オオムギのイネいもち病(Magnaporthe oryzae)の初期感染部位を基礎顕微鏡とスマートフォンで可視化
March 17th, 2023
これは、最小限の試薬と一般的な実験装置(基本的なスマートフォンを含む)を使用した大麦葉鞘アッセイの簡単なプロトコルです。目的は、高度な顕微鏡装置にアクセスすることなく、実験室でいもち病の初期感染プロセスを視覚化することです。
私たちのプロトコルは、研究者が高価な機器を使用せずに野生型および遺伝的真菌変異体の早期感染ステップを視覚化できるようにする簡単な方法です。この技術の主な利点は、複雑な生物学的質問に答えるための基本的な実験用品の使用、およびさらなる分析のための真菌変異体の迅速なスクリーニングです。この技術の難しい部分は、シースの処理です。
シースは細胞の薄い層であり、損傷しやすいため、実験を成功させるには慎重な取り扱いが不可欠です。はじめに、2番目の葉の段階まで成長した大麦を選択します。そして、滅菌ハサミを使用して、土壌線のすぐ上で大麦植物を切ります。
鉗子とメスを使用して、縦方向に開いている最初の葉の鞘を慎重に切ります。そして鉗子を使って、2枚目の葉の付け根からそれを取り除きます。メスを使用して、最初の葉の大部分を鞘から切り取り、取り付け用の葉組織を0.5インチだけ残します。
プレート内の湿度を維持するために、濡れたペーパータオルを含む滅菌済みの60ミリメートルのペトリ皿に最初の葉を平らに置きます。葉の組織をペトリ皿の底にテープで留めます。9〜12日齢のマグナポルテオリゼ培養プレートを選択し、0.5〜2ミリリットルの滅菌水を加えます。
滅菌接種ループを使用して、菌糸体を静かにこすり、付着した分生子を解放します。分生子懸濁液をチーズクロスの小片を含む微小遠心チューブに注意深くピペットで入れ、分生子懸濁液から大きな菌糸体をろ過します。必要に応じて、胞子濃度を滅菌水で1ミリリットルあたり10〜4番目の胞子の5倍に希釈します。
シースのサイズに応じて、ロールリーフシースの内側に25〜50マイクロリットルの分生子懸濁液を慎重にピペットで入れます。次に、4〜5個の500ミリリットルビーカーに二重蒸留水を入れ、蒸すまで加熱します。ペトリ皿の蓋を蒸しビーカーの1つにかざして、プレート内の湿度を閉じ込めます。
感染した葉鞘プレートを積み重ね、胞子が発芽するための湿った湿った環境を作り出すため、残りの熱いビーカーで囲みます。このセットアップを無地のゴムまたはプラスチックの箱で覆い、48時間またはイメージングに必要な時点まで邪魔されないようにして、このセットアップを光から保護します。新たに希釈した45%酢酸と0.1%トリパンブルーを混ぜて染みを準備します。
1ミリリットルの色素溶液を微量遠心チューブに分注します。メスを使用して、葉鞘をテープから慎重に切り取ります。鉗子を使用して、シースをマイクロ遠心チューブに入れ、染料溶液に完全に沈んでいることを確認します。
染料が葉に浸透するように、チューブを摂氏40度のヒートブロックまたは水浴に2時間放置します。次に、葉鞘を60%新鮮なグリセロールで3回慎重にすすぎ、余分な染料を取り除きます。スライドに取り付ける準備ができるまで、シースをグリセロールに保ちます。
シースをきれいなスライドガラスの上に置き、60%グリセロールを数滴加えます。解剖顕微鏡と2対の鉗子を使用して、接種した中心を上に向けて慎重に鞘を広げます。鉗子でシースを開いたまま、カバースリップを上に置いて、シースがカールして感染部位を塞ぐのを防ぎます。
長期保管の場合はマニキュア、短期保管の場合はテープを使用してカバースリップをシールします。複合光学顕微鏡でスライドを観察します。携帯電話のアダプターを顕微鏡に取り付けて、スマートフォンで基本的な画像を撮ります。
Androidデバイスの場合は、カメラアプリケーション設定を調整してフラッシュオフし、トップショットを無効にし、明るさと影の自動調整を無効にして、写真の解像度を最大に設定します。携帯電話を取り付けた後、データを取得するための目的のスケールマイクロメータの画像を撮影します。携帯電話のズームを2.5倍に調整し、一貫したピクセルサイズを維持するために一貫性を保ちます。
鞘の中心には、胞子と感染する付着器が最も集中しています。したがって、統計分析のために有意な数を得るために、各シースの9〜12枚の画像を目指します。鞘の感染部位をトリパンブルーで染色した後、スマートフォンとスマートフォンの顕微鏡アダプターを使用して画像化しました。
染色手順の熱と酢酸は、葉の組織を穏やかに柔らかくします。60%グリセロールでの染色後のすすぎは、余分な汚れを取り除くだけでなく、葉によって引き起こされる光散乱を減らし、画質を向上させるのに役立ちます。染色プロトコルからの逸脱は、ここに示すように、最適ではない結果をもたらす可能性があります。
4091野生型に感染したオオムギは、葉鞘組織内の感染した菌糸の存在によって識別される感染細胞を首尾よく産生した。変異型J99A感染の場合、付着器と浸透ペグの開発に成功しましたが、侵襲性菌糸は生成されませんでした。タイミングは感染ベースのアッセイにとって重要です。
適切に熟成された植物と真菌胞子は成功に不可欠です。本研究では、感染構造の有無を調べた。追加の実験は、感染構造の表現型と侵入する菌糸の表現型に関する質問に答えることができます。
私たちの方法論は新しいものではありませんが、より複雑で費用のかかる実験の単純化されたアクセス可能なバージョンです。
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概要
このプロトコルは、イネのばい菌病の初期感染過程を視覚化する簡素化した大麦葉鞘アッセイを概説しています。最小限の試薬と基本的な実験室機器を使用し、高度な顕微鏡を持たない実験室でもアクセスしやすくなっています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 植物病理学
- 真菌遺伝学
- 感染生物学
背景
- このアッセイは真菌感染の初期段階に焦点を当てています。
- 野生型と遺伝子変異型の真菌の研究を可能にします。
- 基本的な実験室用品でこの技術に十分対応できます。
- 成功には大麦の鞘の慎重な取り扱いが不可欠です。
研究目的
- 大麦植物の初期感染段階を視覚化する。
- 真菌変異体の迅速なスクリーニングを促進する。
- 限られたリソースを持つ実験室のためのアクセスしやすい方法を提供する。
使用方法
- 2枚目の葉の段階の大麦植物の選択。
- 大麦植物の切断に滅菌はさみを使用。
- 葉鞘を損傷しないように慎重に扱う。
- 高度な機器なしで感染過程を観察。
主要な結果
- 初期感染段階の成功した視覚化。
- 最小限のリソースでこの技術の有効性の実証。
- 遺伝子変異型の真菌の感染過程への洞察。
- 真菌遺伝学のさらなる分析の可能性。
結論
- このプロトコルは大麦のばい菌病の研究に効果的です。
- 高度な顕微鏡を必要としないコスト効果の高い代替手段を提供します。
