーカイブされたヒト肝臓サンプルに使用できます。事前に冷やしたメスを使用して、ドライアイス上のペトリ皿に置かれた肝臓組織から2230ミリグラムまたは5ミリメートルの立方体片を切り取ることによって、組織の均質化を開始します。すぐにペトリ皿を湿った氷に移し、1ミリリットルのホモジナイズバッファーを加えます。冷たいメスを使用して、できるだけ組織を細かく刻み、1ミリリットルの幅の開口部の先端で吸引できるようにします。組織懸濁液を収集し、事前に冷却した2ミリリットルのガラスダウンスホモジナイザーに移します。追加の0.521ミリリットルのホモジナイズバッファーでペトリ皿を洗浄し、すべてを氷上に保ちながら残りの組織片をすべて収集します。泡を作らずに氷上で緩い乳棒Aでゆっくりと慎重に5ストロークを実行します。乳棒がストロークごとにホモジナイザーの上部から下部に注意深く移動することを確認します。その後、泡を作らずに氷上でタイトな乳棒Bで10〜15回のスローストロークを実行します。完了したら、ホモジネートを50マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、事前に冷却した1.5ミリリットルのチューブに移します。結合組織の塊を大量に含むホモジネートには、複数のフィルターまたはチューブを使用してください。ホモジナイザーとフィルターを追加の0.521ミリリットルのホモジナイズバッファーですすぎ、密度勾配遠心分離の前にすべての組織ホモジネートを完全に収集します。密度勾配遠心分離では、ろ過したホモジネートを1000 Gのプレチルド固定角遠心分離機で摂氏4度で8分間遠心分離します。サンプルを遠心分離している間に、250マイクロリットルの50%ヨージキサノール希釈液を含む1.5ミリリットルチューブと、500マイクロリットルの29%ヨージキサノール希釈液を含む1本の2ミリリットルチューブを準備します。両方のチューブを氷の上に置きます。次いで遠心分離機懸濁液から、真空ポンプを用いてペレットを乱すことなく上清を吸引する。1ミリリットル幅のオリフィスピペットチップを使用して、ペレットを250マイクロリットルのホモジナイズバッファーに再懸濁します。次に、250マイクロリットルの核懸濁液を、250マイクロリットルの50%ヨージキサノールを含む事前に冷却された1.5ミリリットルのチューブに移し、穏やかかつ完全に混合して、25%ヨージキサノール核懸濁液を生成します。次に、500マイクロリットルの25%ヨージキサノール核懸濁液を、500マイクロリットルの29%ヨージキサノール希釈液を含むミリリットルチューブのプレチルドチューブに移す。ブレークをオフに設定して、12, 500 Gのプレチルドスイングバケット遠心分離機でチューブを20分間遠心分離します。遠心分離ステップが完了する直前に、RNA阻害剤を核保存バッファーまたはNSBに追加し、単一核RNAシーケンシングパイプラインに進みます。遠心分離終了後、真空ポンプを用いてペレットを乱すことなく上清を吸引する。1ミリリットル幅のオリフィスピペットチップを使用してペレットを100〜300マイクロリットルのNSBに静かに再懸濁し、核懸濁液を清潔なプレチルド1.5ミリリットルチューブに移します。手動血球計算盤でトリパンブルー溶液を使用して核を数え、得られた核懸濁液をすぐに単一核ゲノミクスアッセイに使用します。フローサイトメトリーベースの細胞ソーティングでは、核懸濁液を50マイクロメートルのフィルターを通して、事前に冷却された5ミリリットルの蛍光活性化セルソーティングまたはファックスチューブにろ過します。サンプルをプレビューする前に、100マイクロメートルのノズルを備えたフローサイトメトリーソーターを使用し、ファックスチューブをソーターにロードします。核の並べ替えのゲーティング戦略を設定し、前方散乱領域と側方散乱領域をプロットしてスキャッターゲートから始め、次にデマの高さとデマ領域、デマ幅とデマ領域をプロットします。デマされた領域のヒストグラムで核倍数性プロファイルを視覚化します。96または384ウェルプレートにソーティングする場合は、液滴遅延を設定し、カラーメトリック法を使用してプレートアライメントを最適化します。サンプルの冷却とプレートホルダーを摂氏4度に設定し、サンプルの回転を300RPMでオンにします。1ミリリットルあたり約10〜5番目の核のサンプル濃度で、毎秒200〜500イベントの流速で単一核を分類します。凍結肝臓から抽出した核の顕微鏡検査は、密度勾配遠心分離ステップが不要な細胞および組織の破片の除去を大幅に促進することを示しました。この方法論は、すべてのレベルの倍数性を維持し、サイトメトリー分析によって検証および定量化されました。核抽出を使用して得られたデータから高品質の指標が観察されました。一様なマニホールド近似と投影は、すべての核と主要な細胞タイプにわたるカウント数を表し、核トランスクリプトームと比較的浅いシーケンシングでのみ自信を持って識別できます。このアプローチにより、生体異物の代謝に関与する肝臓特異的転写因子および下流の標的遺伝子の調査が可能になりました。中心部CYP2E1、および門脈周囲CYP2F2などの特徴的な遺伝子の相補的なパターンは、抽出された核が肝臓提供に関する重要な情報を保持していることを示しました。RNAの遺伝子発現ライブラリーは核当たり44, 600リードの深さまで配列決定され、ATACライブラリーは核当たり43, 500リードの深さまで配列決定された。SeuratパッケージとSignacパッケージを使用して、RNAとATACの両方のモダリティの複数の測定に対して実行された重み付き最近傍分析により、細胞サイズや核の脆弱性による顕著なバイアスなしに、主要肝細胞とマイナー肝細胞タイプの識別と注釈が可能になりました。上流の転写調節因子と肝提供の特徴遺伝子もこの方法で検出されました。乳棒を上下に動かすときに、ダウンの均質化中に気泡をあまり作成しないようにし、プロトコルに示されているストローク数に固執することが重要です。