- 実験室環境での真菌遺伝学の探索を促進します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid, accessible visualization of early plant-pathogen interactions is critical for de-risking agricultural trait discovery and supporting translational pipeline decisions in crop protection R&D. This simplified barley leaf sheath assay enables high-throughput screening of fungal mutants and infection phenotypes using only basic laboratory infrastructure. The approach supports predictive confidence in target validation and accelerates the triage of candidate resistance traits for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of infection phenotypes in wild type and mutant fungal strains.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a controlled, reproducible system.
- Facilitates rapid hypothesis testing for genetic determinants of pathogenicity and resistance.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, scalable assay for screening fungal mutants and host responses.
- Delivers quantitative, image-based outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Reduces technical barriers for assay adoption and cross-lab reproducibility by using basic equipment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early infection phenotyping with downstream trait validation in disease-relevant crop systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical assessment of resistance mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genes or chemistries for crop protection pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This assay bridges early discovery and lead identification by providing a rapid, reproducible platform for infection phenotype analysis in barley. It is positioned for integration into trait discovery, genetic screening, and translational validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of host-pathogen interactions and mechanistic de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection site measurements for mutant and wild type comparisons.
- Analytics: Enables statistical analysis of infection frequency and structure development using image-based data.
- Translational Research: Facilitates alignment of early phenotypes with preclinical trait validation in relevant crop models.
- Enterprise Reuse: Offers a low-cost, scalable assay adaptable across fungal and plant systems for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes infection phenotyping with minimal resource requirements and high reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for trait advancement and improves capital efficiency in crop protection R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate resistance traits and genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires basic plant pathology expertise and careful handling of delicate leaf sheath tissues.
- Needs only standard laboratory tools, compound microscope, and smartphone imaging adapter.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging parameters for reproducibility.
- Adaptable to other monocot hosts and fungal pathogens with protocol optimization.
- Imaging and staining quality are sensitive to protocol deviations and sample age.