isolation-nuclei-from-flash-frozen-liver-tissue-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、新鮮な凍結神経膠腫組織から単一核を分離するプロトコルについて説明しています。単離された単核は、一核RNA(snRNA)シーケンシングやsnATAC(Single-nuclei Assay for Transposase-Accessible...

新鮮凍結神経膠腫組織からの核の単離:神経膠腫腫瘍サンプルから無傷の核を得る方法

この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。...

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。...

単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離

ここでは、髄質腎細胞タイプの表現を改善し、酵素組織解離による遺伝子発現アーティファクトを回避する凍結マウス腎臓から高品質の核を単離するためのプロトコルを提示します。...

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。...

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

この研究では、下流の単一核RNAシーケンシングのために、凍結した哺乳類組織から高品質の核を単離するための、シンプルで迅速、かつ部分的に自動化されたプロトコルについて説明しています。...

単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

単一細胞/単一核のトランスクリプトミクスおよびマルチオミクスの成功は、細胞/核の品質に大きく依存します。したがって、組織からの細胞/核の分離とその精製は高度に標準化されなければなりません。このプロトコルは下流の単一核のmultiomeの試金のための頭脳および骨髄からの核の準備を記述する。...

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのための固形腫瘍標本からの核の分離に信頼性が高く最適化されたアプローチを提供し、組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離された核の評価に関する推奨事項を含みます。...

マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)

凍結保存された人工多能性幹細胞由来の間質/内皮および血液細胞タイプから高品質の核を抽出するためのプロトコルについて説明し、単一核の次世代シーケンシング解析をサポートします。高品質で無傷の原子核を作製することは、マルチオミクス実験にとって不可欠ですが、研究室によってはこの分野への参入障壁となることがあります。...

凍結保存されたIn Vitro由来血液細胞からの核分離

学ぶ 瞬間凍結肝臓組織からの核単離法。密度勾配遠心分離を用いてマウス・ヒト・非ヒト霊長類の肝臓から高品質な核を抽出し、シングルセルマルチオミクス解析を実現します。

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

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